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Immunology and Infection

डिस्कवरी-संचालित होस्ट-रोगजनक इंटरैक्शन के लिए लेबल-फ्री क्वांटिटेटिव प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो

Published: October 20, 2020 doi: 10.3791/61881
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

Summary

यहां, हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटेओमिक्स द्वारा संक्रमण के दौरान मेजबान और रोगजनक के बीच परस्पर क्रिया को प्रोफाइल करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक ही प्रयोग में दोनों मेजबान (जैसे, मैक्रोफेज) और रोगजनक (जैसे क्रिप्टोकसस नियोफॉर्मन)के प्रोटीन प्रचुरता में परिवर्तन को मापने के लिए लेबल-मुक्त मात्राकरण का उपयोग करता है।

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स की तकनीकी उपलब्धियां अलग-अलग परिस्थितियों में किसी जीव के वैश्विक प्रोटेम का विश्लेषण करने के लिए कई अनदेखा रास्ते खोलती हैं। वांछित मेजबान के साथ माइक्रोबियल रोगजनकों की बातचीत पर लागू यह शक्तिशाली रणनीति संक्रमण के प्रति दोनों दृष्टिकोणों को व्यापक रूप से चित्रित करती है। इसके साथ ही, वर्कफ्लो में क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मन्स के इंफ्रेक्टोम के लेबल-फ्री क्वांटिफिकेशन (एलएफक्यू) का वर्णन किया गया है, जो एक फंगल फैकल्टी इनट्रासेलुलर रोगजनक है जो अमर मैक्रोफेज कोशिकाओं की उपस्थिति में घातक रोग क्रिप्टोकॉकोसिस का कारक एजेंट है। प्रोटोकॉल में एक ही प्रयोग के भीतर रोगजनक और स्तनधारी कोशिकाओं दोनों के लिए उचित प्रोटीन तैयारी तकनीकों का विवरण दिया गया है, जिसके परिणामस्वरूप तरल-क्रोमेटोग्राफी (एलसी)-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए उपयुक्त पेप्टाइड सबमिशन होता है । एलएफक्यू की उच्च थ्रूपुट जेनेरिक प्रकृति प्रोटीन पहचान और मात्राकरण की एक विस्तृत गतिशील श्रृंखला की अनुमति देती है, साथ ही किसी भी मेजबान-रोगजनक संक्रमण सेटिंग में हस्तांतरणशीलता, अत्यधिक संवेदनशीलता को बनाए रखते हैं। विधि संक्रमण-नकल करने वाली स्थितियों के भीतर एक रोगजनक के व्यापक, निष्पक्ष प्रोटीन बहुतायत प्रोफाइल को सूचीबद्ध करने के लिए अनुकूलित है। विशेष रूप से, यहां प्रदर्शित विधि सी नियोफॉर्मन रोगजनकों के बारे में आवश्यक जानकारी प्रदान करती है, जैसे कि उग्रता के लिए आवश्यक प्रोटीन उत्पादन और माइक्रोबियल आक्रमण का जवाब देने वाले महत्वपूर्ण मेजबान प्रोटीन की पहचान करता है।

Introduction

आक्रामक फंगल संक्रमणों की व्यापकता काफी बढ़ रही है और अस्वीकार्य रूप से उच्च मृत्यु दर के साथ सहसंबद्ध है, जो आमतौर पर इम्यूनोडिनेस प्रीडिस्टेंस1वाले व्यक्तियों में रिपोर्ट की जाती है। क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मेन एक कुख्यात अवसरवादी फंगल रोगजनक है जो मेजबान मैक्रोफेज कोशिकाओं के भीतर इंट्रासेलर अस्तित्व में सक्षम है। अपर्याप्त एंटीफंगल हस्तक्षेप के परिणामस्वरूप क्रिप्टोकोकल मेनिनजाइटिस और मेनिंगोएंसेफलाइटिस2,3के फंगल प्रसार और जीवन-धमकी वाले अभिव्यक्तियां होती हैं। इम्यूनोसमझौता की स्थिति में वैश्विक वृद्धि ने एंटीफंगल एजेंटों के उपयोग में समानांतर वृद्धि की मांग की है, जिसमें सी नियोफॉर्मन सहित कई फंगल प्रजातियोंने4,5,6के प्रति तेजी से प्रतिरोध विकसित किया है। इसलिए, मेजबान रक्षा प्रतिक्रिया और माइक्रोबियल रोगजनकता के बारे में महत्वपूर्ण जैविक सवालों के जवाब देने के लिए मजबूत और कुशल प्रौद्योगिकियों को लागू करना अनिवार्य है ।

शक्तिशाली कंप्यूटेशनल और बायोइंफॉर्मेटिक्स पाइपलाइनों की पीढ़ी सहित मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) में तकनीकी उन्नति का नया युग, मेजबान-रोगजनक अनुसंधान7,8के बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए एक एकीकृत दृष्टि की नींव प्रदान करता है। पारंपरिक रोगजनकता-चालित प्रोटेओमिक विश्लेषण आमतौर पर मेजबान या रोगजनक परिप्रेक्ष्य से संक्रमण के दृश्य को प्रोफाइल करता है, जिसमें प्रोटीन सहसंबंध प्रोफाइलिंग, प्रोटेओमिक्स के साथ संयुक्त आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी और इंटरैक्टॉमिक्स9जैसे व्यापक तरीके शामिल हैं। मेजबान प्रणाली में खतरनाक रोगजनकों की उग्रता की जांच बहुत नैदानिक महत्व की है; हालांकि, एक ही प्रयोग में दोहरे परिप्रेक्ष्य विश्लेषण के आवेदन को पूर्व में अप्राप्य माना जाता था। उदाहरण के लिए, संक्रमण के प्रति रोगजनक का परिप्रेक्ष्य अक्सर अत्यधिक प्रचुर मात्रा में मेजबान प्रोटीन से अभिभूत होता है जिसके परिणामस्वरूप कम प्रचुर मात्रा में फंगल प्रोटीन का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता कम होती है7। इसके अलावा, उच्च नमूना जटिलता एक ही प्रयोगात्मक प्रणाली में जांच करने के लिए कई लक्ष्यों को आमंत्रित करती है और एक विशिष्ट रोगजनक प्रोटीन के लिए कार्रवाई के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित होती है।

बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स एक लोकप्रिय एमएस तकनीक है जो प्रबंधनीय नमूना तैयारी को सक्षम बनाती है, जिसमें पेप्टाइड्स अनुक्रम-विशिष्ट एंजाइमैटिक पाचन द्वारा उत्पन्न होते हैं जिसके बाद तरल क्रोमेटोग्राफी पृथक्करण, पहचान और एमएस10,11द्वारा मात्राकरण होता है। यहां, हम एक संक्रमण आधारित प्रोटेम या 'इंफ्फोम' के निष्पक्ष कवरेज को प्राप्त करने के उद्देश्य से डेटा-निर्भर अधिग्रहण रणनीति का प्रदर्शन करने वाली एक विधि पेश करते हैं। विशेष रूप से, लेबल-मुक्त मात्राकरण (एलएफक्यू) कई प्रोटियोम्स में प्रोटीन स्तर के परिवर्तनों की मजबूत और सटीक पहचान के लिए रासायनिक या मेटाबोलिक लेबल पर निर्भरता डालता है, नमूना हैंडलिंग और प्रसंस्करण चरणों को कम करता है12,13। यह सार्वभौमिक आवेदन किसी भी अपेक्षित प्रोटीन उत्पादन से स्वतंत्र सेल के भीतर किसी भी समय उत्पादित प्रोटीन से पूछताछ करता है; इस प्रकार, उपन्यास अंतर्दृष्टि की खोज की जा सकती है जो संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हैं।

