Summary
Здесь мы представляем протокол для профиля взаимодействия между хозяином и патогеном во время инфекции масс-спектрометрии на основе протеомии. В этом протоколе используется количественная оценка без меток для измерения изменений в изобилии белка как хозяина (например, макрофагов), так и патогена (например, неоформанов Cryptococcus)в одном эксперименте.
Abstract
Технологические достижения массовой спектрометрии (МС) на основе количественной протеомии открывает много неоткрытых путей для анализа глобального протеома организма в различных условиях. Эта мощная стратегия, применяемая к взаимодействию микробных патогенов с желаемым хозяином, всесторонне характеризует обе точки зрения на инфекцию. В этом документе описывается безымянная количественная оценка (ЛФЗ) инфекции криптококковых неоформанов, грибкового преподавательского внутриклеточного патогена, который является возбудителем смертельной болезни криптококкоза, в присутствии увековеченных клеток макрофага. В протоколе подробно изготовительная методика приготовления белка как для патогенных, так и для клеток млекопитающих в рамках одного эксперимента, что приводит к соответствующему представлению пептида для анализа жидко-хроматографии (LC)-MS/MS. Высокая пропускная способность общего характера ЛФЗ позволяет широкий динамический диапазон идентификации белка и количественной оценки, а также передачи в любой принимающей патогенной инфекции настройки, сохраняя крайнюю чувствительность. Метод оптимизирован для каталогизации обширных, объективных профилей изобилия белка патогена в инфекционно-имитирующих условиях. В частности, метод, продемонстрированные здесь, предоставляет важную информацию о патогенезах C. neoformans, таких как производство белка, необходимого для вирулентности, и определяет критически важные белки-хозяина, реагирующие на микробное вторжение.
Introduction
Распространенность инвазивных грибковых инфекций значительно возрастает и коррелирует с неприемлемо высокими показателями смертности, чаще всего сообщается у людей с иммунодефицитной предрасположенностью1. Криптококковые неоформаны – это пресловутый оппортунистический грибковый патоген, способный к внутриклеточному выживанию в клетках макрофага хозяина. Неадекватное противогрибковое вмешательство приводит к грибковому распространению и опасным для жизни проявлениям криптококкового менингита и менингоэнцефалита2,3. Глобальное повышение иммунокомпромиссного статуса потребовало параллельного увеличения использования противогрибковых препаратов, при котором многие грибковые виды, в том числе C. neoformans, все больше развивалисьсопротивление к 4,5,6. Поэтому крайне важно внедрить надежные и эффективные технологии для ответа на жизненно важные биологические вопросы, касающиеся ответных мер принимающей стороны на оборону и микробного патогенеза.
Новая эра технологического прогресса в масс-спектрометрии (МС), включая генерацию мощных вычислительных и биоинформатических трубопроводов, обеспечивает основу для интегративного видения для масштабного анализа исследованийхост-патогенов 7,8. Обычный патогенез-управляемый протеомный анализ обычно профилирует мнение инфекции с точки зрения хозяина или патогена, включая комплексные методологии, такие как профилирование корреляции белка, хроматография сродства в сочетании с протеомикой, и interactomics9. Исследования вирулентности опасных патогенов в принимающей системе имеют огромное клиническое значение; однако применение двойного перспективного анализа в одном эксперименте ранее считалось недостижимым. Например, точка зрения патогена к инфекции часто перегружены весьма обильные белки хозяина в результате снижения чувствительности для обнаружения низкоо изобилия грибковыхбелков 7. Кроме того, высокая сложность выборки предлагает многим целям исследовать в одной экспериментальной системе и оказывается сложной задачей для выяснения механизмов действия для конкретного патогенного белка.
Протеомика снизу вверх является популярным методом MS, который позволяет управляемой подготовки образца, в котором пептиды генерируются последовательности конкретных энзиматических пищеварения следуют жидкие хроматографии разделения, идентификации и количественной оценки MS10,11. Здесь мы представляем метод, демонстрирующий стратегию приобретения, зависящая от данных, направленную на достижение беспристрастного охвата протеома на основе инфекции или «инфекции». В частности, без этикетки количественной оценки (LF) проливает зависимость от химических или метаболических этикеток для надежной и точной идентификации изменений уровня белка через несколько протеомов, снижение обработки образцови обработки шаги 12,13. Это универсальное применение допрашивает произведенные белки в данный момент в клетке, независимой от ожидаемого производства белка; таким образом, новые идеи могут быть обнаружены, которые имеют решающее значение для инфекции.
