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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/61881
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per profilare l'interazione tra ospite e agente patogeno durante l'infezione da proteomica a base di spettrometria di massa. Questo protocollo utilizza la quantificazione senza etichette per misurare i cambiamenti nell'abbondanza proteica sia dell'ospite (ad esempio, macrofagi) che dell'agente patogeno (ad esempio, Cryptococcus neoformans)in un singolo esperimento.

Abstract

I risultati tecnologici della proteomica quantitativa basata sulla spettrometria di massa (MS) aprono molte strade sconosciute per analizzare il proteoma globale di un organismo in condizioni variabili. Questa potente strategia applicata alle interazioni degli agenti patogeni microbici con l'ospite desiderato caratterizza in modo completo entrambe le prospettive verso l'infezione. Nel presente documento, il flusso di lavoro descrive la quantificazione senza etichette (LFQ) dell'infettivoma dei neoformani Cryptococcus, un agente patogeno intracellulare facultativo fungino che è l'agente causale della criptococcosi della malattia mortale, in presenza di cellule macrofagi immortalate. Il protocollo descrive in dettaglio le corrette tecniche di preparazione delle proteine sia per le cellule patogene che per le cellule di mammifero all'interno di un singolo esperimento, con conseguente adeguata sottomissione peptidica per l'analisi liquido-cromatografia (LC)-MS/MS. L'elevata produttività della natura generica dell'LFQ consente un'ampia gamma dinamica di identificazione e quantificazione delle proteine, nonché trasferibilità a qualsiasi impostazione di infezione patogena ospite, mantenendo un'estrema sensibilità. Il metodo è ottimizzato per catalogare ampi profili di abbondanza proteica imparziali di un agente patogeno in condizioni di imitazione delle infezioni. In particolare, il metodo qui dimostrato fornisce informazioni essenziali sulla patogenesi c. neoformans, come la produzione proteica necessaria per la virulenza e identifica le proteine ospiti critiche che rispondono all'invasione microbica.

Introduction

La prevalenza di infezioni fungine invasive è in costante aumento ed è correlata a tassi di mortalità inaccettabilmente elevati, più comunemente riportati in individui con predisposizioni immunodifese1. Cryptococcus neoformans è un noto agente patogeno fungino opportunistico in grado di sopravvivere intracellulare all'interno delle cellule macrofagi ospiti. Un intervento antimicotico inadeguato si traduce in diffusione fungina e manifestazioni potenzialmente letali di meningite criptococcica e meningoencefalite2,3. L'aumento globale dello status immunocomprotologico ha richiesto un parallelo aumento dell'uso di agenti antifungini, in cui molte specie fungine, tra cui c. neoformani, hanno sempre più evoluto la resistenza verso4,5,6. Pertanto, è imperativo implementare tecnologie solide ed efficienti per rispondere a domande biologiche vitali riguardanti la risposta alla difesa dell'ospite e la patogenesi microbica.

La nuova era del progresso tecnologico nella spettrometria di massa (SM), compresa la generazione di potenti condotte computazionali e bioinformatiche, fornisce le basi per una visione integrativa per l'analisi su larga scala della ricerca ospite-patogeno7,8. L'analisi proteomica convenzionale basata sulla patogenesi profila comunemente la vista dell'infezione dal punto di vista dell'ospite o dell'agente patogeno, incluse metodologie complete come il profilo di correlazione proteica, la cromatografia di affinità combinata con la proteomica e l'interaomica9. Le indagini sulla virulenza di agenti patogeni pericolosi in un sistema ospite sono di immensa importanza clinica; tuttavia, l'applicazione di un'analisi duale prospettica in un singolo esperimento era precedentemente considerata irraggiungibile. Ad esempio, la prospettiva dell'agente patogeno verso l'infezione è spesso sopraffatta da proteine ospiti altamente abbondanti con conseguente ridotta sensibilità per il rilevamento di proteine fungine a basso contenuto abbondante7. Inoltre, l'elevata complessità del campione invita molti obiettivi a indagare in un unico sistema sperimentale e si rivela difficile chiarire i meccanismi di azione per una specifica proteina patogena.

La proteomica bottom-up è una tecnica MS popolare che consente la preparazione gestibile del campione, in cui i peptidi sono generati dalla digestione enzimatica specifica della sequenza seguita dalla separazione, identificazione e quantificazione della cromatografia liquida da parte di MS10,11. Qui presentiamo un metodo che dimostra una strategia di acquisizione dipendente dai dati volta a ottenere una copertura imparziale di un proteoma o "infectome" basato sull'infezione. In particolare, la quantificazione senza etichette (LFQ) perde la dipendenza dalle etichette chimiche o metaboliche per un'identificazione robusta e accurata dei cambiamenti del livello proteico tra più proteomi, riducendo le fasi di manipolazione elavorazione del campione 12,13. Questa applicazione universale interroga le proteine prodotte in un dato momento all'interno di una cellula indipendente da qualsiasi produzione proteica prevista; pertanto, si possono scoprire nuove intuizioni che sono fondamentali per l'infezione.

