Summary
Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.
Abstract
Il metodo di delipidazione dell'idrogel tissutale (CLARITY), originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth, è stato modificato e ampiamente utilizzato per l'immunosociezione e l'imaging di campioni cerebrali spessi. Tuttavia, questa tecnologia avanzata non è ancora stata utilizzata per retine a montaggio intero. Sebbene la retina sia parzialmente trasparente, il suo spessore di circa 200 μm (nei topi) limita ancora la penetrazione di anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione. Qui, abbiamo adattato il metodo CLARITY per le retine di topo a montaggio intero polimerizzandole con un monomero di acrilammide per formare un idrogel nanoporous e quindi cancellandole in solfato di dodecil di sodio per ridurre al minimo la perdita di proteine ed evitare danni ai tessuti. Le retine elaborate da CLARITY sono state immunosostenibili con anticorpi per neuroni retinali, cellule gliali e proteine sinaptiche, montate in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione e immagini. I nostri dati dimostrano che CLARITY può migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e dell'imaging per neuroni retinali e cellule gliali in preparazione a montaggio intero. Ad esempio, la risoluzione 3D delle strutture astronomie fini e dendritiche delle cellule di amacrina dopaminergica è stata molto migliorata da CLARITY. Rispetto alle retine integrali non lavorate, CLARITY può rivelare l'immunostaining per proteine sinaptiche come la proteina a densità postsinaptica 95. I nostri risultati mostrano che CLARITY rende la retina più otticamente trasparente dopo la rimozione dei lipidi e preserva le strutture fini dei neuroni retinali e delle loro proteine, che possono essere utilizzate regolarmente per ottenere l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retinali e delle loro strutture subcellulari in preparazione a montaggio intero.
Introduction
La retina vertebrata è forse la parte più accessibile del sistema nervoso centrale (SNC), e serve come un modello eccellente per studiare lo sviluppo, la struttura e la funzione del cervello. Cinque classi di neuroni nella retina sono distribuite in tre strati nucleari separati da due strati plexiformi. Lo strato nucleare esterno (ONL) è costituito da fotorecettori classici (aste e coni) che convertono la luce in segnali elettrici. I segnali elettrici vengono elaborati dai neuroni nello strato nucleare interno (INL), comprese le cellule bipolari, orizzontali e amacrine, e quindi trasmessi alle cellule gangliari retiniche (RGC) nello strato cellulare ganglio (GCL). Le RGC sono i neuroni di uscita della retina, con gli assoni che si proiettano al cervello per contribuire alla funzione visiva che forma immagini e non forma immagini. Inoltre, tre tipi di cellule gliali (cellule di Muller, astroglia e microglia) forniscono nutrienti ai neuroni e proteggono i neuroni dai cambiamenti dannosi nel loro ambiente extracellulare.
Una sottopopolazione specializzata di cellule amacrine produce e rilascia dopamina, un importante neuromodulatore nel SNC, riconfigurando i circuiti neurali retinali durantel'adattamento della luce 1,2. Le cellule amacrine dopaminergiche (DAC) hanno una caratteristica unica dei profili morfologici. I loro somata si trovano nell'INL prossimale con dendriti che ramificano nella parte più distale dello strato plexiforme interno (IPL). I processi simili ad axon dei DAC sono non meelini, sottili e lunghi, scarsamente ramificati e sopportano variacosità (i siti di rilascio della dopamina). Formano un plesso denso con dendriti nell'IPL, incluse strutture simili ad anelli attorno ai somi delle cellule di amacrina AII. Gli assoni attraversano anche l'INL verso l'OPL, formando un percorso centrifugo attraverso la retina3. Abbiamo dimostrato che i processi DAC esprimono recettori in risposta al rilascio di glutammato dai neuroni presnaptici, comprese le cellule bipolari e le cellule gangliari retiniche intrinsecamente fotosensibili (IPRGC)4,5,6. Tuttavia, non è chiaro se i recettori del glutammato esprimono sugli assoni, sui dendriti o entrambi poiché sono tagliati in sezioni retiniche verticali e non possono essere distinti l'unodall'altro 5,6. L'immunostaining deve essere effettuato in retine a montaggio intero per rivelare la ramificazione tridimensionale dei DAC e la presenza di recettori del glutammato sui compartimenti subcellulari. Sebbene la retina sia relativamente trasparente, lo spessore di una retina a montaggio intero del topo è di circa 200 μm, il che limita la penetrazione degli anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione a causa della diffusione della luce tissutale. Per superare questi limiti, abbiamo adattato il metodo di delipidazione dell'idrogel tissutale compatibile immunosottenibile (CLARITY) sviluppato di recente per sezioni cerebrali spesse alle retine di topomontate su intero 7.