Рабочий процесс, описанный в настоящем, оптимизирован для изучения изменений уровня белка C. неоформанов во время инфекционно-мимикряющих состояний с иммунными клетками хозяина(рисунок 1). Вместо того, чтобы полагаться на изоляцию и разделение типов клеток, этот подход извлекает хозяина и патогена протеом вместе, и использует биоинформатическое разделение с использованием двух конкретных организмов баз данных для различения видового производства белка. Этот метод дает преимущества для неограниченного числа образцов, которые будут обработаны без дополнительных дорогостоящих подготовительных шагов, необходимых в изотопных исследованиях маркировки или фракциоции. Кроме того, этот рабочий процесс поддерживает оптимизированные протоколы извлечения белка, переносяные в широкий спектр грибковых и бактериальных патогенов, способных нацеливаться и заражать иммунные клетки хозяина. В целом, в этом протоколе излагаются шаги для завершения беспристрастной извлечения белка и обработки образцов для MS с высоким разрешением, а затем данные и статистический анализ, способный обеспечить богатые знания грибковых белков, важных для инфекции в сочетании с всеобъемлющим профилированием ответной меры защиты хозяина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Увековеченная линия макрофагов, полученных из мышей BALB/c, была использована для следующего протокола, утвержденного Протоколом об использовании животных Университета Гвельфа 4193. Примечательно, что другие штаммы мышей или другие источники увековеченных клеток могут быть применены к изложенному протоколу с достаточным тестированием для оптимизации подробных параметров. Следующий протокол будет перемещаться по шагам, начиная с замороженного флакона клеток макрофагов. Клетки хранятся в 10% FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота), 1% L-глутамина и 5% Пен/Стреп (Пенициллин-Стрептомицин) смесь DMEM (Dulbecco модифицированный eagle Medium) и 20% DMSO (диметилсульфсид).
1. Культивирование неоформанцев С.
- Используя запас глицерола, полоса wildtype C. neoformans штамм (H99) на дрожжи экстракт пептон декстрозы (YPD) агар пластины для изоляции одиночных колоний.
- Инкубировать на ночь в течение 16 ч при 37 градусов по Цельсию в статическом инкубаторе.
- Выберите одну колонию штамма и культуры wildtype C. neoformans в 5 мл бульона YPD в слабо ограниченной пробирке 10 мл. Выполните в четыре раза.
- Инкубировать на ночь в течение 16 ч при 37 градусов по Цельсию в трясущимся инкубаторе при 200 об/мин.
- На следующий день субкультуры каждой ночной культуры в 1:100 разбавления в 3 мл бульона YPD.
- Измерьте оптические значения плотности (OD600nm)грибковой культуры для определения фазы среднего журнала. В зависимости от спектрофотометра штамм wildtype C. neoformans достигает фазы среднего входа, обычно следуя инкубации от 6 до 8 ч в YPD с общими значениями OD600nm в диапазоне от 1,0 до 1,5.
- Как только клетки достигают фазы среднего журнала, возьмите алициты грибковых клеток в чистую микроцентрифугную трубку 1,5 мл и разбавьте 1:100 в стерильный 1x фосфат буферный солевой раствор (PBS). Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
2. Культивирование клеток макрофагов
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рабочая среда стерилизована до работы клеточной культуры.
- Подготовка среды клеточной культуры
- Антибиотик дополнением среды: Добавить 10% FBS (фетальной сыворотки крупного рогатого скота), 1% L-глутамин и 5% Пен / Strep (Пенициллин-Стрептомицин) смесь DMEM (Dulbecco модифицированный иглы среднего). Фильтруемую среду через полную систему фильтров на 0,2 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
- Антибиотическая среда: Следуйте идентичному протоколу, но опустить смесь Pen/Strep.
- Посев макрофагов клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотическая среда (2.1.1.) должна быть подогрета до 37 градусов по Цельсию до работы клеточной культуры.- Оттепель флакон макрофаг клеток быстро в 37 градусов по Цельсию шарик ванны.
- Вымойте клетки замораживания раствора путем повторного перерасхода клеток в 1 мл антибиотиков дополненной среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные меры предосторожности необходимы для обеспечения клетки не лизировать из-за суровых трубопроводов. - Перенесите повторно наемные клетки в стерильную трубку 15 мл.
- Пеллетные клетки путем центрифугирования при температуре 400 × в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно удалите супернатант с серологическим пипеткой или вакуумным аспиратором.
- Аккуратно повторное использование гранул в 10 мл антибиотиков дополняется средой.
- Аккуратно пипетка resuspended клетки в 60 х 15 мм клеточной культуры обработанные блюдо.
- Инкубировать блюдо при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 на ночь.
- Первоначальный проход клеток макрофагов
ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные запасы клеток, как правило, содержат от 5 до 10 миллионов клеток на флакон (приблизительно 1 мл). В последующий день, макрофаг клетки, которые пережили протокол посева будет придерживаться нижней части блюда клеточной культуры и будет готов к проходить.- Теплая среда, дополненная антибиотиками (шаг 2.1.1) до 37 градусов по Цельсию до работы клеточной культуры. Обеспечить стерилизацию рабочей среды до начала работы клеточной культуры. Визуализуйте клетки с помощью светового микроскопа, чтобы обеспечить соблюдение и здоровье клеток.