Il flusso di lavoro descritto nel presente documento è ottimizzato per esplorare i cambiamenti a livello proteico dei neoformani C. durante le condizioni di imitazione delle infezioni con le cellule immunitarie ospiti (Figura 1). Piuttosto che basarsi sull'isolamento e la separazione dei tipi di cellule, questo approccio estrae insieme il proteoma ospite e patogeno e utilizza la separazione bioinformatica utilizzando due database specifici dell'organismo per distinguere la produzione proteica specifica delle specie. Questo metodo offre vantaggi per un numero illimitato di campioni da trattare senza le costose fasi di preparazione necessarie negli studi sull'etichettatura o nel frazionamento a base di isotopi. Inoltre, questo flusso di lavoro supporta protocolli di estrazione proteica ottimizzati trasferibili a una vasta gamma di agenti patogeni fungini e batterici in grado di colpire e infettare le cellule immunitarie ospiti. Nel complesso, questo protocollo delinea i passaggi per completare un'estrazione di proteine imparziali e l'elaborazione del campione per la SM ad alta risoluzione, seguita da dati e analisi statistiche, in grado di fornire una ricchezza di conoscenza delle proteine fungine significative per l'infezione combinate con una profilazione completa della risposta della difesa ospite.

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Protocol

Una linea immortalata di macrofagi derivati dai topi BALB/c è stata utilizzata per il seguente protocollo approvato dal Protocollo 4193 dell'Università di Guelph Sull'Utilizzo degli Animali. In particolare, altri ceppi di topi o altre fonti di cellule immortalate possono essere applicati al protocollo delineato con test sufficienti per ottimizzare i parametri dettagliati. Il protocollo seguente consente di esplorare i passaggi che iniziano con una fiala bloccata di celle di macrofagi. Le cellule sono conservate in 10% FBS (siero bovino fetale), 1% L-glutammina e 5% miscela Pen/Strep (Penicillina-Streptomicina) a DMEM (Medium aquila modificata di Dulbecco) e 20% DMSO (solfossido di dimetile).

1. Coltivazione di C. neoformans

  1. Utilizzando uno stock di glicerolo, striato wildtype C. neoformans strain (H99) su estratto di lievito peptone destrosio (YPD) piastra agar per isolare singole colonie.
  2. Incubare durante la notte per 16 ore a 37 °C in un incubatore statico.
  3. Selezionare una singola colonia di ceppo e coltura di neoformani di tipo selvatico C. in 5 ml di brodo YPD in una provetta da 10 ml vagamente limitata. Eseguire in quadruplicazione.
  4. Incubare durante la notte per 16 ore a 37 °C in un'incubatrice tremante a 200 giri/min.
  5. Il giorno seguente sottocultura ogni cultura notturna in una diluizione 1:100 in brodo YPD da 3 mL.
  6. Misurare i valori di densità ottica (OD600nm)delle impostazioni cultura fungine per determinare la fase di registro intermedio. A seconda dello spettrofotometro, il ceppo del tipo selvatico C. neoformans raggiunge la fase di registro medio comunemente seguendo l'incubazione da 6 a 8 ore nell'YPD con valori generali diOD 600nm compresi tra 1,0 e 1,5.
  7. Una volta che le cellule raggiungono la fase di registro intermedio, prendere un'aliquota di 10 μL di sospensione cellulare fungina in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 ml e diluire 1:100 in soluzione salina tamponata 1x fosfato sterile (PBS). Contare il numero di cellule usando un emocitometro.

2. Coltivazione di cellule macrofagi

NOTA: Assicurarsi che l'ambiente di lavoro sia sterilizzato prima del lavoro di coltura cellulare.