यहां वर्णित वर्कफ्लो को मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं(चित्रा 1)के साथ संक्रमण-नकल करने वाली स्थितियों के दौरान सी नियोफॉर्मन के प्रोटीन स्तर के परिवर्तनों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाता है। सेल प्रकारों के अलगाव और पृथक्करण पर निर्भर होने के बजाय, यह दृष्टिकोण मेजबान और रोगजनक प्रोटेम को एक साथ निकालता है, और प्रजातियों-विशिष्ट प्रोटीन उत्पादन को अलग करने के लिए दो जीव-विशिष्ट डेटाबेस का उपयोग करके जैव सूचनाओं के पृथक्करण का उपयोग करता है। यह विधि आइसोटोप-आधारित लेबलिंग अध्ययन या अंश में आवश्यक अतिरिक्त महंगी तैयारी चरणों के बिना संसाधित किए जाने वाले नमूनों की असीमित संख्या के लिए लाभ प्रदान करती है। इसके अलावा, यह वर्कफ्लो अनुकूलित प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटोकॉल का समर्थन करता है जो मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लक्षित और संक्रमित करने में सक्षम फंगल और बैक्टीरियल रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए हस्तांतरणीय है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस के लिए एक निष्पक्ष प्रोटीन निष्कर्षण और नमूना प्रसंस्करण को पूरा करने के लिए कदमों को रेखांकित करता है, जिसके बाद डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण होता है, जो मेजबान रक्षा प्रतिक्रिया की व्यापक प्रोफाइलिंग के साथ संयुक्त संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण फंगल प्रोटीन के ज्ञान का खजाना प्रदान करने में सक्षम होता है।

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Protocol

बाल्ब/सी चूहों से प्राप्त मैक्रोफेज की एक अमर लाइन का उपयोग यूनिवर्सिटी ऑफ गुएल्फ एनिमल यूटिलाइजेशन प्रोटोकॉल 4193 द्वारा अनुमोदित निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए किया गया था। विशेष रूप से, चूहों के अन्य उपभेदों या अमर कोशिकाओं के अन्य स्रोतों को विस्तृत मापदंडों को अनुकूलित करने के लिए पर्याप्त परीक्षण के साथ उल्लिखित प्रोटोकॉल पर लागू किया जा सकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल मैक्रोफेज कोशिकाओं की एक जमे हुए शीशी के साथ शुरू होने वाले चरणों को नेविगेट करेगा। कोशिकाओं को 10% एफबीएस (भ्रूण गोजातीय सीरम), 1% एल-ग्लूटामाइन और 5% पेन/स्ट्रीप (पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) मिश्रण में डीएमईएम (दुल्बेको का संशोधित ईगल मीडियम) और 20% डीएमएसओ (डिमेथाइल सल्फोक्साइड) में संग्रहित किया जाता है।

1. सी नियोफॉर्मन्स की खेती

  1. एक ग्लिसरोल स्टॉक का उपयोग करना, एकल उपनिवेशों को अलग करने के लिए खमीर-एक्सप्टोन डेक्सट्रोज़ (वाईपीडी) आगर प्लेट पर स्ट्रीक वाइल्डटाइप सी नियोफॉर्मन्स स्ट्रेन (एच 99)।
  2. एक स्थिर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए रात भर इनक्यूबेट।
  3. एक शिथिल छाया हुआ 10 मिलीएल टेस्ट ट्यूब में वाईपीडी शोरबा के 5 एमएल में वाइल्डटाइप सी नियोफॉर्मन स्ट्रेन और कल्चर की एक ही कॉलोनी का चयन करें। चतुर्दशी में प्रदर्शन करें।
  4. 200 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए रात भर इनक्यूबेट।
  5. अगले दिन उपसंस्कृति 3 मिली YPD शोरबा में एक 1:100 कमजोर पड़ने में प्रत्येक रात संस्कृति ।
  6. मध्य लॉग चरण निर्धारित करने के लिए फंगल संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी600एनएम)मूल्यों को मापें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के आधार पर, सी नियोफॉर्मेनेस वाइल्डटाइप तनाव आमतौर पर वाईपीडी में 6 से 8 घंटे इनक्यूबेशन के बाद मध्य-लॉग चरण तक पहुंचता है जिसमें सामान्य ओडी600 एनएम मूल्य 1.0 से 1.5 तक होते हैं।
  7. एक बार जब कोशिकाएं मध्य-लॉग चरण तक पहुंच जाती हैं, तो 10 माइक्रोल एलिकोट फंगल सेल सस्पेंशन को साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में लें और बाँझ 1x फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) में 1:100 पतला करें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या गिनें।

2. मैक्रोफेज कोशिकाओं की खेती

नोट: सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृति के काम से पहले काम के माहौल को निष्फल किया गया है।

