Summary
ここでは、質量分析ベースのプロテオミクスによる感染時の宿主と病原体の相互作用をプロファイルするプロトコルを提示する。このプロトコルは、標識のない定量を使用して、1回の実験で、宿主(例えばマクロファージ)と病原体(例えば クリプトコッカス・ネオフォルマン)の両方のタンパク質の存在量の変化を測定する。
Abstract
質量分析(MS)ベースの定量プロテオミクスの技術的成果は、様々な条件下で生物のグローバルプロテオームを分析するための多くの未知の道を開きます。この強力な戦略は、微生物病原体と所望の宿主との相互作用に適用され、感染に対する両方の視点を包括的に特徴付ける。本明細書において、ワークフローは、不滅のマクロファージ細胞の存在下で、致命的な疾患クリプトコッカス症の原因物質である真菌性の栄養性細胞内病原体である クリプトコッカス・ネオフォルマンの 感染者のラベルフリー定量(LFQ)について説明する。このプロトコルは、単一の実験で病原体細胞と哺乳類細胞の両方に適切なタンパク質調製技術を詳述し、液体クロマトグラフィー(LC)-MS/MS分析のための適切なペプチドサブミッションをもたらす。LFQの高スループットの一般的な性質は、タンパク質の同定と定量の広いダイナミックレンジだけでなく、任意の宿主病原体感染設定への転写性を可能にし、極度の感受性を維持する。この方法は、感染模倣条件内の病原体の広範で公平なタンパク質豊富プロファイルをカタログ化するために最適化されています。具体的には、ここで示す方法は、毒性に必要なタンパク質産生などの C.ネオフォルマン病 原発病に関する重要な情報を提供し、微生物の侵入に応答する重要な宿主タンパク質を特定する。
Introduction
侵襲性真菌感染症の有病率は非常に増加しており、容認できないほど高い死亡率と相関しており、免疫不全素因を有する個体で最も一般的に報告される1。クリプトコッカス・ネオフォーマンは、宿主マクロファージ細胞内で細胞内生存が可能な悪名高い日和見真菌病原体である。不十分な抗真菌介入は、真菌の播種およびクリプトコッカス髄膜炎および髄膜脳炎の生命を脅かす症状をもたらす 2,3.免疫不全状態の世界的な増加は、C.ネオフォーマンを含む多くの真菌種が4、5、6に対する耐性をますます進化させた抗真菌剤の使用の並行増加を要求している。したがって、宿主の防御応答と微生物の病因に関する重要な生物学的質問に答えるために、堅牢で効率的な技術を実装することが不可欠です。
強力な計算およびバイオインフォマティクスパイプラインの生成を含む質量分析(MS)の技術進歩の新時代は、宿主病原体研究7,8の大規模分析のための統合的ビジョンの基礎を提供する。従来の病原体主導のプロテオミクス解析は、タンパク質相関プロファイリング、プロテオミクスと結合したアフィニティークロマトグラフィー、およびインタークトミクス9などの包括的な方法論を含む、宿主または病原体の観点から感染の見解を一般的にプロファイルする。ホストシステムにおける危険病原体の病原性に関する調査は、非常に臨床的に重要である。しかし、単一の実験での二重遠近解析の適用は、以前は達成不可能と考えられていました。例えば、感染に対する病原体の視点は、多くの場合、低い豊富な真菌タンパク質の検出のための感度を低下させる豊富な宿主タンパク質によって圧倒される7。さらに、高いサンプルの複雑さは、単一の実験システムで調査するために多くのターゲットを招き、特定の病原体タンパク質の作用機序を解明する挑戦を証明する。
ボトムアッププロテオミクスは、管理しやすいサンプル調製を可能にする一般的なMS技術であり、その後に液体クロマトグラフィー分離、同定、定量をMS10、11で配列特異的酵素消化してペプチドを生成する。ここでは、感染に基づくプロテオームまたは「感染性」の公平なカバレッジを達成することを目的としたデータ依存的な取得戦略を示す方法を提示する。具体的には、ラベルフリー定量(LFQ)は、複数のプロテオーム間でタンパク質レベル変化を確実かつ正確に同定するための化学的または代謝ラベルへの依存性を低下させ、サンプル処理および処理ステップ12、13を低減する。この普遍的なアプリケーションは、任意の予想されるタンパク質産生とは無関係に細胞内の特定の瞬間に産生されたタンパク質を尋問します。したがって、感染に不可欠な新しい洞察が発見される可能性があります。