- Удалить клеточной культуры среды из блюда либо с серологической пипетки или вакуумного аспиратора.
- Аккуратно добавьте 5-7 мл стерильной комнатно-температурной PBS (фосфат-буферный солевой раствор) к блюду 60 х 15 мм.
- Аккуратно наклоните блюдо, чтобы вымыть прилипаемые клетки.
- Удалите PBS с помощью серологического пипетки или вакуумного аспиратора.
- Добавьте 1 мл холодного PBS (хранится при температуре 4 градусов по Цельсию) в клетки, наклоните блюдо, чтобы распределить PBS по всем клеткам, и дайте посидеть при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Отпустите клетки путем нежного выстукивания тарелки, pipetting холодного PBS против клеток, или путем использование скребка клетки.
- Добавьте в блюдо 9 мл мЛ с антибиотиками.
- В новое блюдо калибра 60 х 15 мм добавьте 9 мл свежей среды, дополненной антибиотиками, и 1 мл повторно нажатых клеток из оригинального блюда.
- После того, как количество желаемых проходных пластин были заполнены, перерасход клеток из оригинального блюда могут быть отброшены.
- Инкубировать новое блюдо в настройках, упомянутых выше (шаг 2.2.8).
- Выполните последующее протекание, когда клетки достигли 70-80% слияния (примерно каждые 2 дня в зависимости от используемой клеточной линии и среды).
ПРИМЕЧАНИЕ: Макрофаг клетки должны пройти как минимум пять раз до инфекционных экспериментов. В зависимости от клеточной линии, инфекционные эксперименты должны быть выполнены от 25 до 30 проходов. После 25 до 30 проходов, клетки должны быть заморожены или отброшены. Раздел 2.4 или 2.5 может быть выбран на основе экспериментальных планов. Раздел 2.4 будет использоваться для следующих разделов.
- Посев клеток макрофагов до заражения
- Выполните этапы протокола прохода от 2.3.1 до 2.3.7.
- Использование гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток определяет плотность клеток (клетки/мл).
- Передача 0,3 х 106 макрофаговых клеток в один колодец пластины 6-хорошо клеточной культуры.
- Отрегулируйте общий объем хорошо до 1 мл с использованием антибиотико-дополненной среды (шаг 2.1.1).
- Повторите шаги 2.4.3 и 2.4.4 до тех пор, пока не будут заполнены 8 скважин (4 скважины заполнены двумя отдельными пластинами).
- Дополнительно заполните оставшиеся две скважины 1 мл комнатно-температурного PBS для поддержания уровня влаги во время инкубации.
- Разрешить клеткам расти в условиях инкубации, упомянутых в шаге 2.2.8 для 2 d до инфекции.
- Посев макрофагов в день заражения
- Выполните этапы протокола прохода от 2.3.1 до 2.3.7.
- Использование гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток определяет плотность клеток (клетки/мл).
- Семя 1.2 x 106 макрофаговых клеток в один колодец пластины культуры клеток 6-хорошо.
- Отрегулируйте общий объем хорошо до 1 мл с использованием антибиотиков-дополненной среды (2.1.1).
- Повторите 2.4.3 и 2.4.4 до тех пор, пока не будут заполнены 8 скважин (4 скважины заполнены двумя отдельными пластинами).
- Дополнительно заполните оставшиеся две скважины 1 мл комнатно-температурного PBS для поддержания уровня влаги во время инкубации.
- Инкубационые клетки в условиях, упомянутых в шаге 2.2.8 для 3 ч, чтобы клетки придерживались скважин.
3. Инфекция клеток макрофагов с C. неоформанами
ПРИМЕЧАНИЕ: По достижении 70-80% слияния, будет около 1,2 х 106 клеток макрофагов на колодец. Для достижения желаемой множественности инфекции (МВД) 100:1, 1,2 х 108 грибковых клеток необходимы для каждой реакции. Культуры должны быть установлены соответствующим образом в биологической четверки.
DISCLAIMER: МВД 100:1 достигло желаемых результатов в нашей исследовательской группе и предназначено как предложение читателям. Более низкий MOI может потребоваться для более инфекционных штаммов C. neoformans или для менее устойчивых линий клеток макрофага. Проверка инфекции (раздел 3.5) может быть использована для определения идеального МВД для конкретных комбинаций C. neoformans - макрофагов.
- Подготовка грибковых клеток
- Следуйте шагу 1 для роста C. неоформанов до фазы среднего журнала.
- Собирайте и центрифугировать клетки по 1500 х г в течение 10 мин, аккуратно промыть гранулы стерильной комнатной температурой PBS и повторить в общей сложности три моет.