Il metodo CLARITY è stato originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth per l'immunosociezione e l'imaging di campioni cerebralispessi 7. Utilizza un detergente forte, il solfato di dodecil di sodio (SDS) e l'elettroforesi per rimuovere i componenti lipidici (che causano lo scattering della luce dei tessuti), lasciando le proteine e gli acidi nucleici in posizione. I lipidi rimossi vengono sostituiti con un'impalcatura trasparente composta da monomeri idrogel come l'acrilammide per sostenere la restante struttura proteica. Il tessuto eliminato può essere etichettato tramite immunoistochimica e immaginato con una profondità di penetrazione della luce notevolmente aumentata attraverso il tessuto (fino a diversi millimetri sotto la superficie del tessuto). Da allora, il metodo CLARITY è stato ottimizzato e semplificato da diversi gruppidi ricerca 8,9,10. Un protocollo CLARITY modificato utilizza una tecnica di compensazione passiva per evitare i possibili danni ai tessuti prodotti dall'elettroforesi per lo sgombero di tutto il cervello e di altri organiintatti 11. Tuttavia, questo metodo non è ancora stato applicato alle retine a montaggio intero. Qui, abbiamo adattato la tecnica PASSIVA CLARITY per retine a montaggio intero per renderle più trasparenti per l'immunoistochimica e l'imaging. Abbiamo scoperto che la maggior parte delle proteine retiniche testate sono state conservate durante questo processo per l'immunoistochimica. Utilizzando la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, siamo stati in grado di visualizzare i neuroni retini attraverso lo spessore di circa 200 μm dall'ONL al GCL nelle retine a montaggio intero.
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Protocol
La cura del topo e tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo le linee guida del National Institutes of Health per gli animali da laboratorio e sono state approvate dagli Institutional Animal Care and Use Committees della Oakland University (protocollo n. 18071).
NOTA: I nomi delle soluzioni e le loro composizioni sono elencati nella tabella 1.
1. Preparazione dei tessuti
- Eutanasia del topo con un sovradosaggio di CO2, seguito da lussazione cervicale.
- Enucleare gli occhi con forcep curve e trasferirli in una piccola piastra di Petri con 0,1 M PBS(Tabella 1). Al microscopio a dissezione, colpire un piccolo foro lungo la giunzione cornea-sclera con un ago. Trasferire al 4% di paraformaldeide (PFA) per 1 ora.
- Trasferire l'occhio su un piatto con PBS. Al microscopio a dissezione, utilizzare le forbici di dissezione per tagliare tutto intorno alla giunzione cornea-sclera. Rimuovere la cornea e l'obiettivo. Tagliare alla base del nervo ottico e staccare con cura la sclera con le forcep per isolare la retina.
- Fare quattro piccoli tagli uniformemente intorno alla retina e utilizzare un pennello a punta fine immerso in PBS per posarlo piatto (lato GCL verso il basso) in una forma simile a un trifoglio su un piccolo taglio quadrato dalla carta filtrante di nitrocellulosa per stabilizzare la retina.