本明細書に記載されているワークフローは、宿主免疫細胞を用いた感染模倣状態の間の C.ネオフォーマン のタンパク質レベル変化を探索するために最適化される(図1)。このアプローチは、細胞型の分離と分離に頼るのではなく、宿主と病原体プロテオームを一緒に抽出し、生物特異的な2つのデータベースを用いた生物情報分離を利用して、種特異的タンパク質産生を区別する。この方法は、同位体ベースのラベリング研究または分画に必要な余分なコストのかかる準備ステップなしで処理されるサンプルの無制限の数のための利点を提供します。さらに、このワークフローは、宿主の免疫細胞を標的化し感染させることができる幅広い真菌および細菌病原体に伝達可能な最適化されたタンパク質抽出プロトコルをサポートします。全体として、このプロトコルは、高分解能MSのための公平なタンパク質抽出とサンプル処理を完了するための手順を概説し、続いて、感染に有意な真菌タンパク質に関する豊富な知識を提供し、宿主防御応答の包括的なプロファイリングを行うことができるデータおよび統計分析を行う。
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Protocol
BALB/cマウスに由来するマクロファージの不死化ラインは、ゲルフ大学動物利用プロトコル4193によって承認された次のプロトコルに使用された。特に、マウスの他の株または不死化細胞の他の供給源は、詳細なパラメータを最適化するのに十分なテストで概説されたプロトコルに適用することができる。次のプロトコルは、マクロファージ細胞の凍結バイアルで始まるステップをナビゲートします。細胞は10%FBS(ウシ胎児血清)、1%L-グルタミンおよび5%ペン/ストレップ(ペニシリンストレプトマイシン)混合物DMEM(ダルベックコの修飾イーグル培地)および20%DMSO(ジメチルスルホキシド)に保存されます。
1. C.ネオフォーマンの培養
- グリセロールストックを用いて、ストリークワイルドタイプ C.ネオフォルマン 株(H99)を酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)寒天プレートに単一コロニーを単一のコロニーを分離する。
- 静電気インキュベーターで37°Cで16時間インキュベートする。
- 野生型 C.ネオフォーマン 株の単一コロニーを、緩くキャップされた10 mL試験管のYPDブロスの5mLで選択します。4倍にして実行します。
- 200rpmで振るインキュベーターで37°Cで16時間一晩インキュベートする。
- 翌日サブカルチャーは1:100希釈で一晩培養し、3 mL YPDスープにする。
- 真菌培養の光学密度(OD600nm)値を測定し、中対数相を決定します。分光光度計に応じて 、C.ネオフォーマンズ 野生型株は、一般的に1.0〜1.5の範囲の一般的なOD600nm 値を有するYPDの6〜8時間のインキュベーションに続く中対数相に達する。
- 細胞が中対数相に達したら、真菌細胞懸濁液の10 μLアリコートをクリーンな1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに取り込み、滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:100を希釈します。ヘモサイトメーターを使用して細胞の数を数えます。
2. マクロファージ細胞の培養
注:細胞培養作業の前に作業環境が滅菌されていることを確認してください。
- 細胞培養培地の調製
- 抗生物質補充培地:10%FBS(牛血清)、1%L-グルタミン、5%ペン/ストレップ(ペニシリンストレプトマイシン)混合物をDMEM(ダルベックコの改変イーグル培地)に加えます。0.2 μmの完全なフィルターシステムを通してフィルター媒体を4 °Cで保存する。
- 抗生物質を含まない媒体: 同一のプロトコルに従うが、ペン/ストレップの混合物を省略する。
- マクロファージ細胞の播種
注:抗生物質補充培地(2.1.1.)は、細胞培養作業の前に37°Cに温める必要があります。- 37°Cビーズ浴中のマクロファージ細胞のバイアルを素早く解凍する。
- 1 mL抗生物質補充培地中の細胞を再懸濁することにより凍結溶液の細胞を洗浄する。
注:粗いピペットによる細胞がライスしないようにするために特別な予防措置が必要です。 - 再懸濁した細胞を無菌15 mLチューブに移す。
- ペレット細胞は、400×gで5分間室温で遠心分離した。
- 慎重に血清ピペットまたは真空吸引器で上清を除去します。
- 10 mLの抗生物質補充培地でペレットを穏やかに再懸濁する。
- 60 x 15 mmの細胞培養処理皿に細胞を穏やかに再懸濁させた。
- 一晩5%CO2で37°Cでインキュベート皿。
- マクロファージ細胞の初期通過