  1. Preparazione del mezzo di coltura cellulare
    1. Mezzo integrato con antibiotici: Aggiungere il 10% di FBS (siero bovino fetale), l'1% di L-glutammina e il 5% di miscela Pen/Strep (Penicillina-Streptomicina) al DMEM (Medium Aquila Modificata di Dulbecco). Filtrare il mezzo attraverso un sistema di filtrazione completo da 0,2 μm e conservare a 4 °C.
    2. Mezzo privo di antibiotici: seguire il protocollo identico ma omettere la miscela Pen / Strep.
  2. Cellule di macrofagi di semina
    NOTA: Il mezzo integrato con antibiotici (2.1.1.) deve essere riscaldato a 37 °C prima del lavoro di coltura cellulare.
    1. Scongelare rapidamente il flaconcino delle cellule del macrofago in un bagno di perline a 37 °C.
    2. Lavare le cellule di soluzione congelante rimospensendo le cellule in un mezzo integrato con antibiotici da 1 mL.
      NOTA: È necessaria un'ulteriore precauzione per garantire che le cellule non si lenino a causa della tubazione dura.
    3. Trasferire le cellule rimorsi in un tubo sterile da 15 ml.
    4. Celle a pellet centrifugando a 400 × g per 5 min a temperatura ambiente.
    5. Rimuovere con cura il supernatante con una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto.
    6. Resuspend delicatamente pellet in 10 mL di mezzo integrato antibiotico.
    7. Pipettare delicatamente le cellule risospendate in un piatto trattato con coltura cellulare da 60 x 15 mm.
    8. Incubare il piatto a 37 °C con il 5% di CO2 durante la notte.
  3. Passaggio iniziale delle cellule macrofagi
    NOTA: Le scorte di cellule congelate conterranno in genere da 5 a 10 milioni di cellule per flaconcino (circa 1 mL). Il giorno successivo, le cellule macrofagi sopravvissute al protocollo di semina aderirono al fondo del piatto di coltura cellulare e saranno pronte per la passaging.
    1. Mezzo caldo integrato con antibiotici (fase 2.1.1) a 37 °C prima del lavoro di coltura cellulare. Assicurarsi che l'ambiente di lavoro sia sterilizzato prima del lavoro di coltura cellulare. Visualizza le cellule usando un microscopio a luce per garantire che le cellule siano rispettate e sane.
    2. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare dal piatto con una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto.
    3. Aggiungere delicatamente 5-7 mL di PBS sterile a temperatura ambiente (salina tamponata da fosfati) al piatto da 60 x 15 mm.
    4. Inclinare delicatamente il piatto per lavare le cellule aderenti.
    5. Rimuovere pbs utilizzando una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto.
    6. Aggiungere 1 mL di PBS freddo (conservato a 4 °C) alle celle, inclinare la piastra per distribuire PBS su tutte le celle e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
    7. Rilasciare le cellule toccando delicatamente il piatto, pipettando PBS freddo contro le cellule o utilizzando un raschietto cellulare.
    8. Aggiungere 9 mL di mezzo integrato con antibiotici al piatto.
    9. In un nuovo piatto da 60 x 15 mm, aggiungere 9 mL di mezzo fresco integrato con antibiotici e 1 mL di cellule risosopendate dal piatto originale.
    10. Una volta riempito il numero di piastre di passaging desiderate, le celle risosopendate dal piatto originale possono essere scartate.
    11. Incubare il nuovo piatto alle impostazioni sopra menzionate (fase 2.2.8).
    12. Eseguire la successiva passaging quando le celle hanno raggiunto il 70-80% di confluenza (approssimativamente ogni 2 giorni a seconda della linea cellulare e del mezzo utilizzato).
      NOTA: Le cellule di macrofagi devono essere passaggio almeno cinque volte prima degli esperimenti di infezione. A seconda della linea cellulare, gli esperimenti di infezione devono essere eseguiti da 25 a 30 passaggi. Dopo 25-30 passaggi, le cellule devono essere congelate o scartate. Le sezioni 2.4 o 2.5 possono essere scelte sulla base dei piani sperimentali. La sezione 2.4 sarà utilizzata per le seguenti sezioni.
  4. Semina di cellule macrofagi prima dell'infezione
    1. Eseguire i passaggi del protocollo di passaging da 2.3.1 a 2.3.7.
    2. L'uso di un emocitometro o di un contatore di cellule automatizzato determina la densità cellulare (cellule/mL).
    3. Trasferire 0,3 x 106 cellule macrofagi in un unico pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzi.
    4. Regolare il volume totale del pozzo a 1 mL utilizzando un mezzo integrato con antibiotici (fase 2.1.1).
    5. Ripetere i passaggi 2.4.3 e 2.4.4 fino a riempire 8 pozzi (4 pozzi riempiti in due piastre separate).
    6. Facoltativamente, riempire i restanti due pozzali con 1 mL di PBS a temperatura ambiente per mantenere i livelli di umidità durante l'incubazione.
    7. Consentire alle cellule di crescere in condizioni di incubazione menzionate nel passaggio 2.2.8 per 2 d prima dell'infezione.
  5. Semina di cellule macrofagi il giorno dell'infezione
    1. Eseguire i passaggi del protocollo di passaging da 2.3.1 a 2.3.7.
    2. L'uso di un emocitometro o di un contatore di cellule automatizzato determina la densità cellulare (cellule/mL).
    3. Semina 1,2 x 106 cellule di macrofagi in un unico pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzi.
    4. Regolare il volume totale del pozzo a 1 mL utilizzando un mezzo integrato con antibiotici (2.1.1).
    5. Ripetere 2.4.3 e 2.4.4 fino a quando non sono stati riempiti 8 pozzi (4 pozzi riempiti in due piastre separate).
    6. Facoltativamente, riempire i restanti due pozzali con 1 mL di PBS a temperatura ambiente per mantenere i livelli di umidità durante l'incubazione.
    7. Incubare le cellule in condizioni menzionate nel passaggio 2.2.8 per 3 ore per consentire alle cellule di aderire ai pozzi.

3. Infezione delle cellule macrofagi con C. neoformans

NOTA: Una volta raggiunta la confluenza del 70-80%, ci saranno circa 1,2 x 106 cellule macrofagi per pozzo. Per ottenere la molteplicità di infezione desiderata (MOI) di 100:1, sono necessarie 1,2 x10 8 cellule fungine per ogni reazione. Le colture devono essere fissate di conseguenza in quadruplicazione biologica.

DISCLAIMER: Un MOI di 100:1 ha raggiunto risultati desiderabili nel nostro gruppo di ricerca ed è inteso come suggerimento per i lettori. Un MOI inferiore può essere richiesto per ceppi di C. neoformani più infettivi o per linee cellulari di macrofagi meno resilienti. La verifica dell'infezione (sezione 3.5) può essere utilizzata per determinare il MOI ideale per particolari combinazioni di C. neoformani - macrofagi.