- Trasferire la retina utilizzando le forcelle per tenere l'angolo della carta nitrocellulosa (senza toccare la retina montata) e posizionarla in una piastra da 48 po 'con 4% di PFA per 1 ora.
- Trasferire la carta filtrante e la retina in un pozzo con PBS e lavare (3 volte per 5 minuti ciascuno).
- Trasferire ad A4P0(tabella 1)e incubare durante la notte a 4 °C con agitazione delicata.
- Pipetta olio vegetale nel pozzo per coprire completamente la soluzione A4P0. Incubare in un bagno d'acqua a 40 °C per 3 ore senza tremare.
- Lavare (3 volte per 5 minuti ciascuno) in PBS, assicurandosi che tutto l'olio sia stato risciacquato. Se necessario, utilizzare una pipetta per rimuovere con cura l'olio rimanente dalla parte superiore del pozzo prima dell'ultimo risciacquo.
- Incubare in SDS al 10% a 40 °C per due giorni con tremori delicati. Sostituire SDS con una soluzione fresca il secondo giorno.
- Trasferire la carta da filtro e la retina in PBS con Triton-X-100 (PBST, Tabella 1)e lavare (5x per 1,5 h ciascuno).
- Conservare a 4 °C in PBST con azide di sodio allo 0,01% (NaN 3 ) o passaredirettamenteall'immunosocienza.
2. Corrispondenza dell'indice di immunostaining e rifrazione
- Rimuovere la retina dalla carta da filtro staccarla delicatamente con un pennello a punta fine in PBST.
- Incubare la retina nell'anticorpo primario (Tabella 2) diluita in soluzione di blocco(tabella 1)per 2 giorni a 40 °C con tremori delicati.
- Lavare (5x, 1,5 h ciascuno) in PBST.
- Incubare con gli anticorpi secondari appropriati(tabella 3)diluiti in soluzione di blocco per 2 giorni a 40 °C con scuotimenti delicati e proteggere dalla luce attraverso il resto della procedura.
- Lavare (5x, 1,5 h ciascuno) in tampone fosfato 0,02 M (cfr. tabella 1).
- Incubare in soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione a base di sorbitolo (sRIMS, vedi tabella 1) a 40 °C durante la notte con tremori delicati.
3. Montaggio
- Delineare un coverslip in vetro da 18 mm x 18 mm x 1,5 mm con un pennarello permanente a punta fine per contrassegnare un bordo quadrato sul retro di uno scivolo al microscopio di vetro.
- Capovolgere lo scivolo e utilizzare una siringa per tracciare il confine con una sottile linea di grasso siliconico sulla parte anteriore dello scivolo, lasciando un piccolo spazio in un angolo per evitare l'eccesso di soluzione di montaggio.
- Trasferire la retina al centro dell'area delimitata e disporre con un pennello a punta fine in modo che giace piatto con il lato fotorecettore contro lo scivolo di vetro.
- Pipetta circa 60 μL di sRIMS in modo che copra la retina appiattita e si estenda ad un angolo del recinto, facendo attenzione che la retina rimanga piatta e in posizione.
- Applicare il copripavimenti partendo dall'angolo con lo sRIMS e abbassarlo lentamente fino a tocchire il grasso su tutti i lati, evitando la formazione di bolle d'aria.
- Posizionare una pila di 3 coverlips su ciascun lato della retina montata come distanziale. Utilizzare il bordo lungo di un'altra diapositiva per premere verso il basso il coperchio in modo che il supporto sia piatto e uniforme.
- Conservare gli scivoli piatti a 4 °C fino all'imaging.
4. Imaging
- Campioni di immagini su un microscopio a fluorescenza convenzionale o su un microscopio confocale (Tabella dei materiali). Iniziare posizionando la diapositiva sullo stadio del microscopio e individuando il campione.