- Повторное использование клеток в среде культуры клеток, свободных от антибиотиков (шаг 2.1.2) для достижения концентрации 1,2 х 108 клеток/мл.
- Подготовка клеток макрофагов
- Визуализуй каждую хорошо в 6-хорошо пластины для обеспечения того, чтобы клетки достигли 70-80% слияния. Кроме того, клетки могут быть измерены для достижения приблизительно 1,2 х 106 макрофагов клеток на колодец.
- Следуйте шагам от 2.3.1 до 2.3.4.
- Со-культура клеток C. neoformans и макрофагов
- Добавьте 1 мл ресс-клеток C. neoformans (шаг 3.1.3) к 4 скважинам, содержащим клетки макрофагов, подготовленные в разделе 3.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимых пластин необходимо будет вычислить до начала эксперимента. Добавьте 1 мл среды, свободной от антибиотиков (шаг 2.1.2), в пустые скважины. - Разрешить ячейки инкубировать в условиях, перечисленных (шаг 2.2.8) в течение 3 ч.
- Удалите среду клеточной культуры из пластины либо с серологическим пипеткой, либо с помощью вакуумного аспиратора.
- Аккуратно добавьте 1 мл стерильной комнатной температуры PBS.
- Аккуратно наклоните пластину, чтобы вымыть неприложенные или нефагоцитонные внеклеточные клетки C. neoformans.
- Удалите PBS с помощью серологического пипетки или вакуумного аспиратора, повторите в общей сложности три моет. Повторите еще 3,3,4 - 3,3,5 раза.
- Добавьте 1 мл ресс-клеток C. neoformans (шаг 3.1.3) к 4 скважинам, содержащим клетки макрофагов, подготовленные в разделе 3.2.
- Неинфицированные макрофаги
- Аналогичным образом, используйте 4 скважины из 6 скважин пластины, чтобы служить выступать в качестве макрофагов только образцы. Добавьте к этим скважинам 1 мл среды, свободной от антибиотиков (шаг 2.1.2).
- Повторите шаги от 3.3.2 до 3.3.6.
- Проверка инфекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя анализ цитотоксичности, можно измерить уровень инфицирования. В следующем протоколе будет подчеркнуто применение продукта цитотоксичности для измерения выброса LDH (лактат дегидрогеназы). Другие продукты цитотоксии также могут быть использованы.- Подготовка C. неоформанцев инфекции клеток макрофагов
- Повторяет шаги 1, 2 и 3 (до 3,5). Анализ LDH может быть выполнен в три раза, если предпочтительнее.
- Следуя шагу 3.3.6, добавьте 1 мл среды, свободной от антибиотиков (2.1.2) к каждому хорошо в 6-хорошо пластины.
- Повторите шаги 2.4.3 и 2.4.4 до тех пор, пока не будут заполнены 3 скважины плюс 3n скважины (где n измеряется количество измеренных точек времени).
- Инкубационые клетки при условиях, перечисленных на шаге 2.2.8.
- В выбранных точках времени (например, 1, 3, 6, 12 и 24 часа) собирают супернатант для измерения выпуска LDH в соответствии с инструкциями производителя
- В то же время, неинфицированные клетки макрофагов будут лизированы до определенного значения для максимальной цитотоксичности.
- Рассчитайте цитотоксичность следующим образом:
- Подготовка C. неоформанцев инфекции клеток макрофагов
4. Сбор образцов
- Со-культура и неинфицированная коллекция макрофагов
- Добавьте 1 мл холодного PBS в клетки (от 3.3.6 и 3.4.2) и дайте посидеть при комнатной температуре в течение 1 мин.
- Освобождение клеток от пластины путем мягкого постукивания пластины или нежный трубопровод холодный PBS против клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовый скребок следует избегать, поскольку это может вызвать лиз клеток. - Pipette resuspended клетки в трубку 15 mL.
- Центрифуга клетки при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, и удалить супернатант.
- Процесс клетки (как подробно в шаге 5) немедленно или вспышки заморожены в жидком азоте и хранятся при -80 градусов по Цельсию для более поздней обработки.
5. Сотовый протеом
ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточное количество лиза должно быть оптимизировано для анализируемого типа клетки (т.е. количество циклов и амплитуд зависит от размера гранул клетки и процент мощности модели зонда sonicator).
- Зараженный лиз клеток макрофагов
- Resuspend гранулированное клетки (шаг 4.1.5) в 300 йл 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), состоящий из свежерапустенного ингибитора протеазы коктейль таблетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один ингибитор протеазы коктейль таблетки добавляется в 10 мл ледяного 100 мМ Tris-HCl (рН 8,5) до начала эксперимента. - Зонд sonicate клетки в ледяной ванне в течение 15 циклов 30 с и 30 с выключенным, чтобы подлить клетки.