  1. सेल कल्चर माध्यम की तैयारी
    1. एंटीबायोटिक-पूरक माध्यम: डीएमईएम (दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम) में 10% एफबीएस (भ्रूण गोजातीय सीरम), 1% एल-ग्लूटामाइन और 5% पेन/स्ट्रेप (पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन) मिश्रण जोड़ें। 0.2 माइक्रोन पूर्ण फिल्टर सिस्टम के माध्यम से फ़िल्टर माध्यम और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम: समान प्रोटोकॉल का पालन करें, लेकिन कलम छोड़/
  2. सीडिंग मैक्रोफेज कोशिकाएं
    नोट: एंटीबायोटिक पूरक माध्यम (2.1.1.1.) सेल संस्कृति काम करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गरम किया जाना चाहिए ।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस मनका स्नान में जल्दी से मैक्रोफेज कोशिकाओं की गल शीशी।
    2. 1 मिली एंटीबायोटिक-पूरक माध्यम में कोशिकाओं को फिर से खर्च करके फ्रीजिंग समाधान की कोशिकाओं को धोएं।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतने की आवश्यकता है कि कोशिकाएं कठोर पिपटिंग के कारण नहीं हैं।
    3. एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब के लिए पुनः निलंबित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 × जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली कोशिकाओं।
    5. एक सीरोलॉजिकल पिपेट या वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ सुपरनेट को सावधानी से हटा दें।
    6. धीरे-धीरे एंटीबायोटिक पूरक माध्यम के 10 एमएल में गोली को फिर से रीसस्लपेंड करें।
    7. धीरे-धीरे पिपेट ने कोशिकाओं को 60 x 15 मिमी सेल संस्कृति-उपचारित पकवान में फिर से निलंबित कर दिया।
    8. रात भर 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट डिश।
  3. मैक्रोफेज कोशिकाओं का प्रारंभिक मार्ग
    नोट: फ्रोजन सेल स्टॉक्स में आमतौर पर प्रति शीशी (लगभग 1 मिलियन) 5 से 10 मिलियन कोशिकाओं के बीच शामिल होंगे। बाद के दिन, बोने वाले प्रोटोकॉल से बच गए मैक्रोफेज कोशिकाएं सेल कल्चर डिश के नीचे का पालन करेंगी और पासेजिंग के लिए तैयार होंगी।
    1. सेल कल्चर वर्क से पहले गर्म एंटीबायोटिक-पूरक माध्यम (चरण 2.1.1) से 37 डिग्री सेल्सियस तक। सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृति के काम से पहले काम के माहौल को निष्फल किया जाता है। कोशिकाओं का पालन और स्वस्थ सुनिश्चित करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं की कल्पना करें।
    2. पकवान से सेल कल्चर माध्यम को या तो सीरोलॉजिकल पिपेट या वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ निकालें।
    3. धीरे-धीरे 60 x 15 मिमी डिश में बाँझ कमरे-तापमान पीबीएस (फॉस्फेट-बफर नमकीन) के 5-7 एमएल जोड़ें।
    4. धीरे-धीरे पालन कोशिकाओं को धोने के लिए पकवान झुकाएं।
    5. एक सीरोलॉजिकल पिपेट या वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके पीबीएस निकालें।
    6. कोशिकाओं में ठंडे पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के 1 एमएल जोड़ें, सभी कोशिकाओं पर पीबीएस वितरित करने के लिए झुकाव पकवान, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें।
    7. डिश के कोमल दोहन से कोशिकाओं को छोड़ें, कोशिकाओं के खिलाफ ठंडे पीबीएस को पाइपिंग करें, या सेल स्क्रैपर का उपयोग करके।
    8. डिश में एंटीबायोटिक-सप्लीमेंट मीडियम का 9 एमएल डालें।
    9. एक नई 60 x 15 मिमी डिश में, मूल डिश से ताजा एंटीबायोटिक-पूरक माध्यम के 9 एमएल और पुनर्संरित कोशिकाओं के 1 एमएल जोड़ें।
    10. एक बार वांछित पासेजिंग प्लेटों की संख्या भर जाने के बाद, मूल पकवान से पुनर्नचित कोशिकाओं को त्याग दिया जा सकता है।
    11. ऊपर उल्लिखित सेटिंग्स (चरण 2.2.8) पर नई डिश को इनक्यूबेट करें।
    12. बाद में पासेजिंग करें जब कोशिकाएं 70-80% संगम तक पहुंच गई हैं (सेल लाइन और मध्यम उपयोग किए जाने के आधार पर लगभग हर 2 दिन)।
      नोट: मैक्रोफेज कोशिकाओं को संक्रमण प्रयोगों से पहले न्यूनतम पांच बार पारित किया जाना चाहिए। सेल लाइन के आधार पर, संक्रमण प्रयोगों को 25 से 30 मार्ग तक किया जाना चाहिए। 25 से 30 मार्ग के बाद, कोशिकाओं को जम या छोड़ दिया जाना चाहिए। प्रायोगिक योजनाओं के आधार पर धारा 2.4 या 2.5 चुना जा सकता है। धारा 2.4 का उपयोग निम्नलिखित धाराओं के लिए किया जाएगा।
  4. संक्रमण से पहले मैक्रोफेज कोशिकाओं को सीडिंग करना
    1. पासिंग प्रोटोकॉल चरण 2.3.1 से 2.3.7 तक करें।
    2. हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग सेल घनत्व (कोशिकाओं/एमएल) का निर्धारण करता है।
    3. 0.3 x 106 मैक्रोफेज कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
    4. एंटीबायोटिक-पूरक माध्यम (चरण 2.1.1) का उपयोग करके 1 एमएल तक अच्छी तरह से की कुल मात्रा को समायोजित करें।
    5. दोहराएं कदम 2.4.3 और 2.4.4 जब तक 8 कुओं भरा गया है (4 दो अलग प्लेटों में भरा कुओं) ।
    6. वैकल्पिक रूप से, इनक्यूबेशन के दौरान नमी के स्तर को बनाए रखने के लिए कमरे के तापमान पीबीएस के 1 एमएल के साथ शेष दो कुओं को भरें।
    7. कोशिकाओं को संक्रमण से पहले 2 डी के लिए चरण 2.2.8 में उल्लिखित इनक्यूबेशन स्थितियों के तहत बढ़ने दें।
  5. संक्रमण के दिन सीडिंग मैक्रोफेज कोशिकाएं
    1. पासिंग प्रोटोकॉल चरण 2.3.1 से 2.3.7 तक करें।
    2. हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग सेल घनत्व (कोशिकाओं/एमएल) का निर्धारण करता है।
    3. बीज 1.2 x 106 मैक्रोफेज कोशिकाओं को 6-अच्छी कोशिका संस्कृति प्लेट के एक कुएं में।
    4. एंटीबायोटिक-पूरक माध्यम (2.1.1) का उपयोग करके 1 एमएल तक अच्छी तरह से की कुल मात्रा को समायोजित करें।
    5. दोहराएं 2.4.3 और 2.4.4 जब तक 8 कुओं भरा गया है (4 कुओं दो अलग प्लेटों में भरा) ।
    6. वैकल्पिक रूप से, इनक्यूबेशन के दौरान नमी के स्तर को बनाए रखने के लिए कमरे के तापमान पीबीएस के 1 एमएल के साथ शेष दो कुओं को भरें।
    7. कोशिकाओं को कुओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए 3 घंटे के लिए चरण 2.2.8 में उल्लिखित शर्तों के तहत कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना।

3. सी नियोफॉर्मन के साथ मैक्रोफेज कोशिकाओं का संक्रमण

नोट: 70-80% संगम तक पहुंचने पर, प्रति अच्छी तरह से लगभग 1.2 x10 6 मैक्रोफेज सेल होंगे। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 100:1, 1.2 x 108 फंगल कोशिकाओं के संक्रमण की वांछित बहुलता (एमओआई) को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। संस्कृतियों को तदनुसार जैविक चौगुनी में स्थापित किया जाना चाहिए।