NOTA: Se viene utilizzato un microscopio obiettivo invertito, posizionare lo scivolo capovolto sul palco, assicurando prima che le aree esposte dello scivolo siano chiare da tutto il grasso siliconico e la soluzione di montaggio. - Per ottenere immagini impilate a Z di campioni co-etichettati, prima concentrati sul segnale in ogni canale singolarmente e imposta il tempo di esposizione o la velocità di scansione, rispettivamente per la fluorescenza o i microscopi confocali.
- Impostate l'intervallo per la pila z impostando manualmente il piano focale nella parte superiore e inferiore dell'intervallo desiderato oppure impostando il punto medio e quindi specificando un intervallo intorno al punto medio.
- Regolare le dimensioni del passo o il numero di sezioni come desiderato.
- Acquisisci l'immagine e salva il file originale, nonché esportalo come file TIFF o altro formato desiderato.
5. Analisi delle immagini
- Utilizzare il software di analisi delle immagini preferito (Table of Materials) per regolare la luminosità e il contrasto in ogni canale fino a ottenere una chiarezza ottimale sia nelle singole immagini che nel rendering tridimensionale dello stack z.
NOTA: Se la dimensione del passo selezionata è sufficientemente piccola, è possibile eseguire anche la deconvoluzione 3D per migliorare il segnale.
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Representative Results
Le retine modificate elaborate con CLARITY sono tessuti otticamente trasparenti.
Per formulare un metodo di compensazione dei tessuti compatibile con le applicazioni immunoistochimiche nella retina, fornendo al contempo un'adeguata delipidazione e mantenendo l'integrità strutturale delle proteine cellulari, abbiamo adattato il metodo di compensazione dei tessuti CLARITY alle retine di topo montate su intero. Siamo stati in grado di semplificare il protocollo e modificarlo per le retine a montaggio intero (vedi Protocollo). Dopo aver completato l'ibridazione dei tessuti, la compensazione e la corrispondenza degli indici di rifrazione, le retine elaborate con questo protocollo CLARITY modificato hanno mostrato una trasparenza ottica quasi completa su tutto lo spessore della retina (Figura 1A) rispetto alle retine di controllo non lavorate (Figura 1B). Questo risultato indica che questa modifica del protocollo CLARITY fornisce tessuto retina a montaggio intero sufficientemente cancellato.
Migliorata l'imaging 3D dei neuroni nelle retine elaborate CLARITY modificate.
Per valutare la qualità e la praticità della colorazione immunoistochimica offerta da questo metodo CLARITY modificato, abbiamo macchiato le retine trasformate CLARITY con vari anticorpi primari(tabella 2). Questi anticorpi segnano ogni tipo di cellula principale nella retina: fotorecettori a cono, cellule bipolari dell'asta, cellule amacrine, RGC e cellule gliali, nonché anticorpi contro proteine sinaptiche subcellulari. Ad eccezione del marcatore di attività cellulare fosfo-S6 (pS6), tutti gli anticorpi testati si sono dimostrati compatibili con CLARITY. Esempi tipici sono illustrati nella figura 2. Abbiamo eseguito la tripla etichettatura con anticorpi contro arrestin cono, tirosina idrossilasi (TH) e proteina legante RNA con splicing multiplo (RBPMS). Abbiamo preso una serie di immaginidi microscopiaconfocale z - stack dall'ONL al GCL. Le singole immagini mostravano i coni etichettati negli ONL (Figura 2A), nei DAC con etichetta TH nell'INL (Figura 2B) e nei RGC contrassegnati con RBPMS nella GCL (Figura 2C). Un'immagine sovrapposta ha rivelato la posizione relativa di questi neuroni su tutto lo spessore della retina (Figura 2D). Questi risultati suggeriscono che CLARITY può migliorare la qualità di molte colorazioni immunoistochimiche standard e rivelare chiaramente la struttura 3D dei neuroni su tutto lo spessore della retina in preparati a montaggio intero.
La CHIAREZZA modificata fornisce una migliore risoluzione 3D dei processi fini dei neuroni retini e delle proteine sinaptiche.