- Центрифуга клетки кратко в течение 30 с на 400 х г, осторожны, чтобы не сформировать гранулы, просто чтобы удалить жидкость по бокам труб с последующим переводом образца в 2 мл Lo-bind микроцентрифуг трубки.
- Добавьте 1:10 объем 20% SDS к конечной концентрации 2%.
- Добавьте 1:100 объемом 1 м дитиотрейтол (МТТ) к конечной концентрации 10 мм и тщательно смешайте образец с помощью труб, а затем инкубации на тепловом нагревательном блоке при 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин при агитации 800 об/мин. Далее, прохладно до комнатной температуры (охлаждение может быть сделано на льду).
- Добавьте 1:10 объемом 0,55 М иодоацетамида (IAA), чтобы получить окончательную концентрацию 55 мМ и тщательно перемешать образец с помощью труб. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут.
- Добавьте 100% ацетон, чтобы получить окончательную концентрацию 80% ацетона и хранить образец на ночь при -20 градусов по Цельсию, чтобы осаждать белки.
- Resuspend гранулированное клетки (шаг 4.1.5) в 300 йл 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), состоящий из свежерапустенного ингибитора протеазы коктейль таблетки.
- Белковое пищеварение
- На следующий день, собирать осадонные гранулы центрифугации в течение 10 минут при 10000 х г и 4 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы с 500 МКЛ 80% ацетона. Повторите в общей сложности две стирки. Воздушные сухие гранулы при комнатной температуре после мытья.
- Resolubilize белковые гранулы в 100 йл 8 M мочевины/40 мМ HEPES, чтобы обеспечить полную solubilization, вихрь или sonicate в ледяной водяной бане в течение 15 циклов 30 с и 30 с выключен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Корректировка объема мочевины/HEPES определяется размером осажденных клеточных гранул, если изменения происходят, все объемы ниже по течению должны быть соответствующим образом скорректированы. - Количественная оценка концентрации белка с использованием анализа белка (например, анализ белка BCA) в соответствии с инструкциями производителя и корректировка для фонового измерения путем пустой нормализации с 8 M мочевины/40 мМ HEPES.
- Добавьте 300 мкл бикарбоната аммония 50 мм, чтобы получить окончательную концентрацию 2 М мочевины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможность нормализовать концентрацию белка для измерений вниз по течению, предложил переварить 100 мкг белка и хранить оставшиеся непереваренные образца путем флэш-замораживания в жидком азоте, а затем хранить при -20 градусов по Цельсию в краткосрочной перспективе, или при -80 градусов по Цельсию в долгосрочной перспективе. - Добавьте 2:50 (v/w) соотношение ферментов к белку трипсина/Lys-C протеазной смеси на льду и аккуратно коснитесь трубки, чтобы перемешать, инкубировать на ночь при комнатной температуре.
- После инкубации прекратите пищеварение, добавив 1:10 раствор остановки тома (20% ацетонитриля, 6% трифтороацетической кислоты) и образцы центрифуги при 10 000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Соберите супернатант(состоит из переваренных пептидов)и выбросьте любой гранулированного мусора или осадка.
- Пептидное опреснирование
- Активируйте наконечник C18 Stop And Go Extraction (STAGE) (состоящий из 3 слоев смолы C18 в наконечнике пипетки 200 йл), добавляя 100 мкл из 100% ацетонитрила и центрифуги при 1000 х г в течение 2 минут.
- Эквилибрировать наконечник C18 STAGE, добавив 50 МКЛ буфера B (80% (v/v) ацетонитриле, 0,5% (v/v) уксусной кислоты) и центрифуги при 1000 х г в течение 2 мин.
- Equilibrate C18 STAGE наконечник, добавив 200 йл буфера А (2% (v/v) ацетонитрил, 0,1% (v/v) трифтороацетической кислоты, 0,5% (v/v) уксусной кислоты) и центрифуги на 1000 х г в течение 3-5 мин.
- Добавьте 50 мкг переваренного образца на кончик C18 STAGE и центрифугу при 1000 х г в течение 3-5 мин, или до тех пор, пока образец не прошел через спиновую колонку. Вспышка заморозить оставшийся усваиваемый образец в жидком азоте и хранить при -20 градусов по Цельсию, пока это необходимо.
- Вымойте наконечник C18 STAGE с 200 йл буфера А и центрифуги при 1000 х г в течение 3-5 мин.
- Добавьте 50 йл буфера B к кончику C18 STAGE и центрифуге при 500 x g в течение 2 мин. Соберите элеваторные пептиды в трубках ПЦР 0,2 мл.
- Высушите эластиированные пептиды в вакуумной центрифуге в течение 30-40 минут на максимальной скорости. Полностью высушенные образцы могут храниться при комнатной температуре или при температуре -20 градусов по Цельсию до обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные и опресненные пептиды являются подходящими образцами для установки масс-спектрометрии для обработки и могут быть отправлены при температуре окружающей среды.