注:冷凍セルストックは、通常、バイアルあたり5〜1000万セル(約1mL)を含みます。その後の日に、播種プロトコルを生き延びたマクロファージ細胞は、細胞培養皿の底部に付着し、通過の準備が整います。- 温かい抗生物質補充培地(ステップ2.1.1)〜細胞培養作業の前に37°C。細胞培養作業の前に作業環境を滅菌してください。軽い顕微鏡を使って細胞を視覚化し、細胞が付着し、健康であることを確認します。
- 血清ピペットまたは真空吸引器を使用して、皿から細胞培養培地を除去します。
- 60 x 15 mm 皿に滅菌室温 PBS (リン酸緩衝生理食塩水) の 5-7 mL を静かに加えます。
- 皿を軽く傾けて、付着した細胞を洗います。
- 血清ピペットまたは真空吸引器を使用してPBSを除去します。
- 1 mLの冷たいPBS(4°Cで保存)を細胞に加え、チルト皿を傾けてすべての細胞にPBSを分配し、室温で1分間座るようにします。
- 皿の穏やかなタップ、細胞に対する冷たいPBSのピペット、または細胞スクレーパーを使用して細胞を放出する。
- 9 mLの抗生物質補充培地を皿に加えます。
- 新しい60 x 15 mm皿に、新鮮な抗生物質補充培地9 mLと元の皿から再懸濁細胞1 mLを加えます。
- 所望のパッジングプレートの数が満たされると、元の皿から再懸濁された細胞を捨てることができます。
- 上記の設定で新しい料理をインキュベートします(ステップ2.2.8)。
- 細胞が合流率70~80%に達した場合に、その後のパスを行う(使用する細胞株と培地に応じて約2日毎に)。
注:マクロファージ細胞は、感染実験の前に最低5回通過する必要があります。細胞株に応じて、感染実験は25〜30の通路で行われるべきである。25〜30通過後、細胞を凍結または廃棄する必要があります。2.4または2.5の項は、実験計画に基づいて選択することができる。セクション2.4は、以下のセクションで使用されます。
- 感染前のマクロファージ細胞の播種
- パス処理プロトコルのステップ 2.3.1 ~ 2.3.7 を実行します。
- ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して、細胞密度(細胞/mL)を決定します。
- 0.3 x 106マクロ ファージ細胞を6ウェル細胞培養プレートの単一ウェルに移します。
- 抗生物質補充培地を使用して1 mLに井戸の総体積を調整する(ステップ2.1.1)。
- 8つのウェルが満たされるまで、ステップ2.4.3と2.4.4を繰り返します(4つのウェルは2つの別々のプレートで満たされています)。
- 必要に応じて、残りの2つの井戸に1 mLの室温PBSを充填し、インキュベーション中の水分レベルを維持します。
- 細胞が感染前の2dのステップ2.2.8で述べたインキュベーション条件下で成長することを可能にする。
- 感染の日にマクロファージ細胞を播種
- パス処理プロトコルのステップ 2.3.1 ~ 2.3.7 を実行します。
- ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して、細胞密度(細胞/mL)を決定します。
- 種子 1.2 x 106 マクロファージ細胞を、6 ウェル細胞培養プレートの単一ウェルに入る。
- 抗生物質補充培地(2.1.1)を使用して1 mLに井戸の総量を調整します。
- 8つのウェルが満たされるまで2.4.3と2.4.4を繰り返します(4つのウェルが2つの別々のプレートに充填されています)。
- 必要に応じて、残りの2つの井戸に1 mLの室温PBSを充填し、インキュベーション中の水分レベルを維持します。
- ステップ2.2.8で述べた条件で細胞を3時間インキュベートし、細胞がウェルに付着することを可能にする。
3. C. ネオフォーマンによるマクロファージ細胞の感染
注:合流率70~80%に達すると、1ウェルあたり約1.2 x 10個の マクロファージ細胞が存在します。100:1の望ましい多重度の感染(MOI)を達成するために、1.2 x 108真菌 細胞が各反応に必要とされる。培養は、生物学的四重体に従って設定されなければならない。
免責事項:100:1のMOIは、私たちの研究グループで望ましい結果を達成し、読者への提案として意味されています。より感染性の高い C.ネオフォーマン 株または弾力性の低いマクロファージ細胞株に対しては、より低いMOIが必要とされる可能性がある。感染の検証(セクション3.5)は、特定の C.ネオフォーマン のための理想的なMOIを決定するために使用することができます – マクロファージの組み合わせ。
- 真菌細胞の調製
- C. ネオフォーマンの成長のためのステップ 1.