  1. Preparazione di cellule fungine
    1. Seguire il passaggio 1 per la crescita dei neoformani C. alla fase di registro intermedio.
    2. Raccogliere e centrifugare le cellule a 1.500 x g per 10 minuti, lavare delicatamente il pellet con PBS sterile a temperatura ambiente e ripetere per un totale di tre lavaggi.
    3. Resuspend cellule in un mezzo di coltura cellulare privo di antibiotici (fase 2.1.2) per raggiungere una concentrazione di 1,2 x 108 cellule/mL.
  2. Preparazione di cellule macrofagi
    1. Visualizza ogni bene nella piastra a 6 pozzi per assicurarti che le cellule abbiano raggiunto il 70-80% di confluenza. In alternativa, le cellule possono essere misurate per ottenere circa 1,2 x 106 cellule macrofagi per pozzo.
    2. Seguire i passaggi da 2.3.1 a 2.3.4.
  3. Co-coltura di C. neoformani e cellule macrofagi
    1. Aggiungere 1 mL delle cellule di C. neoformans rimescolate (fase 3.1.3) a 4 pozzi contenenti cellule di macrofagi preparate nella sezione 3.2.
      NOTA: Il numero di piastre richieste dovrà essere calcolato prima di iniziare l'esperimento. Aggiungere 1 mL di mezzo privo di antibiotici (fase 2.1.2) ai pozzi vuoti.
    2. Lasciare incubare le cellule in condizioni elencate (fase 2.2.8) per 3 ore.
    3. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare dalla piastra con una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto.
    4. Aggiungere delicatamente 1 mL di PBS sterile a temperatura ambiente.
    5. Inclinare delicatamente la piastra per lavare le cellule extracellulari C. neoformans non attaccate o non fagocitose.
    6. Rimuovere il PBS utilizzando una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto, ripetere per un totale di tre lavaggi. Ripetere da 3,3,4 a 3,3,5 altre due volte.
  4. Macrofagi non infetti
    1. Allo stesso modo, utilizzare 4 pozzi di una piastra da 6 pozza di pozzo per fungere da campioni di solo macrofagi. Aggiungere 1 mL di mezzo privo di antibiotici (fase 2.1.2) a questi pozzi.
    2. Ripetere i passaggi da 3.3.2 a 3.3.6.
  5. Verifica dell'infezione
    NOTA: Utilizzando un test di citotossicità, è possibile misurare la competenza dell'infezione. Il seguente protocollo evidenzierà l'applicazione di un prodotto di citotossicità per misurare il rilascio di LDH (lattato deidrogenasi). Possono essere utilizzati anche altri prodotti di citotossicità.
    1. Preparazione dell'infezione da C. neoformans delle cellule del macrofago
      1. Ripete i passaggi 1, 2 e 3 (fino a 3,5). Il saggio LDH può essere eseguito in triplice copia, se lo si preferisce.
      2. Dopo il passaggio 3.3.6, aggiungere 1 mL di mezzo privo di antibiotici (2.1.2) ad ogni pozzo nella piastra a 6 po porsi.
      3. Ripetere i passaggi 2.4.3 e 2.4.4 fino a quando sono stati riempiti 3 pozzi più pozzi da 3n (dove n è il numero di punti di tempo misurati).
      4. Incubare le cellule in condizioni elencate al passaggio 2.2.8.
      5. Nei punti di tempo selezionati (ad esempio, 1, 3, 6, 12 e 24 ore) raccogliere il supernatante per la misurazione del rilascio di LDH secondo le istruzioni del produttore
      6. Allo stesso tempo, le cellule macrofagi non infette verranno lisciviate al valore determinato per la massima citotossicità.
      7. Calcolare la citotossicità come segue:
        Equation 1

4. Raccolta dei campioni

  1. Co-coltura e raccolta di macrofagi non infetti
    1. Aggiungere 1 mL di PBS freddo alle celle (da 3,3,6 e 3,4,2) e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
    2. Rilasciare le celle dalla piastra toccando delicatamente la piastra o tubazionando delicatamente pbs freddo contro le cellule.
      NOTA: Il raschietto cellulare deve essere evitato in quanto ciò potrebbe causare llisi delle cellule.
    3. Pipetta ha rimospensito le celle in un tubo da 15 ml.
    4. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.
    5. Le celle di processo (come descritto nella fase 5) immediatamente o flash congelate in azoto liquido e conservate a -80 °C per una successiva lavorazione.

5. Proteoma cellulare

NOTA: La lisi sufficiente deve essere ottimizzata per il tipo di cella analizzato (cioè, la quantità di cicli e ampiezze dipende dalle dimensioni del pellet cellulare e dalla percentuale di potenza del modello di sonicatore della sonda).