अस्वीकरण: 100:1 के एक एमओआई ने हमारे शोध समूह में वांछनीय परिणाम प्राप्त किए हैं और पाठकों के लिए एक सुझाव के रूप में है। अधिक संक्रामक सी नियोफॉर्मन उपभेदों के लिए या कम लचीला मैक्रोफेज सेल लाइनों के लिए कम एमओआई की आवश्यकता हो सकती है। संक्रमण के सत्यापन (धारा 3.5) विशेष सी नियोफॉर्मन - मैक्रोफेज संयोजनों के लिए आदर्श एमओआई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. फंगल सेल की तैयारी
    1. मध्य लॉग चरण के लिए सी नियोफॉर्मन के विकास के लिए चरण 1 का पालन करें।
    2. 10 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर ले लीजिए और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, धीरे बाँझ कमरे के तापमान PBS के साथ गोली धोने, और तीन धोता की कुल के लिए दोहराने।
    3. 1.2 x 10 8 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक मुक्त सेल संस्कृति माध्यम (चरण2.1.2) में कोशिकाओं को पुनर्सुल् पेंड करें।
  2. मैक्रोफेज सेल की तैयारी
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं 70-80% संगम तक पहुंच गई हैं, 6-अच्छी प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से कल्पना करें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को लगभग 1.2 x 10 6 मैक्रोफेज कोशिकाओं को अच्छीतरह से प्राप्त करने के लिए मापा जा सकता है।
    2. चरण 2.3.1 से 2.3.4 तक का पालन करें।
  3. सी नियोफॉर्मेन्स और मैक्रोफेज कोशिकाओं की सह-संस्कृति
    1. धारा 3.2 में तैयार मैक्रोफेज कोशिकाओं वाले 4 कुओं में पुनर्निपित सी नियोफॉर्मेंस कोशिकाओं (चरण 3.1.3) का 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: प्रयोग शुरू करने से पहले आवश्यक प्लेटों की संख्या की गणना करने की आवश्यकता होगी । खाली कुओं में एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम (चरण 2.1.2) का 1 एमएल जोड़ें।
    2. कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए सूचीबद्ध शर्तों (चरण 2.2.8) के तहत इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    3. प्लेट से सेल कल्चर माध्यम को या तो सीरोलॉजिकल पिपेट या वैक्यूम एस्पिरेटर के साथ हटा दें।
    4. धीरे-धीरे बाँझ कमरे के तापमान पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
    5. प्लेट को धीरे-धीरे झुकाएं गैर-संलग्न या गैर-फैगोसाइटोस्ड एक्सपेरिमेंटल सी नियोफॉर्मन कोशिकाओं को धोने के लिए।
    6. एक सीरोलॉजिकल पिपेट या वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके पीबीएस निकालें, कुल तीन वॉश के लिए दोहराएं। दो बार 3.3.4 से 3.3.5 तक दोहराएं।
  4. असंक्रमित मैक्रोफेज
    1. इसी तरह, मैक्रोफेज-केवल नमूनों के रूप में कार्य करने के लिए 6 अच्छी प्लेट के 4 कुओं का उपयोग करें। इन कुओं में एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम (चरण 2.1.2) का 1 एमएल जोड़ें।
    2. 3.3.2 से 3.3.6 तक के चरणों को दोहराएं।
  5. संक्रमण का सत्यापन
    नोट: एक साइटोटॉक्सिकिटी परख का उपयोग करना, संक्रमण प्रवीणता मापा जा सकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एलडीएच (लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज़) रिलीज को मापने के लिए साइटोटॉक्सिकिटी उत्पाद के अनुप्रयोग को उजागर करेगा। अन्य साइटोटॉक्सिकिटी उत्पादों का भी उपयोग किया जा सकता है।
    1. मैक्रोफेज कोशिकाओं के सी नियोफॉर्मन्स संक्रमण की तैयारी
      1. चरण 1, 2, और 3 (3.5 तक) दोहराता है। एलडीएच परख को यदि प्राथमिकता दी जाए तो ट्रिपलीकेट में प्रदर्शन किया जा सकता है।
      2. चरण 3.3.6 के बाद, 6-अच्छी प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से एंटीबायोटिक-मुक्त माध्यम (2.1.2) का 1 मिलियन जोड़ें।
      3. दोहराएं कदम 2.4.3 और 2.4.4 जब तक 3 कुओं से अधिक 3n कुओं भरा गया है (जहां एन समय अंक मापा की संख्या है) ।
      4. चरण 2.2.8 पर सूचीबद्ध शर्तों के तहत इनक्यूबेट कोशिकाएं।
      5. चयनित समय बिंदुओं पर (उदाहरण के लिए, 1, 3, 6, 12, और 24 घंटे) निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलडीएडीएच रिलीज के माप के लिए सुपरनैंट एकत्र करते हैं
      6. इसके साथ ही, असंक्रमित मैक्रोफेज कोशिकाओं को अधिकतम साइटोटॉक्सिकिटी के लिए निर्धारित मूल्य के लिए lysed किया जाएगा ।
      7. साइटोटॉक्सिकिटी की गणना इस प्रकार है:
        Equation 1

4. नमूना संग्रह

  1. सह-संस्कृति और असंक्रमित मैक्रोफेज संग्रह
    1. कोशिकाओं (3.3.6 और 3.4.2 से) में ठंडे पीबीएस का 1 एमएल जोड़ें और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें।
    2. प्लेट के कोमल दोहन या कोशिकाओं के खिलाफ कोमल पाइपिंग ठंड पीबीएस द्वारा प्लेट से कोशिकाओं को छोड़ें।
      नोट: सेल स्क्रैपर से बचा जाना चाहिए क्योंकि इससे कोशिकाओं का लाइसिस हो सकता है।
    3. पिपेट ने कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में फिर से निलंबित कर दिया।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं, और सुपरनेट को हटा दें।
    5. प्रक्रिया कोशिकाएं (जैसा कि चरण 5 में विस्तृत है) तुरंत या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश और बाद में प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।

5. सेलुलर प्रोटेम

नोट: सेल प्रकार विश्लेषण के लिए पर्याप्त लाइसिस को अनुकूलित किया जाना चाहिए (यानी, चक्र और आयामों की मात्रा सेल पैलेट आकार और जांच सोनिकेटर मॉडल के शक्ति प्रतिशत पर निर्भर करती है)।