- 1,500 x g で細胞を回収し、遠心分離機を10分間回収し、無菌室温PBSでペレットを静かに洗浄し、合計3回の洗浄を繰り返します。
- 抗生物質を含まない細胞培養培地中の細胞を再懸濁(ステップ2.1.2)し、1.2 x108 細胞/mLの濃度を達成した。
- マクロファージ細胞の作製
- 細胞が70-80%の合流に達したことを確認するために6ウェルプレートの各井戸を視覚化する。あるいは、細胞は、ウェル当たり約1.2 x106 マクロファージ細胞を達成するために測定することができる。
- 手順 2.3.1 ~ 2.3.4 に従います。
- C.ネオフォーマンとマクロファージ細胞の共培養
- セクション3.2で調製したマクロファージ細胞を含む4つのウェルに再懸濁 したC.ネオフォーマン細胞 (ステップ3.1.3)の1 mLを加える。
注: 実験を開始する前に、必要なプレートの数を計算する必要があります。1 mLの抗生物質を含まない培地(ステップ2.1.2)を空の井戸に加えます。 - 3時間の間、リストされた条件(ステップ2.2.8)の下で細胞をインキュベートすることを許可する。
- 細胞培養液をセロカルピペットまたは真空吸引器でプレートから除去します。
- 滅菌室温PBSを1 mLと静かに加えます。
- プレートを軽く傾けて、非結合または非貪食細胞 C.ネオフォルマン細胞を洗浄する 。
- 血清ピペットまたは真空吸引器を使用してPBSを除去し、合計3回のスケを繰り返す。3.3.4 から 3.3.5 までさらに 2 回繰り返します。
- セクション3.2で調製したマクロファージ細胞を含む4つのウェルに再懸濁 したC.ネオフォーマン細胞 (ステップ3.1.3)の1 mLを加える。
- 感染していないマクロファージ
- 同様に、マクロファージのみのサンプルとして機能する6ウェルプレートの4つのウェルを使用します。これらのウェルに抗生物質を含まない培地(ステップ2.1.2)を1 mL加えます。
- ステップ 3.3.2 ~ 3.3.6 を繰り返します。
- 感染の検証
注意:細胞傷害性アッセイを用いて、感染能力を測定することができます。以下のプロトコルは、LDH(乳酸脱水素酵素)放出を測定するための細胞毒性製品の適用を強調する。他の細胞傷害性産物も使用することができる。- マクロファージ細胞の C.ネオフォーマンス 感染の調製
- 手順 1、2、および 3 を繰り返します (最大 3.5)。LDHアッセイは、好ましい場合は三重で行うことができる。
- ステップ3.3.6に続いて、6ウェルプレートの各ウェルに抗生物質を含まない培地(2.1.2)を1mL加えます。
- 3つの井戸と3nウェルが満たされるまで、ステップ2.4.3と2.4.4を繰り返します(nは測定された時間ポイント数です)。
- ステップ2.2.8でリストされた条件下で細胞をインキュベートする。
- 選択した時点(例えば、1、3、6、12、24時間)は、メーカーの指示に従ってLDHリリースの測定のための上清を収集する
- 同時に、未感染マクロファージ細胞は、最大の細胞毒性のために決定された値にリセドされるであろう。
- 細胞毒性を次のように計算します。
- マクロファージ細胞の C.ネオフォーマンス 感染の調製
4. サンプルコレクション
- 共培養と感染していないマクロファージコレクション
- 細胞に1mLの冷たいPBSを加え(3.3.6と3.4.2から)、室温で1分間座るようにします。
- プレートを穏やかに叩いたり、冷たいPBSを細胞に対して穏やかにピペットしてプレートから細胞を放出します。
注:細胞のスクレーパーは、これが細胞のリシスを引き起こす可能性がありますので避けるべきです。 - ピペットは細胞を15 mLチューブに再懸濁した。
- 遠心分離機細胞を室温で5分間400×gで、上清を取り除きます。
- (ステップ5で詳述した)細胞を直ちに処理するか、液体窒素で凍結し、後で処理するために-80°Cで保存した。
5. 細胞質プロテオーム
注:分析された細胞タイプに対して十分なリシスを最適化する必要があります(すなわち、サイクルと振幅の量は、セルペレットのサイズとプローブ超音波処理器モデルの電力割合によって異なります)。
- 感染したマクロファージ細胞のライシス
- ペレット化した細胞(ステップ4.1.5)を、溶解したばかりのプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットからなる100 mM Tris-HCl(pH 8.5)の300 μLで再懸濁します。
注:1つのプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットは、実験を開始する前に氷冷100 mM Tris-HCl(pH 8.5)の10 mLに追加されます。 - 氷浴中の超音波処理細胞を30sオンと30sオフの15サイクルでプローブし、細胞をライスする。