  1. Lisi cellulare del macrofago infetto
    1. Cellule pellettate resuspend (fase 4.1.5) in 300 μL di Tris-HCl (pH 8.5) da 100 mM di tris-HCl (pH 8.5) costituite da una compressa da cocktail inibitore della proteasi appena sciolta.
      NOTA: Una compressa da cocktail inibitore della proteasi viene aggiunta a 10 mL di ghiaccio freddo 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) prima di iniziare l'esperimento.
    2. Sondare le cellule sonicate in un bagno di ghiaccio per 15 cicli di 30 s on e 30 s off, per lire le cellule.
    3. Centrifugare brevemente le cellule per 30 s a 400 x g,fare attenzione a non formare un pellet, solo per rimuovere il liquido sui lati dei tubi seguito dal trasferimento del campione in un tubo di microcentrifugo Lo-bind da 2 ml.
    4. Aggiungere 1:10 volume del 20% di SDS a una concentrazione finale del 2%.
    5. Aggiungere 1:100 volume di 1 M ditiothiothreitol (DTT) ad una concentrazione finale di 10 mM e mescolare accuratamente il campione con pipettazione, seguito dall'incubazione su un blocco riscaldante termico a 95 °C per 10 minuti a 800 giri/min di agitazione. Successivamente, raffreddare a temperatura ambiente (il raffreddamento può essere fatto sul ghiaccio).
    6. Aggiungere 1:10 volume di 0,55 M iodoacetamide (AIA) per ottenere una concentrazione finale di 55 mM e mescolare accuratamente il campione mediante pipettazione. Incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti.
    7. Aggiungere acetone al 100% per ottenere una concentrazione finale di acetone all'80% e conservare il campione durante la notte a -20 °C per far precipitare le proteine.
  2. Digestione proteica
    1. Il giorno successivo, raccogliere il pellet precipitato per centrifugazione per 10 minuti a 10.000 x g e 4 °C. Scartare il supernatante e lavare il pellet con 500 μL di acetone all'80%. Ripetere per un totale di due lavaggi. Pellet secco all'aria a temperatura ambiente dopo lavaggi.
    2. Risolubilizzare il pellet proteico in 100 μL di 8 M urea/40 mM HEPES, per garantire completa solubilizzazione, vortice o sonicazione in un bagno d'acqua ghiacciata per 15 cicli di 30 s on e 30 s off.
      NOTA: La regolazione del volume di urea/HEPES è determinata in base alle dimensioni del pellet di cellule precipitate, se si verificano alterazioni, tutti i volumi a valle devono essere opportunamente regolati.
    3. Quantificare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico (ad esempio, un saggio proteico BCA) secondo le istruzioni del produttore e regolare per la misurazione dello sfondo mediante normalizzazione in bianco con HEPES da 8 M urea / 40 mM.
    4. Aggiungere 300 μL di bicarbonato di ammonio da 50 mM per ottenere una concentrazione finale di 2 M di urea.
      NOTA: Possibilità di normalizzare la concentrazione proteica per misurazioni a valle, suggerita per digerire 100 μg di proteine e conservare il campione rimanente non digerito mediante congelamento lampo in azoto liquido, quindi conservare a -20 °C a breve termine o a -80 °C per il lungo termine.
    5. Aggiungere 2:50 (v/w) rapporto enzima-proteina della miscela tripside/Lys-C proteasi sul ghiaccio e toccare delicatamente il tubo per mescolare, incubare durante la notte a temperatura ambiente.
    6. Dopo l'incubazione, interrompere la digestione aggiungendo soluzione di arresto del volume 1:10 (20% acetonitrile, 6% acido trifluoroacetico) e campioni di centrifuga a 10.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    7. Raccogliere il supernatante(costituito da peptidi digeriti)e scartare eventuali detriti o precipitati pelletati.
  3. Dissalezione peptidica
    1. Attivare una punta C18 Stop And Go Extraction (STAGE) (composta da 3 strati di resina C18 in una punta di pipetta da 200 μL) aggiungendo 100 μL di acetonitrile al 100% e centrifuga a 1.000 x g per 2 min.
    2. Equilibrare la punta C18 STAGE aggiungendo 50 μL di tampone B (80% (v/v) acetonitrile, 0,5% (v/v) acido acetico) e centrifuga a 1.000 x g per 2 min.
    3. Equilibrare la punta C18 STAGE aggiungendo 200 μL di acetonitrile buffer A (2% (v/v), 0,1% (v/v) acido trifluoroacetico, 0,5% (v/v) acido acetico) e centrifuga a 1.000 x g per 3-5 min.
    4. Aggiungere ~50 μg di campione digerito sulla punta E sulla centrifuga C18 STAGE a 1.000 x g per 3-5 minuti, o fino a quando il campione non è passato attraverso la colonna di spin. Flash congelare il campione digerito rimanente in azoto liquido e conservare a -20 °C, fino a quando necessario.
    5. Lavare la punta C18 STAGE con 200 μL di Tampone A e centrifugare a 1.000 x g per 3-5 min.
    6. Aggiungere 50 μL Buffer B alla punta C18 STAGE e centrifugare a 500 x g per 2 min. Raccogliere peptidi elusi in tubi PCR da 0,2 ml.
    7. Asciugare i peptidi elusi in una centrifuga sottovuoto per 30-40 minuti alla massima velocità. I campioni completamente essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente o a -20 °C fino alla lavorazione.
      NOTA: I peptidi essiccati e dissalti sono appropriati sottomissioni di campioni agli impianti di spettrometria di massa per la lavorazione e possono essere spediti a temperatura ambiente.

6. Spettrometria di massa

  1. Ricostituire peptidi in tampone A da 10 μL e misurare la concentrazione necessaria per iniettare peptidi da ~1,5 a 3 μg sulla colonna MS. La quantità di campione dipenderà dalla strumentazione.
  2. Utilizzare un gradiente predeterminato di acetonitrile (circa il 5-60%) nello 0,5% di acido acetico nel tempo desiderato (ad esempio, 2 ore) per separare i peptidi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni, seguita da ionizzazione elettrospray nello spettrometro di massa.
  3. Acquisire scansioni MS utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione in modalità di acquisizione dipendente dai dati(m/z da 300 a 1650).
    NOTA: la percentuale e la lunghezza del gradiente sono determinate dall'esperimento e dall'utente. Le impostazioni precise dello spettrometro di massa dipendono dalla strumentazione, dall'esperimento e dalle preferenze dell'utente.