Abbiamo inoltre analizzato la colorazione TH nelle retine a montaggio intero elaborate da CLARITY (Figure 3A, B) e l'abbiamo confrontata con l'imaging ottenuto dalla preparazione standard a montaggio intero(figure 3C,D). Le immagini confocali mostrano che i dendriti e i processi simili ad assion dei DAC sono stati rivelati molto più chiaramente in una retina elaborata CLARITY (Figura 3A) che in una retina standard (Figura 3C). In particolare, i processi simili ad assion di DAC presentavano strutture ad anello più complete in una retina CLARITY (vedere un inserto nella figura 3A) che in una retina standard (vedere un inserto nella figura 3C). In particolare, le strutture ad anello di una retina CLARITY prelevate con microscopia a fluorescenza (Figura 3B) erano quasi identiche a quelle osservate con l'uso del confocale (Figura 3A). Inoltre, processi simili a axon correvano anche verso la retina esterna, che è stata osservata nelle immagini orientate alla X-Z (Figura 4A). Questi dati suggeriscono che CLARITY può essere utilizzato per identificare processi simili ad assione di DAC in retine a montaggio intero anche con l'uso della microscopia a fluorescenza convenzionale.
Quando la subunità del recettore AMPA GluA2 e la proteina della densità postsinaptica 95 (PSD-95) sono state esaminate nelle retine standard a montaggio intero, nessuna di esse è stata rilevata, probabilmente a causa della scarsa penetrazione di anticorpi contro queste proteine sinaptiche nella retina profonda. Per determinare se le retine elaborate da CLARITY consentono questi anticorpi alle proteine sinaptiche immunostain, tripliamo th etichettato TH con la subunità GluA2 e PSD-95. L'immunostaining contro GluA2 e PSD-95 ha mostrato una puncta distinta che rivela i singoli recettori AMPA contenenti GluA2 (Figura 4B) e i siti postinaptici putativi (Figura 4C), rispettivamente. Un'immagine sovrapposta mostrava alcuni puncta evidenti sui processi DAC (Figura 4D). Abbiamo immaginato un punto di colocalizzazione putativa con tutte e tre le macchie e l'abbiamo presentato in viste 3D (Figura 5). Da tutte e tre le viste, TH è colocalizzato chiaramente sia con GluA2 che con PSD-95(Figura 5 A-C). Questi risultati prospettiche 3D da retine integrali convalidano i nostri precedenti rapporti di espressione sinaptica dei recettori AMPA contenenti GluA2 sui processi DAC nelle fette retiniche verticali5,6.
Figura 1. CLARITY fornisce tessuto otticamente trasparente. Le retine del mouse a montaggio intero sono state elaborate con il metodo CLARITY modificato (vedi Protocollo) e l'intera retina è stata imageizzata con un microscopio a dissezione, sovrapposta su una griglia quadrata di 0,67 cm per mostrare la scala. A: Retina intera lavorata CON CHIAREZZA, con linee a griglia chiaramente visibili attraverso il tessuto trasparente. Le frecce delineano il posizionamento della retina. B: Retina di controllo non lavorata con CLARITY, fissata in PFA per 1 h e incubata in PBS. Le linee della griglia sono oscurate dalla relativa opacità del tessuto. Barra di scala: circa 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Migliorata l'imaging 3D dei neuroni attraverso lo spessore della retina nelle retine elaborate da CLARITY. Le retine CLARITY a montaggio intero sono state immunosostente con anticorpi contro coni arrestin, TH e RBPMS. Immagine rappresenta un rendering in volume 3D di un'immagine confocale impilata in z, visualizzata con un orientamento X-Z. A: Fotorecettori a cono (freccia) etichettati con cono arrestin (blu). Una leggera macchietta è visibile nella retina interna (punte di freccia), probabilmente a causa della colorazione dello sfondo. B: Soma DAC e dendriti (freccia) etichettati da TH (rosso). Le punte di freccia indicano i vasi sanguigni retini nella retina interna, visibili a causa dell'immunosocienza multi-etichetta. C: Somata RGC (freccia) etichettata da RBPMS (verde). Le punte delle frecce indicano vasi sanguigni retini visibili a causa dell'autofluorescenza e della