  1. संक्रमित मैक्रोफेज सेल लाइसिस
    1. 100 एमएम ट्रिज़-एचसीएल (पीएच 8.5) के 300 माइक्रोन में रीसुस्पेंड पेलेट कोशिकाएं (चरण 4.1.5) एक हौसले से भंग प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल टैबलेट से मिलकर।
      नोट: प्रयोग शुरू करने से पहले एक प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल टैबलेट को बर्फ की ठंड 100 mM Tris-HCl (पीएच 8.5) के 10 एमएल में जोड़ा जाता है।
    2. कोशिकाओं को lyse करने के लिए, 30 एस पर और 30 एस बंद के 15 चक्रों के लिए एक बर्फ स्नान में कोशिकाओं की जांच करें।
    3. 400 x gपर 30 एस के लिए सेंट्रलाइज कोशिकाएं, एक गोली बनाने के लिए सावधान न रहें, बस ट्यूबों के किनारों पर तरल को हटाने के लिए, इसके बाद नमूने को 2 एमएल लो-बाइंड माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सके।
    4. 2% एसडीएस की 1:10 मात्रा को 2% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
    5. 10 m की अंतिम एकाग्रता में 1 एम डिइओथरेटोल (डीटीटी) की 1:100 मात्रा जोड़ें और पिपटिंग द्वारा नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं, इसके बाद थर्मल हीटिंग ब्लॉक पर 800 आरपीएम आंदोलन में 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन। इसके बाद, कमरे के तापमान को ठंडा (ठंडा बर्फ पर किया जा सकता है)।
    6. 55 M M की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 0.55 एम इओडोएस्टामाइड (आईएए) की 1:10 मात्रा जोड़ें और पिपटिंग द्वारा नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं। 20 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    7. प्रोटीन को कम करने के लिए 80% एसीटोन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करने के लिए 100% एसीटोन जोड़ें।
  2. प्रोटीन पाचन
    1. अगले दिन, 10,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्री द्वारा तेज़ गोली इकट्ठा करें। सुपरनेट को त्यागें और 80% एसीटोन के 500 माइक्रोल के साथ गोली धोएं। कुल दो वॉश के लिए दोहराएं। वॉश के बाद कमरे के तापमान पर हवा सूखी गोली।
    2. 8 एम यूरिया/40 एमएम HEPES के 100 माइक्रोन में प्रोटीन गोली को फिर से सोल्यूबिलाइज करें, ताकि 30 एस ऑन और 30 एस ऑफ के 15 चक्रों के लिए बर्फ के पानी के स्नान में पूर्ण घुलनशीलता, भंवर या सोनिकेट सुनिश्चित किया जा सके।
      नोट: यूरिया/HEPES की मात्रा का समायोजन उपजी सेल गोली के आकार पर निर्धारित किया जाता है, यदि परिवर्तन सभी डाउनस्ट्रीम वॉल्यूम होते हैं तो उचित रूप से समायोजित किया जाना चाहिए ।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीन परख (जैसे, बीसीए प्रोटीन परख) का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें और 8 एम यूरिया/40 एमएम एचईपीईएस के साथ खाली सामान्यीकरण द्वारा पृष्ठभूमि माप के लिए समायोजित करें।
    4. 2 एम यूरिया की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 50 एमएल अमोनियम बाइकार्बोनेट के 300 माइक्रोल जोड़ें।
      नोट: डाउनस्ट्रीम मापन के लिए प्रोटीन एकाग्रता को सामान्य बनाने का अवसर, प्रोटीन के 100 माइक्रोन को पचाने का सुझाव दिया गया और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीजिंग द्वारा शेष अपाच्य नमूने को स्टोर करें फिर अल्पकालिक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, या लंबी अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर।
    5. बर्फ पर ट्राइपसिन/Lys-C प्रोटीज़ मिश्रण के 2:50 (v/w) एंजाइम-टू-प्रोटीन अनुपात जोड़ें और धीरे से ट्यूब को मिलाने के लिए टैप करें, कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें ।
    6. इनक्यूबेशन के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर 1:10 वॉल्यूम स्टॉपिंग सॉल्यूशन (20% एसीटोनिएट्रील, 6% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड) और सेंट्रलाइज नमूनों को जोड़कर पाचन बंद करें।
    7. सुपरनैंट(पचा पेप्टाइड्स के होते हैं)ले लीजिए और किसी भी पेल्ड मलबे या तेज़ को त्यागें।
  3. पेप्टाइड डेसाल्टिंग
    1. C18 स्टॉप एंड गो एक्सट्रैक्टेशन (स्टेज) टिप (200 माइक्रोल पिपेट टिप में 3 लेयर्स सी 18 राल से मिलकर) को सक्रिय करें, जिसमें 100% एसीटोनिट्रील के 100 माइक्रोल और 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज शामिल है।
    2. बफर बी (80% (v/v) एसीटोनिट्रिल, 0.5% (v/v) एसिटिक एसिड) और 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के 50 माइक्रोन जोड़कर सी18 स्टेज टिप को बराबर करें।
    3. बफर ए (2% (v/v) एसीटोनिट्रिल, 0.1% (v/v) ट्राइफ्लोरोएकेटिक एसिड, 0.5% (v/v) एसिटिक एसिड) और 3-5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रलाइज के 200 माइक्रोन जोड़कर सी18 स्टेज टिप को समतुल्य करें।
    4. 3-5 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर C18 स्टेज टिप और अपकेंद्रित्र पर पचा नमूना के ~ 50 माइक्रोन जोड़ें, या जब तक नमूना स्पिन कॉलम के माध्यम से पारित कर दिया गया है। फ्लैश तरल नाइट्रोजन में शेष पचा नमूना फ्रीज और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, जब तक की जरूरत है।
    5. 3-5 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर बफर ए और अपकेंद्रित्र के 200 माइक्रोन के साथ C18 स्टेज टिप धोएं।
    6. C18 स्टेज टिप में 50 माइक्रोन बफर बी जोड़ें और 2 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। 0.2 मिलील पीसीआर ट्यूब में eluted पेप्टाइड्स ले लीजिए।
    7. अधिकतम गति से 30-40 मिनट के लिए एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में eluted पेप्टाइड्स सूखी। पूरी तरह से सूखे नमूनों को कमरे के तापमान पर या संसाधित होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: सूखे और डिसाल्टेड पेप्टाइड्स प्रसंस्करण के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधाओं के लिए उपयुक्त नमूना प्रस्तुतियां हैं और परिवेश के तापमान पर भेजे जा सकते हैं।

6. मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. 10 माइक्रोन बफर ए में पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करें और एमएस कॉलम पर ~ 1.5 से 3 माइक्रोग्राम पेप्टाइड्स इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक एकाग्रता को मापें। नमूने की मात्रा इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करेगी।
  2. एसीटोनीट्रील के पूर्व निर्धारित ढाल का उपयोग करें (लगभग 5-60%) एक वांछित समय (जैसे, 2 घंटे) में 0.5% एसिटिक एसिड में उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी द्वारा पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए, इसके बाद इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमीटर में।
  3. डेटा निर्भर अधिग्रहण मोड(m/z 300 से 1650) में एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके एमएस स्कैन प्राप्त करें।
    नोट: ग्रेडिएंट प्रतिशत और लंबाई प्रयोग और उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित की जाती है। सटीक मास स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स इंस्ट्रूमेंटेशन, प्रयोग और उपयोगकर्ता वरीयता पर निर्भर करती हैं।

7. डेटा विश्लेषण

नोट: एमएस डेटा कई जैव सूचना पाइपलाइनों के साथ संसाधित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम सार्वजनिक रूप से उपलब्ध MaxQuant और Perseus प्लेटफार्मों का उपयोग करके प्रसंस्करण का वर्णन करते हैं, लेकिन व्यक्तिगत उपयोगकर्ताओं को विश्लेषण, वरीयता और उपयोग के लिए उपयुक्त बायोइंफॉर्मेटिक टूल का मूल्यांकन करने की सलाह देते हैं।