- 遠心分離機細胞は400xgで30sの短時間で、ペレットを形成しないように注意し、チューブの側面の液体を取り除き、その後2mL Lo-Bindマイクロ遠心分離チューブにサンプルを移す。
- 2%の最終濃度に20%のSDSの1:10の容積を加える。
- 1 Mジチオスレイトール(DTT)の1:100ボリュームを最終濃度の10mMに加え、ピペット処理でサンプルを十分に混ぜ、95°Cの熱加熱ブロックにインキュベーションを行い、800rpmの攪拌で10分間インキュベーションします。次に、室温まで冷却する(冷却は氷上で行われてもよい)。
- 0.55 Mのヨウドアセトアミド(IAA)の1:10容量を加え、55mMの最終濃度を得て、ピペット処理でサンプルを十分に混合します。暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。
- 100%アセトンを加え、80%アセトンの最終濃度を得て、サンプルを-20°Cで一晩保存してタンパク質を沈殿させます。
- ペレット化した細胞(ステップ4.1.5)を、溶解したばかりのプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットからなる100 mM Tris-HCl(pH 8.5)の300 μLで再懸濁します。
- タンパク質消化
- 翌日、10,000xgおよび4°Cで10分間の遠心分離により沈殿ペレットを回収する。 上清を捨て、80%のアセトンの500 μLでペレットを洗浄します。合計2回の打ち上がりで繰り返します。空気乾燥ペレットは、洗水後室温で行う。
- 8 M尿素/40 mM HEPESの100 μLでタンパク質ペレットを再溶解し、氷水浴中の完全な可溶化、渦または超音波処理を30 sオンおよび30 s offの15サイクルで確保します。
注:尿素/HEPESの体積の調整は、沈殿細胞ペレットのサイズに基づいて決定され、変化が発生した場合は、すべての下流の体積を適切に調整する必要があります。 - メーカーの指示に従ってタンパク質アッセイ(例えばBCAタンパク質アッセイ)を使用してタンパク質濃度を定量化し、8 M尿素/40 mM HEPESによるブランク正規化によるバックグラウンド測定を調整します。
- 50 mM重炭酸アンモニウムの300 μLを加える 2 M 尿素の最終濃度を得る。
注:下流の測定のためにタンパク質濃度を正常化する機会は、タンパク質の100 μgを消化し、残りの未消化試料を液体窒素中のフラッシュ凍結によって保存し、短期は-20°C、または-80°Cで長期間保存することを提案します。 - トリプシン/Lys-Cプロテアーゼ混合物の酵素対タンパク質比を氷上に2:50(v/w)加え、チューブを軽くタップして混合し、室温で一晩インキュベートします。
- インキュベーションに続いて、1:10体積停止溶液(20%アセトニトリル、6%トリフルオロ酢酸)と遠心分離機サンプルを室温で5分間10,000 x g で加えて消化を停止します。
- 上清(消化されたペプチドで構成される)を収集し、ペレット化された破片または沈殿物を捨てます。
- ペプチド脱塩
- 100%アセトニトリルと遠心分離機の100 μLを100 μLピペットチップに3層C18樹脂で構成するC18ストップアンドゴー抽出(STAGE)チップを2分間1,000 x g で有効にします。
- C18 STAGEチップは、バッファーB(80%(v/v)アセトニトリル、0.5%(v/v)酢酸、遠心分離機を1,000 x g で2分間加えて平衡化します。
- C18 STAGEチップを200 μLのバッファーA(2%(v/v)アセトニトリル、0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸、0.5%(v/v)酢酸、遠心分離機を1,000 x g で3〜5分間加えて平衡化します。
- 3~5分間、またはサンプルがスピンカラムを通過するまで、C18 STAGEチップと遠心分離機に約50μgの消化サンプルを1,000 x g で加えます。フラッシュは、残りの消化されたサンプルを液体窒素で凍結し、必要になるまで-20°Cで保存します。
- C18 STAGEチップを200 μLのバッファーAと遠心分離機で1,000 x g で3〜5分間洗浄します。
- C18 STAGEチップに50 μLバッファBを加え、遠心分離機を500 x g で2分間追加します。0.2 mL PCRチューブで溶出したペプチドを収集します。
- 溶出したペプチドを真空遠心分離機で30〜40分間最高速度で乾燥させます。完全に乾燥した試料は、室温で、または-20°Cで処理されるまで保存することができる。
注:乾燥および脱塩されたペプチドは、処理のための質量分析設備への適切なサンプル提出であり、周囲温度で出荷される可能性があります。
6. 質量分析