6. Массовая спектрометрия
- Восстановленные пептиды в буфере A и измеряют концентрацию, необходимую для введения пептидов от 1,5 до 3 мкг на столб MS. Количество выборки будет зависеть от приборов.
- Используйте заранее определенный градиент ацетонитрила (приблизительно 5-60%) в 0,5% уксусной кислоты в течение желаемого времени (например, 2 ч) отделить пептиды от высокой производительности жидкой хроматографии, а затем ионизации электроспрей в масс-спектрометр.
- Приобретайте сканирование MS с помощью масс-спектрометра высокого разрешения в режиме получения данных(м/з от 300 до 1650).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процент градиента и длина определяются экспериментом и пользователем. Точные настройки масс-спектрометра зависят от приборов, экспериментов и предпочтений пользователей.
7. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: MS данные могут быть обработаны с помощью многочисленных трубопроводов биоинформатики. В этом протоколе мы описываем обработку с помощью общедоступных платформ Max'u'3 и Perseus, но рекомендуем отдельным пользователям оценить биоинформатические инструменты, подходящие для анализа, предпочтения и использования.
- Загрузите необработанные файлы данных (непосредственно с инструмента MS) с помощью программного обеспечения Max'u'ut. Определите белки по измененным параметрам поиска Max'u'u'ut; минимум два уникальных пептида, необходимых для идентификации белка с использованием целевого приманки подход для ложной скорости открытия 1%, осуществлять этикетки свободной количественной оценки с сопоставлением между работает, включить организмы FASTA файл, полученный из базы данных UniProt (т.е., Cryptococcus неоформанов H99, Mus musculus) для выявления и количественной оценки нынешних пептидов с поисковой системой Andromeda. Проконсультируйтесь с публичными онлайн-инструментами Max'u'ut для подробных учебников (см. таблицу материалов).
- Загрузите выходной файл Max'u'.txt)) в Персей.
- Фильтровые ряды, содержащие потенциальные ложные срабатывания и загрязняющие вещества, а также модифицированные только пептидами участка с помощью строк фильтра на основе категорического столбца.
- Преобразование значений данных пошкале журнала 2.
- Создание групп наборов данных путем предоставления категорической аннотации к строкам.
- Набор данных фильтра по действительным значениям для определения отрезка для обнаружения белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для строгого и надежного анализа предлагается идентификация на 50%. Например, если было обработано четыре репликации, то будет выбрано минимальное число из трех действительных значений. - Если предпочтительнее, вменять данные, заменяя недостающие значения из обычного распределения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вмененые значения оптимизированы на основе нормального распределения и обеспечивают случайную интенсивность ЛФЗ для замены амплуа "NaN" для имитации типичных измерений изобилия. Это вменение обеспечивает платформу для вниз по течению статистического анализа, которые требуют количественных данных. - Добавьте аннотации к белковым рядам (например, названия белков, термины генной онтологии).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рабочий процесс Perseus, генерируемый в настоящее время надежная основа для дальнейшей биоинформатической обработки, статистического анализа и визуализации данных, обратитесь к общественности Perseus онлайн инструменты для подробных учебников (см. таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, изложенный выше, позволяет определить и количественно определить белки, полученные как из грибкового патогена, C. неоформанов, и хозяина, макрофаг клеток, в одном эксперименте. После совместной культуры клетки собираются и обрабатываются вместе и биоинформатически разделены на основе пептидных профилей, характерных для каждого вида. Это мощный подход для определения взаимодействия отношений между принимающей стороной и патогеном во время инфекции. Количество белков, выявленных в ходе эксперимента, зависит от исходного материала, подготовки образца, длины градиента, приборов MS и биоинформатического рабочего процесса. Используя описанный здесь протокол, мы обычно выявляем около 8000 белков из эксперимента с 1500 белками C. neoformans и 6500 белками-хозяинами. После обработки наборов данных мы создаем график основного анализа компонентов (PCA) для наблюдения за критическими факторами, влияющими на наш анализ(рисунок 2A). Здесь мы наблюдаем, что самый большой компонент разделения между данными заражен по сравнению с неигражаемыми образцами, как мы и ожидали бы от экспериментальной конструкции (компонент 1, 79,8%), а второй отличительной чертой образцов является биологическая изменчивость (компонент 2, 5,7%). Далее корреляция Пирсона в сочетании с иерархической кластеризацией евклидового расстояния группирует образцы и позволяет количественно оценить изменчивость между репликациями(рисунок 2B). В нашем анализе мы наблюдали отчетливую кластеризацию инфицированных и неигнулируемых образцов и воспроизводимость в диапазоне от 95-96%, что представляет собой хорошую воспроизводимость среди репликаций. Наконец, мы выполняем тест студента t-test,исправленный для нескольких тестов гипотез, используя скорость ложного открытия Бенджамини-Хохберга (FDR)(p-значение≤ 0.05; ФДР - 0,01; s0 No 1) для выявления белков со значительными различиями в изобилии во время инфекции по сравнению с неидентифициальной системойконтроля (рисунок 2C). Здесь мы определяем 760 белков со значительными изменениями в изобилии, в том числе 117 белков-хозяина с 86, показывающих значительное снижение и 31, показывающих значительное увеличение инфекции. Примечательно, что мы также наблюдаем значительное увеличение обилия грибковых белков, как и ожидалось во время инфекции. С помощью этих данных проводятся последующие анализы, включая сетевое картирование, в характеристике силико и последующие эксперименты для проверки данных и изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе реакции хозяина на вирулентность.