colorazione non specifica dei vasi sanguigni. D: Immagine unita della colorazione tripla etichettata, rivelando il posizionamento relativo di questi neuroni attraverso lo spessore della retina, con fotorecettori a cono situati nello strato nucleare esterno, DAC nello strato nucleare interno e RGC nello strato cellulare ganglio. La scala della vista volume è contrassegnata con incrementi di 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. CLARITY rivela strutture fini di morfologia DAC. L'immunostaining TH è stato eseguito nelle retine a processo CLARITY (A e B) e standard (C e D). Le immagini impilate a Z sono state scattate utilizzando la microscopia confocale (A e C) e la microscopia a fluorescenza (B e D). Un inserto da un singolo piano ottico in ogni immagine evidenzia strutture simili ad anelli presumibilmente formate da processi simili ad assion. Le punte di freccia indicano somata DAC e molte strutture simili ad anelli sono visibili (gli esempi sono indicati dalle frecce) nel plesso denso di dendriti e processi simili ad assion rivelati nelle retine elaborate da CLARITY (A e B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. La CHIAREZZA modificata fornisce una migliore risoluzione 3D delle strutture dendritiche fini e delle proteine sinaptiche. La tripla immunostaining è stata eseguita nelle retine a montaggio intero elaborate da CLARITY con anticorpi contro TH, GluA2 e PSD-95. Un rendering del volume è stato ricostruito dall'imaging confocale impilato in z e presentato con un orientamento X-Z angolato. A: Somata DAC con etichetta TH (punte di freccia) nello strato nucleare interno e processi (frecce gialle) che si stratificano nello strato plexiforme interno distale (rosso). Le frecce bianche indicano processi centrifughi che si estendono verso la retina esterna. B: Espressione densa di punctato dei recettori AMPA contenenti GluA2 attraverso lo strato plexiforme interno (verde). La freccia indica l'autofluorescenza da un vaso sanguigno retinale. C: Puncta rivela siti post-sinaptici etichettati da PSD-95 nello strato interno di plessiforme (blu). Le frecce indicano vasi sanguigni, evidenti a causa dell'uso di un anticorpo monoclonale del topo contro psd-95. D: Immagine sovrapposta che dimostra la sovrapposizione dei processi DAC con etichetta TH con l'espressione di GluA2 e PSD-95. La scala della vista volume è contrassegnata con incrementi di 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Espressione sinaptica dei recettori AMPA contenenti GluA2 sui DAC. Un punto di colocalizzazione tripla putativa di TH, GluA2 e PSD-95 mostrato nella figura 4 è stato selezionato e studiato in 3D. A1 rappresenta un segmento di un processo DAC (rosso) nell'orientamento X-Z (A5). A2 e A3 mostrano un singolo punctum GluA2 (verde) e PSD-95 punctum (blu), rispettivamente, nello stesso orientamento. L'immagine unita (A4) dimostra la tripla colocalizzazione di TH, GluA2 e PSD-95 (freccia). B1-B4 mostra lo stesso punto di colocalizzazione (freccia) con orientamento Y-Z (B5). C1-C4 mostra la colocalizzazione dello stesso punto (freccia) nel piano X-Y (C5). La tripla colocalizzazione è chiaramente evidente in ogni orientamento. Barra di scala: 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| soluzione | composizione | Note |
| 0,1 M PBS | 137 mM NaCl | Regolare il pH a 7,4 |
| 26,8 mM KCl | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% di acrilammide | Preparare su ghiaccio, aliquota e conservare a -20 ºC |
| 0,25% VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | 0,1% (v/v) Tritone-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Soluzione di blocco | 2% NDS o 1% BSA | |
| 0,01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| Tampone fosfato 0,1 M | 11,93 g Na2HPO4/litro | Regolare il pH a 7,5 |
| 15,34 g NaH2PO4/litro | ||
| ddH2O | ||
| SRIMS | 70% sorbitolo | Regolare il pH a 7,5 con NaOH |
| 0,1% tra i 20 anni | ||
| 0,01% NaN3 | ||
| Tampone fosfato da 0,02 M | ||
La tabella 1. Composizione delle soluzioni.