7. Analisi dei dati

NOTA: I dati MS possono essere elaborati con numerose pipeline bioinformatiche. In questo protocollo, descriviamo l'elaborazione utilizzando le piattaforme MaxQuant e Perseus disponibili al pubblico, ma raccomandiamo ai singoli utenti di valutare gli strumenti bioinformatici appropriati per l'analisi, la preferenza e l'utilizzo.

  1. Caricare file di dati non lavorati (direttamente dallo strumento MS) utilizzando il software MaxQuant. Identificare le proteine sotto i parametri di ricerca MaxQuant modificati; minimo di due peptidi unici necessari per l'identificazione delle proteine utilizzando un approccio di esca bersaglio per un tasso di scoperta falso dell'1%, implementare una quantificazione senza etichette con corrispondenza tra le corse, incorporare il file FASTA degli organismi ottenuto dal database UniProt (cioè Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) per identificare e quantificare i peptidi presenti con il motore di ricerca Andromeda. Consultare gli strumenti online pubblici maxquant per esercitazioni dettagliate (vedere Tabella dei materiali).
  2. Caricare il file di output MaxQuant ('proteingroups.txt') in Perseus.
  3. Filtrare le righe contenenti potenziali falsi positivi e contaminanti, nonché modificate solo dai peptidi del sito con il "Filtrare le righe in base alla colonna categorica".
  4. Trasformare i valori dei dati nellascala del log 2.
  5. Creare gruppi di set di dati fornendo annotazioni categoriche alle righe.
  6. Filtrare il set di dati in base a valori validi per definire un cut-off per il rilevamento delle proteine.
    NOTA: Per un'analisi rigorosa e robusta viene suggerito un tasso di identificazione >50%. Ad esempio, se quattro repliche fossero elaborate, verrà selezionato un numero minimo di tre valori validi.
  7. Se lo si preferisce, imputare i dati sostituendo i valori mancanti dalla distribuzione normale.
    NOTA: I valori figurativi sono ottimizzati in base alla distribuzione normale e forniscono un'intensità LFQ casuale per sostituire i segnaposto "NaN" per simulare le misurazioni tipiche dell'abbondanza. Questa imputazione fornisce una piattaforma per l'analisi statistica downstream che richiedono dati quantificabili.
  8. Aggiungere annotazioni alle file proteiche (ad esempio nomi proteici, termini di ontologia genica).
    NOTA: questo flusso di lavoro Perseus generato è ora un solido framework per ulteriori elaborazioni bioinformatiche, analisi statistiche e visualizzazione dei dati, consultare gli strumenti online pubblici di Perseus per esercitazioni dettagliate (vedi Tabella dei materiali).