  1. मैक्सक्विंट सॉफ्टवेयर का उपयोग करके असंसाधित डेटा फ़ाइलों (सीधे एमएस इंस्ट्रूमेंट से) लोड करें। संशोधित मैक्सक्विंट खोज मापदंडों के तहत प्रोटीन की पहचान करें; 1% की झूठी खोज दर के लिए एक लक्ष्य डिकॉय दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रोटीन पहचान के लिए आवश्यक दो अद्वितीय पेप्टाइड्स का न्यूनतम, रनों के बीच मिलान के साथ लेबल-मुक्त मात्राकरण को लागू करें, यूनीप्रोट डेटाबेस (यानी, क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मन एच99, मस मस्कुलस)से प्राप्त जीवों फास्टा फाइल को शामिल करें, एंड्रोमेडा खोज इंजन के साथ वर्तमान पेप्टाइड्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करें। विस्तृत ट्यूटोरियल के लिए सार्वजनिक MaxQuant ऑनलाइन उपकरण से परामर्श करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. पर्सियस में मैक्सक्विंट आउटपुट फाइल ('प्रोटीनग्रुप.txt') अपलोड करें।
  3. संभावित झूठी सकारात्मक और प्रदूषकों वाली पंक्तियों को फ़िल्टर करें, साथ ही केवल साइट पेप्टाइड्स द्वारा 'स्पष्ट कॉलम पर आधारित फ़िल्टर पंक्तियों' के साथ संशोधित किया गया है।
  4. लॉग2 पैमाने पर डेटा मूल्यों को बदलें।
  5. पंक्तियों को स्पष्ट एनोटेशन प्रदान करके डेटा सेट समूह बनाएं।
  6. प्रोटीन का पता लगाने के लिए कट-ऑफ को परिभाषित करने के लिए वैध मूल्यों द्वारा डेटासेट फ़िल्टर करें।
    नोट: एक कड़े और मजबूत विश्लेषण के लिए एक और 50% पहचान दर का सुझाव दिया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि चार प्रतिकृतियां संसाधित की गई थीं तो न्यूनतम तीन वैध मूल्यों का चयन किया जाएगा ।
  7. यदि पसंद किया जाता है, तो सामान्य वितरण से लापता मूल्यों को बदलकर डेटा को आरोपित करें।
    नोट: सामान्य वितरण के आधार पर आरोपित मानों को अनुकूलित किया जाता है और विशिष्ट बहुतायत मापों का अनुकरण करने के लिए 'एनएएन' प्लेसहोल्डर्स को बदलने के लिए एक यादृच्छिक एलएफक्यू तीव्रता प्रदान करता है। यह आरोपण डाउनस्ट्रीम सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक मंच प्रदान करता है जिसके लिए मात्रात्मक डेटा की आवश्यकता होती है।
  8. प्रोटीन पंक्तियों (जैसे प्रोटीन नाम, जीन ओंटोलॉजी शब्द) में एनोटेशन जोड़ें।
    नोट: यह पर्सियस कार्यप्रवाह उत्पन्न अब आगे बायोइन्फॉर्मेमैटिक प्रोसेसिंग, सांख्यिकीय विश्लेषण और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक मजबूत ढांचा है, विस्तृत ट्यूटोरियल के लिए सार्वजनिक पर्सियस ऑनलाइन टूल से परामर्श करता है (सामग्रियों की तालिका देखें)।