- 10 μL バッファー A のペプチドを再構成し、MS カラムに約 1.5 ~ 3 μg のペプチドを注入するために必要な濃度を測定します。サンプルの量はインストルメンテーションによって異なります。
- アセトニトリルの事前定義勾配を使用する(約5〜60%)0.5%の酢酸で所望の時間(例えば、2時間)で、高速液体クロマトグラフィーによってペプチドを分離し、続いて質量分析計にエレクトロスプレーイオン化を行った。
- データ依存型取得モード(m/z 300~1650)で高解像度質量分析計を使用してMSスキャンを取得します。
注: グラデーションのパーセンテージと長さは、実験とユーザーによって決定されます。精密な質量分析計の設定は、計測器、実験、ユーザー設定によって異なります。
7. データ分析
注: MS データは、多数のバイオインフォマティクス パイプラインで処理できます。このプロトコルでは、一般に公開されているMaxQuantおよびPerseusプラットフォームを使用した処理について説明しますが、個々のユーザーが分析、好み、使用に適したバイオインフォマティクスツールを評価することを推奨します。
- MaxQuantソフトウェアを使用して、MS計測器から直接未処理のデータファイルをロードします。修飾されたMaxQuant検索パラメータの下でタンパク質を識別します。1%の偽発見率のための標的おとりアプローチを用いてタンパク質同定に必要な2つのユニークなペプチドの最小値は、ラン間のマッチングでラベルフリー定量を実施し、UniProtデータベースから得られた有機物FASTAファイル(すなわち、 クリプトコッカス・ネオフォーマンズ H99、Mus musculus)を組み込み、アンドロメド検索エンジンで現在のペプチドを同定し定量化する。詳細なチュートリアルについては、公開 MaxQuant オンライン ツールを参照してください ( 資料一覧を参照)。
- MaxQuant 出力ファイル (「タンパク質グループ.txt')をペルセウスにアップロードします。
- 潜在的な偽陽性および汚染物質を含む行をフィルタリングし、サイトペプチドによって「カテゴリ列に基づいて行をフィルタリングする」のみで改変します。
- ログ2 スケールでデータ値を変換します。
- 行にカテゴリ注釈を付けることで、データ セット グループを作成します。
- 有効な値でデータセットをフィルター処理し、タンパク質検出のカットオフを定義します。
注: 厳格で堅牢な分析の場合は、50%の識別率を推奨します。たとえば、4 つの反復が処理された場合、3 つの有効な値の最小値が選択されます。 - 必要に応じて、正規分布の欠損値を置き換えてデータをインプクテートします。
注: 入力された値は正規分布に基づいて最適化され、典型的な豊富な測定値をシミュレートするために'NaN'のプレースホルダを置き換えるためにランダムLFQ強度を提供します。この偽装は、定量化可能なデータを必要とするダウンストリーム統計分析のためのプラットフォームを提供します。 - タンパク質の行に注釈を追加します (例: タンパク質名, 遺伝子オントロジー用語).
注:生成されたこのPerseusワークフローは、さらなるバイオインフォマティック処理、統計解析、データ可視化のための堅牢なフレームワークとなり、詳細なチュートリアルについては、パブリックPerseusオンラインツールを参照してください(資料表を参照)。
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Representative Results
上記で概説したプロトコルは、真菌病原体、C.ネオフォーマンおよび宿主であるマクロファージ細胞の両方から得られたタンパク質を単一の実験で同定し、定量化する。共培養後、細胞は、各種に特異的なペプチドプロファイルに基づいて、一緒に収集および処理され、生物的に分離される。これは、感染時の宿主病原体関係の相互作用を定義するための強力なアプローチである。実験から同定されるタンパク質の数は、出発物質、サンプル調製、勾配長、MS計測、バイオインフォマティクスワークフローによって異なります。本明細書に記載されたプロトコルを用いて、我々は通常、1,500 C. ネオフォーマンタンパク質および6,500個の宿主タンパク質を用いて実験から約8,000個のタンパク質を同定する。データセットの処理に続いて、分析を推進する重要な要因を観察するための主成分分析(PCA)プロットを生成します(図2A)。ここでは、実験計画(成分1、79.8%)から予想されるように、データ間の分離の最大の成分が感染しているのと非感染サンプルが観測され、サンプルの第2の特徴は生物学的変動性(成分2、5.7%)である。次に、ユークリッド距離による階層クラスタリングと組み合わせたピアソン相関をサンプルをグループ化し、反復の変動性を定量化する(図2B)。