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Representative Results

Il protocollo sopra delineato consente l'identificazione e la quantificazione delle proteine derivate sia dall'agente patogeno fungino, C. neoformans, che dalle cellule di macrofagi ospiti, in un unico esperimento. Seguendo la cocoltura, le cellule vengono raccolte e lavorate insieme e separate bioinformaticamente in base a profili peptidici specifici di ciascuna specie. Questo è un approccio potente per definire l'interazione della relazione ospite-patogeno durante l'infezione. Il numero di proteine identificate dall'esperimento dipende dal materiale di partenza, dalla preparazione del campione, dalla lunghezza del gradiente, dalla strumentazione MS e dal flusso di lavoro bioinformatico. Usando il protocollo qui descritto, in genere identifichiamo circa 8.000 proteine dall'esperimento con 1.500 C. di proteine neoformans e 6.500 proteine ospiti. Dopo l'elaborazione dei set di dati, viene generato un plot pca (Principal Component Analysis) per osservare i fattori critici che guidano la nostra analisi (Figura 2A). Qui osserviamo che il più grande componente di separazione tra i dati è infetto rispetto ai campioni non infetti, come prevediamo dal progetto sperimentale (componente 1, 79,8%), e una seconda caratteristica distintiva dei campioni è la variabilità biologica (componente 2, 5,7%). Successivamente, una correlazione di Pearson combinata con il clustering gerarchico per gruppi di distanza euclidea i campioni e consente la quantificazione della variabilità tra le repliche (Figura 2B). Nella nostra analisi, abbiamo osservato un clustering distinto di campioni infetti e non infetti e replicare la riproducibilità che varia dal 95 al 96%, rappresentando una buona riproducibilità tra le repliche. Infine, eseguiamo un test t di student correttoper test di ipotesi multiple utilizzando un tasso di falsa scoperta Benjamini-Hochberg (FDR) (p-value ≤ 0.05; FDR = 0,01; s0 = 1) per identificare le proteine con differenze significative di abbondanza durante l'infezione rispetto ai controlli non infetti (Figura 2C). Qui, identifichiamo 760 proteine con cambiamenti significativi in abbondanza, tra cui 117 proteine ospiti con 86 che mostrano una diminuzione significativa e 31 che mostrano un aumento significativo all'infezione. In particolare, osserviamo anche aumenti significativi dell'abbondanza di proteine fungine, come previsto durante l'infezione. Con questi dati, vengono eseguite analisi successive, tra cui la mappatura della rete, la caratterizzazione del silico e gli esperimenti di follow-up per convalidare i dati ed esplorare i meccanismi molecolari alla base della risposta dell'ospite alla virulenza.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro di proteomica a base di spettrometria di massa per l'analisi di macrofagi infettati da C. neoformans. Il flusso di lavoro inizia con la raccolta di macrofagi infettati da C. neoformani o controlli non infetti. Le proteine vengono estratte per interruzione meccanica e chimica, seguite da riduzione e alchilazione, precipitazione dell'acetone e digestione enzimatica. I peptidi vengono purificati sulle punte C18 STAGE, separati da cromatografia liquida ad alte prestazioni, sottoposti a ionizzazione elettrospray e misurati su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. I dati vengono elaborati, analizzati e visualizzati nelle piattaforme bioinformatiche disponibili al pubblico, MaxQuant (con Andromeda) e Perseo14,15,16. Esperimenti eseguiti in quadruplicazione biologica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dati rappresentativi per l'infezione da C. neoformans delle cellule macrofagi. (A) L'analisi dei componenti principali dimostra la distinzione tra macrofago infetto e non infetto (componente 1, 79,8%) e raggruppamento di repliche biologiche (componente 2, 5,7%). (B) Mappa termica della correlazione di Pearson tracciata dal clustering gerarchico per distanza euclidea per mostrare il raggruppamento di campioni (infetti vs non infetti) e replicare la riproducibilità (>95%). (C) Trama vulcanica di proteine identificate. Blu = proteine fungine con cambiamento significativo in abbondanza; nero = proteine macrofagi con un significativo cambiamento in abbondanza. Student's t-test (p-value ≤ 0.05), FDR = 0.01; s0 = 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le fasi critiche del protocollo includono la preparazione di cellule macrofagi e la raccolta di campioni di co-coltura per l'elaborazione delle proteine con un'interruzione minima delle cellule. È importante eseguire passaggi di lavaggio, inoculazione e rimozione delicata e attenta delle cellule macrofagi aderenti per prevenire l'analisi non necessaria delle cellule prima della raccolta. Stabilire il MOI corretto per l'esperimento è anche fondamentale in quanto l'inoculazione con un MOI eccessivamente elevato può causare una rapida morte delle cellule macrofagi e difficoltà nella raccolta e nell'elaborazione di campioni per la SM. Al contrario, un numero minimo di MOI porterà a un minor numero di cellule fungine fagocitose e a un rilevamento limitato di proteine fungine nel sistema biologico. Per superare tali limitazioni, si consiglia di eseguire esperimenti di test con MOI variabili, supportati da test di morte cellulare (ad esempio, quantificazione LDH) per definire il numero di cellule fungine che avviano una risposta host ma non uccidono le cellule ospiti prima della raccolta. Per gli esperimenti, miriamo a identificare le proteine fungine associate all'infezione, richiedendo un MOI elevato (100:1) per rilevare adeguatamente le proteine fungine tra proteine ospiti altamente abbondanti. Eseguiamo regolarmente test di citotossicità del macrofago per valutare l'impatto moi sulla morte della cellula ospite prima di eseguire l'intero esperimento. Anche la tempistica dell'incubazione delle cellule C. neoformans con macrofagi è cruciale in quanto le cellule fungine possono possedere grandi capsule di polisaccaridi e quindi il macrofago richiede più tempo per l'inghiottimento. Selezioniamo di utilizzare un tempo di incubazione co-coltura di 3 ore per l'esperimento delineato, poiché abbiamo trovato una buona copertura del proteoma fungino in questo momento e di fornire uno "scatto" di risposta dell'ospite; tuttavia, i ricercatori potrebbero voler esplorare i punti di tempo precedenti e successivi e osservare come il tempo influisce sulla produzione fungina e proteica ospite. In alternativa, l'adescamento del macrofago per l'opsonizzazione è stato eseguito per assistere il processofagocitico 17,18.

Per la raccolta del campione, se i campioni non vengono elaborati immediatamente, il congelamento lampo nell'azoto liquido aiuterà a prevenire la degradazione indesiderata delle proteine mediante proteasi presenti nei campioni. Inoltre, per le analisi proteomiche basate su SM, il potenziale di contaminazione da polvere o cheratina (ad esempio, pelle e cellule ciliate) dovrebbe essere limitato attraverso l'uso di guanti nitrile, cappotti da laboratorio e lavaggio di tutte le superfici con il 70% di etanolo prima di iniziare gli esperimenti. Inoltre, i protocolli sopra descritti sono specifici del set di campioni di co-coltura descritto ma possono essere modificati per l'ottimizzazione del flusso di lavoro di estrazione delle proteine,in base alle esigenze 19,20. Le opportunità per modificare il flusso di lavoro e ottimizzare per tipi di cellule specifiche includono le tecniche di interruzione meccanica e chimica selezionate, la durata e la temperatura della digestione enzimatica e la separazione dei campioni. Ad esempio, la llisi delle cellule di C. neoformans viene tipicamente eseguita dal battito meccanico delle perline; tuttavia, abbiamo osservato una maggiore copertura del proteoma a seguito della sonicazione della sonda e, pertanto, lo consigliamo per l'interruzionemeccanica delle cellule infette 19,21,22. Ad esempio, il frazionamento di campioni peptidici in aliquote mediante frazionamento ad alto pH o cromatografia ad esclusione di dimensioni può ridurre la complessità del campione e migliorare la profondità di copertura sullo spettrometrodi massa 9. Inoltre, per raggiungere la profondità di copertura per identificare circa 8.000 proteine ospiti e fungine, è necessario un sistema di spettrometria di massa ad alta risoluzione (ad esempio, QExactive Exploris, Fusion Lumos, timsTOF Pro).