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Representative Results

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल एक ही प्रयोग में फंगल रोगजनक, सी नियोफॉर्मनऔर मेजबान, मैक्रोफेज कोशिकाओं दोनों से प्राप्त प्रोटीन की पहचान और मात्राकरण में सक्षम बनाता है। सह-संस्कृति के बाद, कोशिकाओं को एक साथ एकत्र और संसाधित किया जाता है और प्रत्येक प्रजाति के लिए विशिष्ट पेप्टाइड प्रोफाइल के आधार पर बायोइन्फॉर्मेटिक्स रूप से अलग किया जाता है। यह संक्रमण के दौरान मेजबान-रोगजनक संबंधों के परस्पर क्रिया को परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। प्रयोग से पहचाने गए प्रोटीन की संख्या शुरुआती सामग्री, नमूना तैयारी, ढाल लंबाई, एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन और बायोइन्फॉर्मेटिक वर्कफ्लो पर निर्भर करती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम आम तौर पर, 1,500 सी नियोफॉर्मन प्रोटीन और 6,500 होस्ट प्रोटीन के साथ प्रयोग से लगभग 8,000 प्रोटीन की पहचान करते हैं। डेटासेट के प्रसंस्करण के बाद, हम अपने विश्लेषण(चित्रा 2 ए)को चलाने वाले महत्वपूर्ण कारकों का निरीक्षण करने के लिए एक प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) साजिश उत्पन्न करते हैं। यहां, हम डेटा के बीच अलगाव का सबसे बड़ा घटक गैर संक्रमित नमूनों बनाम संक्रमित है, जैसा कि हम प्रायोगिक डिजाइन (घटक 1, ७९.८%), और नमूनों की एक दूसरी विशिष्ठ विशेषता जैविक परिवर्तनशीलता (घटक 2, ५.७%) से आशा करेंगे । इसके बाद, यूक्लिडियन डिस्टेंस समूहों द्वारा पदानुक्रमित क्लस्टरिंग के साथ संयुक्त एक पियर्सन सहसंबंध नमूनों को समूहों और प्रतिकृति(चित्रा 2B)के बीच परिवर्तनशीलता की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाता है । हमारे विश्लेषण में, हमने संक्रमित बनाम गैर-संक्रमित नमूनों की अलग क्लस्टरिंग देखी और 95-96% से लेकर प्रजनन क्षमता को दोहराने, प्रतिकृति के बीच अच्छी प्रजनन क्षमता का प्रतिनिधित्व किया। अंत में, हम एक छात्र के टी-टेस्टको एक बेंजामिन-होचबर्ग झूठी खोज दर (एफडीआर)(पी-वैल्यू≤ 0.05) का उपयोग करके कई परिकल्पना परीक्षण के लिए सही करते हैं; एफडीआर = 0.01; s0 = 1) गैर संक्रमित नियंत्रण(चित्रा 2C)की तुलना में संक्रमण के दौरान बहुतायत में महत्वपूर्ण अंतर के साथ प्रोटीन की पहचान करने के लिए । यहां, हम बहुतायत में महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ ७६० प्रोटीन की पहचान, ८६ के साथ ११७ मेजबान प्रोटीन सहित एक महत्वपूर्ण कमी दिखा रहा है और 31 संक्रमण पर एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखा । विशेष रूप से, हम संक्रमण के दौरान अपेक्षित फंगल प्रोटीन की बहुतायत में महत्वपूर्ण वृद्धि का भी निरीक्षण करते हैं। इन आंकड़ों के साथ, सिलिको लक्षण वर्णन में नेटवर्क मैपिंग सहित बाद के विश्लेषण, और अनुवर्ती प्रयोगों को डेटा को मान्य करने और उग्रता के लिए मेजबान प्रतिक्रिया को रेखांकित आणविक तंत्र का पता लगाने के लिए किया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: सी नियोफॉर्मन सेसंक्रमित मैक्रोफेज के विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो। वर्कफ़्लो सी नियोफॉर्मन या गैर-संक्रमित नियंत्रणों से संक्रमित मैक्रोफेज के संग्रह से शुरू होता है। प्रोटीन यांत्रिक और रासायनिक व्यवधान द्वारा निकाले जाते हैं, जिसके बाद कमी और एल्किलेशन, एसीटोन वर्षा, और एंजाइमेटिक पाचन होता है। पेप्टाइड्स C18 स्टेज सुझावों पर शुद्ध होते हैं, जो उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी से अलग होते हैं, इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण के अधीन होते हैं, और एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर पर मापा जाता है। सार्वजनिक रूप से उपलब्ध बायोइन्फॉर्मेटिक्स प्लेटफार्मों, मैक्सक्विंट (एंड्रोमेडा के साथ) और पर्सियस14, 15, 16में डेटा कोसंसाधित,विश्लेषण और कल्पना कियाजाताहै। जैविक चौगुनी में किए गए प्रयोग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मैक्रोफेज कोशिकाओं के सी नियोफॉर्मन्स संक्रमण के लिए प्रतिनिधि डेटा। (ए)प्रमुख घटक विश्लेषण संक्रमित बनाम गैर-संक्रमित मैक्रोफेज (घटक 1, 79.8%), और जैविक प्रतिकृति (घटक 2, 5.7%) के क्लस्टरिंग के बीच अंतर को दर्शाता है। (ख)पियर्सन सहसंबंध का हीट मैप नमूनों (संक्रमित बनाम गैर-संक्रमित) के क्लस्टरिंग को दिखाने और प्रजनन क्षमता (>95%) को दोहराने के लिए यूक्लिडियन डिस्टेंस द्वारा पदानुक्रमित क्लस्टरिंग द्वारा प्लॉट किया गया । (ग)ज्वालामुखी की पहचान की प्रोटीन की साजिश । ब्लू = बहुतायत में महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ कवक प्रोटीन; काले = बहुतायत में महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ मैक्रोफेज प्रोटीन। छात्र का टी-टेस्ट(पी-वैल्यू≤ 0.05), एफडीआर = 0.01; s0 = 1. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में मैक्रोफेज कोशिकाओं को तैयार करना और कोशिकाओं को न्यूनतम व्यवधान के साथ प्रोटीन प्रसंस्करण के लिए सह-संस्कृति नमूनों का संग्रह शामिल है। संग्रह से पहले कोशिकाओं के अनावश्यक लाइसिस को रोकने के लिए पालनकारी मैक्रोफेज कोशिकाओं को धीरे और सावधानी से हटाने, धोने, आग लगाने और हटाने के चरणों को करना महत्वपूर्ण है। प्रयोग के लिए सही एमओआई की स्थापना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि अत्यधिक उच्च एमओआई के साथ अनुमान लगाने से तेजी से मैक्रोफेज सेल की मृत्यु हो सकती है और एमएस के लिए नमूनों को एकत्र करने और प्रसंस्करण करने में कठिनाई हो सकती है । इसके विपरीत, कम एमओआई संख्या कम फगोसाइटोस्ड फंगल कोशिकाओं और जैविक प्रणाली में फंगल प्रोटीन का सीमित पता लगाने के लिए नेतृत्व करेंगे । ऐसी सीमाओं को दूर करने के लिए, हम अलग-अलग एमओआई के साथ परीक्षण प्रयोग करने की सलाह देते हैं, जो सेल डेथ परख (जैसे, एलडीएच क्वांटिफिकेशन) द्वारा समर्थित होते हैं ताकि फंगल कोशिकाओं की संख्या को परिभाषित किया जा सके जो मेजबान प्रतिक्रिया शुरू करते हैं लेकिन संग्रह से पहले मेजबान कोशिकाओं को नहीं मारते हैं। प्रयोगों के लिए, हम संक्रमण से जुड़े फंगल प्रोटीन की पहचान करने का लक्ष्य रखते हैं, जिसमें अत्यधिक प्रचुर मात्रा में मेजबान प्रोटीन के बीच फंगल प्रोटीन का पर्याप्त रूप से पता लगाने के लिए उच्च एमओआई (100:1) की आवश्यकता होती है। हम नियमित रूप से पूरे प्रयोग करने से पहले मेजबान सेल मृत्यु पर MOI प्रभाव का आकलन करने के लिए मैक्रोफेज साइटोटॉक्सीसिटी का प्रदर्शन करते हैं। मैक्रोफेज के साथ सी नियोफॉर्मेंस कोशिकाओं के इनक्यूबेशन का समय भी महत्वपूर्ण है क्योंकि फंगल कोशिकाओं में बड़े पॉलीसैकराइड्स कैप्सूल हो सकते हैं और इसलिए, मैक्रोफेज को चपेट में लेने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है। हम उल्लिखित प्रयोग के लिए 3 घंटे के समय इनक्यूबेशन सह-संस्कृति का उपयोग करने के लिए चुनते हैं, क्योंकि हमें इस समय बिंदु पर फंगल प्रोटोम का अच्छा कवरेज मिला और मेजबान प्रतिक्रिया का 'स्नैप-शॉट' प्रदान किया जा सके; हालांकि, शोधकर्ताओं ने पहले और बाद के समय अंक का पता लगाने और निरीक्षण कैसे समय कवक और मेजबान प्रोटीन उत्पादन को प्रभावित करता है इच्छा हो सकती है । वैकल्पिक रूप से, रोगनीकरण के लिए मैक्रोफेज को भड़काना17, 18की प्रक्रिया की सहायता के लिए किया गया है।

नमूना संग्रह के लिए, यदि नमूनों पर तुरंत कार्रवाई नहीं की जा रही है तो तरल नाइट्रोजन में ठंड फ्लैश करने से नमूनों में मौजूद प्रोटीज द्वारा प्रोटीन के अवांछित क्षरण को रोकने में मदद मिलेगी । इसके अलावा, एमएस-आधारित प्रोटेओमिक विश्लेषणों के लिए, प्रयोग शुरू करने से पहले नाइट्रिल दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों को धोने के माध्यम से धूल या केराटिन (जैसे, त्वचा और बाल कोशिकाओं) से संदूषण की क्षमता सीमित होनी चाहिए। इसके अलावा, ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल सह-संस्कृति नमूना सेट के लिए विशिष्ट हैं, लेकिन प्रोटीन निष्कर्षण वर्कफ्लो अनुकूलन के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसा कि आवश्यक19,20है। कार्यप्रवाह को संशोधित करने और विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए अनुकूलन के अवसरों में चयनित यांत्रिक और रासायनिक व्यवधान तकनीकें, एंजाइमेटिक पाचन की अवधि और तापमान और नमूनों को अलग करना शामिल है। उदाहरण के लिए, सी नियोफॉर्मन कोशिकाओं का लाइसिस आमतौर पर यांत्रिक मनका पिटाई द्वारा किया जाता है; हालांकि, हमने जांच के बाद प्रोटेमकवरेज में वृद्धि देखी है और इसलिए, संक्रमित कोशिकाओं19, 21,22के यांत्रिक व्यवधान के लिए इसकी सिफारिश करें । उदाहरण के लिए, पेप्टाइड के नमूनों को उच्च पीएच अंश या आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी द्वारा एलिकोट में विभाजित करने से नमूना जटिलता कम हो सकती है और मास स्पेक्ट्रोमीटर9पर कवरेज की गहराई में सुधार हो सकता है। इसके अलावा, लगभग 8,000 होस्ट और फंगल प्रोटीन की पहचान करने के लिए कवरेज की गहराई को प्राप्त करने के लिए, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, क्यूएक्सएक्टिव एक्सप्लोरिस, फ्यूजन लुमोस, टिम्सटोफ प्रो)।