我々の分析では、感染したサンプルと非感染サンプルの明確なクラスタリングを観察し、再現性を95~96%に再現し、複製物の再現性を表しています。最後に、Benjamini-Hochberg偽発見率(FDR)(p-value 0.05)を使用して複数仮説テストを修正した学生のt検定 ≤を実行します。FDR = 0.01;s0 = 1) 非感染コントロールと比較して感染中に存在量が有意に異なるタンパク質を同定する(図2C)。ここでは、感染時に有意な増加を示す86と31の86の宿主タンパク質を含む、豊富な有意な変化を有する760タンパク質を同定する。特に、感染時に予想されるように、真菌タンパク質の豊富さの有意な増加も観察する。これらのデータを用いて、ネットワークマッピング、インシリコ特性解析、フォローアップ実験を含む後続の分析が行われ、データを検証し、病原性に対する宿主応答を支える分子メカニズムを探求する。
図1: C. ネオフォーマンに感染したマクロファージの分析のための質量分析法ベースのプロテオミクスワークフロー .ワークフローは、C.ネオフォーマンまたは非感染コントロールに感染したマクロファージのコレクションから始まります。タンパク質は機械的および化学的破壊によって抽出され、その後、還元およびアルキル化、アセトン沈殿、酵素消化が行なわれている。ペプチドは、C18 STAGEチップ上で精製され、高速液体クロマトグラフィーで分離され、エレクトロスプレーイオン化を行い、高解像度の質量分析計で測定されます。データは、一般に公開されているバイオインフォマティクスプラットフォーム、MaxQuant(アンドロメダ付き)およびペルセウス14、15、16で処理、分析、視覚化されます。生物学的四重で行われた実験。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マクロファージ細胞のC.ネオフォーマン感染の代表的データ。(A)主成分分析は、感染したマクロファージと非感染マクロファージ(成分1、79.8%)と生物学的複製物(成分2、5.7%)のクラスタリングの区別を示す。(B) ユークリッド距離による階層クラスタリングによってプロットされたピアソン相関のヒートマップ(感染と非感染)のクラスタリングを示し、再現性(>95%)を再現する。(C) 同定されたタンパク質の火山プロット。青 = 豊富な有意な変化を有する真菌タンパク質;黒 = 豊富な大きな変化を有するマクロファージタンパク質。学生のt-test(p-値≤ 0.05), FDR = 0.01;s0 = 1.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルの重要なステップには、マクロファージ細胞の調製および細胞への中断を最小限に抑えたタンパク質処理のための共培養サンプルの収集が含まれる。採取前に細胞の不必要なリシスを防ぐために、洗浄、接種、および接着性マクロファージ細胞を穏やかに慎重に除去する手順を実行することが重要です。実験に対して正しいMOIを確立することは、過度に高いMOIを接種すると、急速なマクロファージ細胞死を引き起こし、MS.のサンプルの収集と処理が困難になる可能性もあるので、MOI数が少ないと貪食細胞が少なくなり、生物学的系における真菌タンパク質の検出が制限される可能性があります。このような制限を克服するために、細胞死アッセイ(例えば、LDH定量)でサポートされる様々なMOIを用いて試験実験を行い、宿主応答を開始するが、収集前に宿主細胞を殺さない真菌細胞の数を定義することを推奨します。実験では、感染に関連する真菌タンパク質の同定を目指し、高いMOI(100:1)を必要とし、豊富な宿主タンパク質の中から真菌タンパク質を適切に検出することを目指しています。実験全体を行う前に、マクロファージ細胞傷害アッセイを日常的に行い、宿主細胞死に対するMOIの影響を評価する。C.ネオフォーマン細胞のマクロファージを有する培養のタイミングは、真菌細胞が大きな多糖カプセルを有する可能性があるため、マクロファージは巻き込みのためのより多くの時間を必要とするため、また重要である。我々は、この時点で真菌プロテオームの良好なカバレッジを発見し、ホスト応答の「スナップショット」を提供するために、概説された実験のために3時間の共培養時間を使用することを選択します。しかし、研究者は、より早く、後の時点を探索し、タイミングが真菌および宿主タンパク質産生にどのような影響を与えるかを観察したいと考えるかもしれません。あるいは、オプホ化のためのマクロファージのプライミングが行われ、貪食プロセス17,18を支援する。