L'uso di LFQ per quantificare i cambiamenti nei livelli proteici durante l'infezione è un approccio affidabile ed economico per la proteomica a base di SM12. Consente la quantificazione delle proteine per abbondanza relativa senza la necessità di ulteriori fasi di elaborazione del campione. Inoltre, l'analisi viene eseguita dopo il completamento dell'esperimento, prestandosi ad applicazioni universali e a una progettazione flessibile dello studio. Tuttavia, le limitazioni del LFQ includono un aumento del tempo di strumentazione in quanto i campioni devono essere eseguiti in sequenza e non possono essere combinati, la comparabilità tra i campioni può essere difficile e la necessità di imputazione per sostituire i valori mancanti puòessere elevata a 23. Approcci alternativi per quantificare l'abbondanza proteica includono tecniche di etichettatura metabolica (ad esempio, etichettatura isotopica stabile degli amminoacidi nella coltura cellulare) e chimiche (ad esempio, etichette di massa tandem), che consentono di combinare campioni per ridurre il tempo dello strumento, fornire una comparabilità affidabile tra i campioni e comunemente portare a valorimeno mancanti 24,25. Tuttavia, tali approcci richiedono ulteriori fasi di gestione ed elaborazione dei campioni, maggiore complessità e tempo degli esperimenti di laboratorio umido, oltre a richiedere una progettazione sperimentale fissa. Per scegliere un metodo di quantificazione ottimale per gli esperimenti proposti, gli utenti dovrebbero prendere in considerazione la progettazione e la comparabilità dei campioni, la complessità del laboratorio umido e l'analisi dei dati, nonché la disponibilità e il costo del tempo di strumentazione.

La novità del protocollo presentato è la capacità di definire cambiamenti nel proteoma sia dal punto di vista ospite che patogeno in un unico esperimento. La profondità di copertura di entrambi i proteomi consente una nuova visione di come l'agente patogeno avvia l'infezione e di come l'ospite risponde in difesa. In particolare, l'approccio si concentra sull'infezione dell'intera cellula; tuttavia, esistono opportunità per definire sottoproteomi o risposte compartimentate all'infezione attraverso la combinazione con tecniche di localizzazione spaziale (ad esempio centrifugazione, arricchimento, etichettatura)26,27. Qui, dettagliamo l'interazione tra i macrofagi e l'agente patogeno fungino, C. neoformans; tuttavia, l'approccio è universale e può essere applicato alle interazioni tra una vasta gamma di sistemi biologici. Ad esempio, di recente abbiamo utilizzato un flusso di lavoro simile per scoprire risposte generali e specifiche del sito di neutrofili derivate da un modello murino di cheratite oculare28,29,30. Inoltre, i set di dati di infettivi generati da questo protocollo possono essere integrati con il proteoma in vitro e il profilazione del secretome di un agente patogeno per rilevare proteine con abbondanza alterata in presenza di cellule ospiti. Tali proteine, indicate come proteine associate all'infezione, forniscono una pletora di fattori di virulenza noti e nuovi per un'ulteriore caratterizzazione, tra cui la regolazione temporale, la localizzazione e le interazioni dirette proteina-proteina con l'ospite. Nel complesso, il flusso di lavoro proteomica basato su MS delineato offre una nuova opportunità per indagare l'intricata relazione tra ospite e agente patogeno in un singolo esperimento con universalità e comprensione non comunemente disponibili.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. Jonathan Krieger di Bioinformatics Solutions Inc. Gli autori riconoscono il sostegno al finanziamento, in parte, dalla Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), e dalla Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) per J.G.M., così come NSERC Canada Graduate Scholarship - Master and Ontario Graduate Scholarship for B.B., e Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology per A.S..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fisher Scientific BP152-1 Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 174888
6-well cell culture plate ThermoFisher Scientific 140675
Acetonitrile, MS grade Pierce TS-51101
Acetic Acid Sigma Aldrich 1099510001
Acetone Sigma Aldrich 34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC) ThermoFisher Scientific A643-500 Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System Fisher Scientific 13-717-300 Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin 3M Empore 3M2215
Cell Scrapers VWR 10062-906 Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator Eppendorf 07-748-15
Complete Filtration Unit VWR 10040-436
Conical falcon tubes (15 mL) Fisher Scientific 05-539-12
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0861 Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 10566016
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 12483020 Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375 Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system ThermoFisher Scientific LC140 Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer ThermoFisher Scientific 726042
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich I6125 Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes Eppendorf 13-698-794
MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge Eppendorf 13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns ThermoFisher Scientific ES803
Perseus Software http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline VWR CA12001-676 Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay ThermoFisher Scientific  23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL) Fisher Scientific 13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix Fisher Scientific 14955235
Probe sonciator ThermoFisher Scientific 100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693159001
Sodium dodecyl sulfate ThermoFisher Scientific 28364 20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop) ThermoFisher Scientific ND-2000
STAGE tipping centrifuge Sonation STC-V2
Thermal Shaker VWR NO89232-908
Trifluoroacetic acid ThermoFisher Scientific 85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade Pierce A40007 Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath Bransonic A89375-450 Stored in cold room (4C)
Urea Sigma Aldrich U1250-1KG Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth BD Difco BM20

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References

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Immunologia e infezione Numero 164 Proteomica a base di spettrometria di massa quantificazione senza etichette interazioni ospite-patogeno coltura cellulare dei mammiferi patogeno fungino Cryptococcus neoformans
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