Рисунок 1: Масса спектрометрии основе протеомики рабочего процесса для анализа макрофагов, инфицированных C. неоформанов. Рабочий процесс начинается со сбора макрофагов, зараженных неоформанами C. или неинъеганных элементов управления. Белки извлекаются в результате механических и химических нарушений, за которыми следуют уменьшение и алкилирование, осадки ацетона и энзиматическое пищеварение. Пептиды очищаются на кончиках C18 STAGE, разделены высокопроизводительностью жидкой хроматографии, подвергаются ионизации электроспрей и измеряются на масс-спектрометре высокого разрешения. Данные обрабатываются, анализируются и визуализируются на общедоступных биоинформатических платформах Max'u'ut (с Андромедой) и Perseus14,15,16. Эксперименты, выполненные в биологическом четырехкратном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные данные по инфекции макрофагов C. неоформановых клеток. (A)Основной анализ компонентов демонстрирует различие между инфицированными и неигнестряными макрофагом (компонент 1, 79,8%) и кластеризацией биологических репликаций (компонент 2, 5,7%). (B)Тепловая карта корреляции Пирсона, построенная иерархической кластеризацией на евклидовом расстоянии, чтобы показать кластеризацию образцов (инфицированных против неиглянных) и воспроизвести воспроизводимость (No95%). (C)Вулкан участок выявленных белков. Синие и грибковые белки со значительными изменениями в изобилии; черные и макрофаговые белки со значительными изменениями в изобилии. Студенческий т-тест(p-значение≤ 0,05), ФДР - 0,01; s0 и 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в протоколе включают подготовку клеток макрофагов и сбор образцов совместной культуры для обработки белка с минимальным нарушением клеток. Важно выполнять шаги мытья, инокулации и удаления клеток макрофагов адепта мягко и тщательно, чтобы предотвратить ненужныйлиз клеток перед сбором. Создание правильного МВД для эксперимента также имеет решающее значение, как инокулирование с чрезмерно высоким МВД может привести к быстрой смерти клеток макрофага и трудности в сборе и обработке образцов для MS. И наоборот, низкие номера МВД приведет к меньшему количеству фагоцитосных грибковых клеток и ограниченное обнаружение грибковых белков в биологической системе. Чтобы преодолеть такие ограничения, мы рекомендуем проводить тестовые эксперименты с различными MOIs, поддерживаемые анализами смерти клеток (например, количественная оценка LDH), чтобы определить количество грибковых клеток, которые инициируют ответ хозяина, но не убивают клетки-хозяина до сбора. Для экспериментов, мы стремимся определить связанных с инфекцией грибковых белков, требующих высокого MOI (100:1) для адекватного обнаружения грибковых белков среди весьма обильных белков хозяина. Мы регулярно выполняем анализы цитотоксии макрофагов для оценки воздействия МВД на смерть клеток-хозяина до проведения всего эксперимента. Сроки инкубации C. неоформановых клеток с макрофагами также имеет решающее значение, как грибковые клетки могут обладать большими капсулами полисахаридов и, следовательно, макрофаг требует больше времени для поглощения. Мы выбираем использовать совместное время инкубации культуры 3 ч для изложенного эксперимента, как мы нашли хорошее освещение грибковых proteome в это время точки и обеспечить "снимок" принимающей ответ; однако, исследователя могут пожелать исследовать более раньше и более поздно пункты времени и наблюдать как время влияет на грибковое и продукцию протеина хозяина. Кроме того, грунтовка макрофаг для опсонизации была выполнена, чтобы помочь фагоцитическогопроцесса 17,18.