サンプル採取のために、サンプルが液体窒素ですぐにフラッシュ凍結を処理されていない場合、サンプル中に存在するプロテアーゼによるタンパク質の望ましくない分解を防ぐのに役立ちます。また、MSベースのプロテオミクス解析では、実験を始める前にニトリル手袋、実験室用コート、70%エタノールで表面を洗浄することにより、ほこりやケラチン(皮膚細胞や毛細胞など)からの汚染の可能性を制限する必要があります。さらに、上記のプロトコルは、説明した共培養サンプルセットに固有であるが、タンパク質抽出ワークフローの最適化のために、必要に応じて19,20に変更することができる。特定の細胞タイプに対してワークフローを変更し最適化する機会としては、選択した機械的および化学的破壊技術、酵素消化の持続時間と温度、サンプルの分離などがあります。例えば、C.ネオフォーマン細胞のリシスは、典型的には機械的なビーズの鼓動によって行われる。しかし、我々は、プローブ超音波処理に続く増加したプロテオームのカバレッジを観察し、したがって、感染細胞19、21、22の機械的破壊のためにそれをお勧めします。例えば、高pH分画またはサイズ排除クロマトグラフィーによってペプチドサンプルをアリコートに分画すると、サンプルの複雑さが減少し、質量分析計9上の被覆深度が向上する可能性がある。さらに、約8,000個の宿主および真菌タンパク質を同定するための被覆深度を達成するためには、高解像度の質量分析システム(例えば、QExactive Exploris、フュージョンルモス、timsTOF Pro)が必要です。
感染時のタンパク質レベルの変化を定量化するためのLFQの使用は、MSベースのプロテオミクス12に対して信頼性が高く、費用対効果の高いアプローチである。これは、追加のサンプル処理ステップを必要とせずに、相対的な豊富さによってタンパク質の定量を可能にします。また、実験終了後に解析を行い、ユニバーサルアプリケーションや柔軟な学習設計に貸し出します。しかし、LFQの制限には、サンプルを順次実行する必要があり、組み合わせることができないため、計測時間の増加、サンプル間の比較性が困難であり、欠損値を置き換える代用の必要性が高い23が含まれます。タンパク質の豊富さを定量化するための代替アプローチとしては、代謝(例えば、細胞培養におけるアミノ酸の安定同位体標識)および化学的(タンデム質量タグ)標識技術が挙げられる。しかし、このようなアプローチは、追加のサンプル処理および処理ステップを必要とし、ウェットラボ実験の複雑さと時間を増加させ、また、固定実験計画を必要とする。提案された実験に最適な定量化方法を選択するには、サンプルの設計と比較可能性、ウェットラボの複雑さとデータ分析、および計測時間の可用性とコストを考慮する必要があります。
提示されるプロトコルの新しいことは、1回の実験で宿主と病原体の両方の視点からプロテオームの変化を定義する能力である。両方のプロテオームの範囲の深さは、病原体が感染を開始する方法とホストが防御にどのように反応するかについての新しい洞察を可能にします。特に、このアプローチは細胞全体の感染に焦点を当てています。しかしながら、サブプロテオームまたは感染に対する区画化応答を定義する機会は、空間的局在化技術(例えば、遠心分離、濃縮、標識)26,27との組み合わせを通じて存在する。ここでは、マクロファージと真菌病原体C.ネオフォーマンとの相互作用について詳しく説明します。しかし、このアプローチは普遍的であり、多様な生物学的システム間の相互作用に適用することができます。例えば、最近、同様のワークフローを使用して、眼角膜炎28、29、30のマウスモデルに由来する好中球の一般的および部位特異的な応答を明らかにした。さらに、本プロトコルから生成された感染性データセットは、生体外プロテオームおよび病原体の分泌物プロファイリングと統合して、宿主細胞の存在下で変化した存在量のタンパク質を検出することができる。このようなタンパク質は、感染関連タンパク質と呼ばれ、経時的な調節、局在化、および宿主との直接的なタンパク質タンパク質相互作用を含む、さらなる特徴付けのための既知および新しい毒性因子の多くを提供する。全体として、概説されたMSベースのプロテオミクスワークフローは、普遍性と理解が一般的に利用できない単一の実験で宿主と病原体の複雑な関係を調査する新しい機会を提供します。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、バイオインフォマティクス・ソリューションズ社のジョナサン・クリーガー博士が代表的な実験のために質量分析計を操作してくれたことに感謝し、Geddes-McAlisterグループのメンバーが実験的なセットアップと原稿フィードバックを支援してくれたことに感謝する。著者らは、バンティング研究財団-ジャリスロウスキー・フェローシップ・ディスカバリー賞、ニューフロンティア研究基金-探査(NFRFE-2019-00425)、.M カナダイノベーション財団(JELF 38798)、NsERCカナダ大学院奨学金奨学金、オンタリオ州卒業奨学金B..B
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
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