संक्रमण के दौरान प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एलएफक्यू का उपयोग एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स12के लिए एक विश्वसनीय और लागत प्रभावी दृष्टिकोण है। यह अतिरिक्त नमूना प्रसंस्करण चरणों की आवश्यकता के बिना सापेक्ष बहुतायत से प्रोटीन की मात्रा को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, विश्लेषण प्रयोग के पूरा होने के बाद किया जाता है, सार्वभौमिक अनुप्रयोगों और एक लचीला अध्ययन डिजाइन करने के लिए खुद को उधार देता है। हालांकि, एलएफक्यू की सीमाओं में इंस्ट्रूमेंटेशन समय में वृद्धि शामिल है क्योंकि नमूनों को क्रमिक रूप से चलाया जाना चाहिए और संयुक्त नहीं किया जा सकता है, नमूनों के बीच तुलनीयता चुनौतीपूर्ण हो सकती है, और लापता मूल्यों को बदलने के लिए आरोपण की आवश्यकता उच्च23हो सकती है। प्रोटीन बहुतायत की मात्रा के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण मेटाबोलिक (जैसे, सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग) और रासायनिक (जैसे, मिलकर बड़े टैग) लेबलिंग तकनीकों, जो नमूनों के संयोजन के लिए उपकरण समय को कम करने की अनुमति, नमूनों के बीच विश्वसनीय तुलनीयता प्रदान करते हैं, और आमतौर पर कम लापता मूल्यों के लिए नेतृत्व24,25शामिल हैं । हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोणों को अतिरिक्त नमूना हैंडलिंग और प्रसंस्करण चरणों, गीले प्रयोगशाला प्रयोग जटिलता और समय में वृद्धि की आवश्यकता होती है, साथ ही एक निश्चित प्रयोगात्मक डिजाइन की आवश्यकता होती है। प्रस्तावित प्रयोगों के लिए इष्टतम मात्राकरण विधि चुनने के लिए, उपयोगकर्ताओं को अध्ययन डिजाइन और नमूनों की तुलनीयता, गीली प्रयोगशाला जटिलता और डेटा विश्लेषण, साथ ही इंस्ट्रूमेंटेशन समय की उपलब्धता और लागत पर विचार करना चाहिए।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल की नवीनता एक ही प्रयोग में मेजबान और रोगजनक दोनों दृष्टिकोण से प्रोटेम में परिवर्तन को परिभाषित करने की क्षमता है। दोनों प्रोटेम के कवरेज की गहराई रोगजनक संक्रमण कैसे शुरू करता है और मेजबान रक्षा में कैसे प्रतिक्रिया करता है, इस बारे में नई अंतर्दृष्टि को सक्षम बनाता है। विशेष रूप से, दृष्टिकोण पूरे सेल के संक्रमण पर केंद्रित है; हालांकि, संक्रमण के लिए उप-प्रोटियोम्स या विभाजित प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करने के अवसर स्थानिक स्थानीयकरण तकनीकों (जैसे, अपकेंद्रित्र, संवर्धन, लेबलिंग)26, 27के संयोजन के माध्यम से मौजूद हैं । यहां, हम मैक्रोफेज और फंगल रोगजनक, सी नियोफॉर्मन केबीच बातचीत का विस्तार करते हैं; हालांकि, दृष्टिकोण सार्वभौमिक है, और जैविक प्रणालियों की एक विविध सरणी के बीच बातचीत के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने हाल ही में नेत्र केराटिटिस28, 29, 30के मुरीन मॉडल से प्राप्त न्यूट्रोफिल की सामान्य और साइट-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को उजागर करने के लिए इसीतरहके कार्यप्रवाह का उपयोग किया। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न इंफ्फोम डेटासेट को मेजबान कोशिकाओं की उपस्थिति में परिवर्तित बहुतायत के साथ प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक रोगजनक के इन विट्रो प्रोटेम और स्राव प्रोफाइलिंग के साथ एकीकृत किया जा सकता है। इस तरह के प्रोटीन, संक्रमण से जुड़े प्रोटीन के रूप में संदर्भित, आगे लक्षण वर्णन के लिए ज्ञात और उपन्यास उग्रता कारकों की अधिकता प्रदान करते हैं, लौकिक विनियमन, स्थानीयकरण, और मेजबान के साथ प्रत्यक्ष प्रोटीन प्रोटीन बातचीत सहित । कुल मिलाकर, उल्लिखित एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो सार्वभौमिकता और समझ के साथ एक ही प्रयोग में मेजबान और रोगजनक के बीच जटिल संबंधों की जांच करने का एक नया अवसर प्रदान करता है जो आमतौर पर उपलब्ध नहीं होता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के संचालन के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स सॉल्यूशंस इंक के डॉ जोनाथन क्रिगर को धन्यवाद देते हैं, साथ ही प्रयोगात्मक सेट-अप और पांडुलिपि प्रतिक्रिया के साथ उनकी सहायता के लिए गेड्स-मैकएलिस्टर समूह के सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं। लेखकों के वित्तपोषण का समर्थन स्वीकार करते हैं, भाग में, बैंटिंग रिसर्च फाउंडेशन से - जारिस्लोस्की फैलोशिप डिस्कवरी अवार्ड, न्यू फ्रंटियर्स रिसर्च फंड - एक्सप्लोरेशन (एनएफएफएफई-2019-00425), और जेजी.M के लिए कनाडाई फाउंडेशन फॉर इनोवेशन (जेईएलएफ 38798), साथ ही एनएसईआरसी कनाडा ग्रेजुएट स्कॉलरशिप - बी.B के लिए मास्टर्स और ग्रेजुएट ओंटारियो स्कॉलरशिप और क्वीन एलिजाबेथ II ग्रेजुएट स्कॉलरशिप इन साइंस एंड टेक्नोलॉजी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fisher Scientific BP152-1 Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 174888
6-well cell culture plate ThermoFisher Scientific 140675
Acetonitrile, MS grade Pierce TS-51101
Acetic Acid Sigma Aldrich 1099510001
Acetone Sigma Aldrich 34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC) ThermoFisher Scientific A643-500 Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System Fisher Scientific 13-717-300 Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin 3M Empore 3M2215
Cell Scrapers VWR 10062-906 Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator Eppendorf 07-748-15
Complete Filtration Unit VWR 10040-436
Conical falcon tubes (15 mL) Fisher Scientific 05-539-12
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0861 Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 10566016
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 12483020 Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375 Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system ThermoFisher Scientific LC140 Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer ThermoFisher Scientific 726042
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich I6125 Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes Eppendorf 13-698-794
MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge Eppendorf 13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns ThermoFisher Scientific ES803
Perseus Software http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline VWR CA12001-676 Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay ThermoFisher Scientific  23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL) Fisher Scientific 13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix Fisher Scientific 14955235
Probe sonciator ThermoFisher Scientific 100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693159001
Sodium dodecyl sulfate ThermoFisher Scientific 28364 20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop) ThermoFisher Scientific ND-2000
STAGE tipping centrifuge Sonation STC-V2
Thermal Shaker VWR NO89232-908
Trifluoroacetic acid ThermoFisher Scientific 85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade Pierce A40007 Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath Bransonic A89375-450 Stored in cold room (4C)
Urea Sigma Aldrich U1250-1KG Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth BD Difco BM20

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References

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