Для сбора проб, если образцы не обрабатываются немедленно вспышки замораживания в жидком азоте поможет предотвратить нежелательную деградацию белков протеасами, присутствующими в образцах. Кроме того, для протеомных анализов на основе MS, потенциал для загрязнения от пыли или кератина (например, кожи и волосковых клеток) должны быть ограничены за счет использования нитриловые перчатки, лабораторные пальто, и мытье всех поверхностей с 70% этанола до начала экспериментов. Кроме того, протоколы, изложенные выше, специфичны для набора образцов совместной культуры описаны, но могут быть изменены для оптимизации рабочего процесса извлечениябелка, по мере необходимости 19,20. Возможности для изменения рабочего процесса и оптимизации для конкретных типов клеток включают выбранные методы механических и химических нарушений, продолжительность и температуру энзиматичного пищеварения, а также разделение образцов. Например, лиз клеток C. neoformans обычно выполняется механическим избиением бисера; тем не менее, мы наблюдали увеличение охвата протеом после зондирования sonication и, следовательно, рекомендовать его для механического нарушенияинфицированных клеток 19,21,22. Например, фракционные образцы пептидов в алициты с помощью высокой фракционные рН или хроматографии исключения размера могут снизить сложность выборки и улучшить глубину покрытия намасс-спектрометре 9. Кроме того, для достижения глубины охвата для определения приблизительно 8000 принимающих и грибковых белков требуется система масс-спектрометрии высокого разрешения (например, «Эксактивный Exploris», Fusion Lumos, timsTOF Pro).
Использование ЛФЗ для количественной оценки изменений уровня белка во время инфекции является надежным и экономически эффективным подходом для протеомии на основе MS12. Это позволяет количественной оценки белков относительным изобилием без необходимости дополнительных этапов обработки образцов. Кроме того, анализ проводится после завершения эксперимента, кредитование себя универсальных приложений и гибкий дизайн исследования. Тем не менее, ограничения ЛФЗ включают увеличение времени приборов, поскольку образцы должны быть запущены последовательно и не могут быть объединены, сопоставимость между образцами может быть сложной задачей, а необходимость в вменению для замены отсутствующих значений может бытьвысокой 23. Альтернативные подходы для количественной оценки изобилия белка включают метаболические (например, стабильная маркировка изотопов аминокислот в клеточной культуре) и химические (например, тандемные метки массы) методы маркировки, которые позволяют комбинировать образцы для сокращения времени инструмента, обеспечивают надежную сопоставимость между образцами и обычно приводят к менееотсутствующим значениям 24,25. Однако такие подходы требуют дополнительных этапов обработки и обработки образцов, увеличения сложности и времени лабораторных экспериментов, а также требуют фиксированной экспериментальной конструкции. Чтобы выбрать метод количественной оценки, оптимальный для предлагаемых экспериментов, пользователям следует рассмотреть вопрос об проектировании и сопоставимости образцов, сложности мокрой лаборатории и анализа данных, а также наличии и стоимости приборов.
Новизна представленного протокола заключается в способности определять изменения в протеоме как с точки зрения хозяина, так и с точки зрения патогенов в одном эксперименте. Глубина охвата обоих протеом позволяет по-новому понять, как возбудитель инициирует инфекцию и как хозяин реагирует в защиту. Примечательно, что подход фокусируется на инфекции всей клетки; однако возможности для определения субпротеом или разрозненных реакций на инфекцию существуют в сочетании с методами пространственной локализации (например, центрифугация, обогащение,маркировка) 26,27. Здесь мы подробно взаимодействия между макрофагами и грибковых патогенов, C. неоформанов; однако этот подход является универсальным и может применяться к взаимодействию между различными биологическими системами. Например, недавно мы использовали аналогичный рабочий процесс, чтобы выявить общие и конкретные ответы на сайт нейтрофилов, полученных из модели муринаглазного кератита 28,29,30. Кроме того, наборы данных о инфекции, полученные в результате этого Протокола, могут быть интегрированы с протеомом in vitro и секремным профилированием патогена для обнаружения белков с измененным изобилием в присутствии клеток-хозяек. Такие белки, называемые связанными с инфекцией белками, обеспечивают множество известных и новых факторов вирулентности для дальнейшей характеристики, включая временную регуляцию, локализацию и прямые белково-белковые взаимодействия с хозяином. В целом, изложенный рабочий процесс протеомики на основе MS предоставляет новую возможность исследовать сложные отношения между хозяином и патогеном в одном эксперименте с универсальностью и пониманием, которые обычно не доступны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят д-ра Джонатана Кригера (Jonathan Krieger) из Bioinformatics Solutions Inc. за эксплуатацию масс-спектрометра для репрезентативных экспериментов, а также членов группы Геддес-Макалистер за помощь в экспериментальной настройке и обратной связи с рукописями. Авторы признают поддержку финансирования, в частности, от Banting Research Foundation - Jarislowsky стипендий Discovery Award, Научно-исследовательский фонд «Новые границы» (NFRFE-2019-00425) и Канадский фонд инноваций (JELF 38798) для J.G.M., а также стипендия выпускников NSERC Canada – магистры и стипендии для выпускников Онтарио для B.B., а также стипендия королевы Елизаветы II в области науки и техники для A.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