| anticorpo | Hockey Club | ospite | diluizione | catalogo # | fornitore | ID registro Ab | bersaglio |
| Opsina sensibile al blu | +3 | Policlinico di capra | 1:1000 | Sport club 14363 | Biotecnologie di Santa Cruz | AB_2158332 | Cono S |
| Cono arrestin | +2 | Policlinico di coniglio | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | cono |
| Protein chinasi C alfa (PKC-α) | +3 | Policlinico di coniglio | 1:1000 | Sport club 208 | Biotecnologie di Santa Cruz | AB_2168668 | Cellula bipolare dell'asta |
| Proteina acida fibrillare gliale (GFAP) | +3 | Policlinico di capra | 1:500 | Sport club 6170 | Biotecnologie di Santa Cruz | AB_641021 | Astrocita |
| Tirosina idrossilasi (TH) | +3 | Policlinico ovino | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Cellula amacrina dopaminergica |
| Tirosina idrossilasi (TH) | +2 | Policlinico di coniglio | 1:500 | OPA1-04050 | Termoero pescatore | AB_325653 | Cellula amacrina dopaminergica |
| Colina acetiltransferasi (ChAT) | +1 | Policlinico di capra | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Cellula di amacrina starburst |
| Proteina legante l'RNA con splicing multiplo (RBPMS) | +1 | Policlinico di porcellino d'India | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Cellula gangliosa retinica |
| GluA2 | +3 | Policlinico di coniglio | 1:500 | AB1768 | EMD Millipore | AB_2247874 | Recettore AMPA impermeabile Ca2+ |
| GluA2 | +2 | Monoclonale del topo | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Recettore AMPA impermeabile Ca2+ |
| Proteina a densità postsinaptica 95 (PSD-95) | +3 | Monoclonale del topo | 1:1000 | 75-028 | NeuroMab | AB_2877189 | Siti sinaptici |
| Fosfo-S6 (pS6) | 0 | Policlinico di coniglio | 1:500 | 44-923G | Termoero pescatore | AB_2533798 | Indicatore di attività cella |
La tabella 2. Riepilogo degli anticorpi primari testati. Legenda IHC: +3 = colorazione coerente e altamente specifica; +2 = colorazione costantemente buona, sfondo minimo; +1 = buona colorazione, qualche sfondo; 0 = incompatibile con CLARITY.
| ospite | Specie bersaglio | coniugare | diluizione | fornitore |
| asino | Anti-pecore | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogeno |
| asino | Anti-pecore | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogeno |
| asino | Anti-coniglio | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogeno |
| asino | Anti-coniglio | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogeno |
| capra | Anti-coniglio | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogeno |
| asino | Anti-topo | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogeno |
| asino | Anti-topo | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogeno |
| asino | Anti-capra | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogeno |
| asino | Anti-capra | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogeno |
| capra | Porcellino d'India | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogeno |
La tabella 3. Riepilogo degli anticorpi secondari testati.
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Discussion
Modifica del protocollo CLARITY per retine a montaggio intero.
Abbiamo semplificato il protocollo CLARITY per ottenere un'adeguata polimerizzazione senza la necessità di una camera di evacuazione o essiccazione sottovuoto, come viene utilizzato nella maggior partedegli studi precedenti 7,9,11. Il processo di polimerizzazione è inibito dall'ossigeno, richiedendo che il campione sia isolato dall'aria durante la fase di polimerizzazione del protocollo. Tuttavia, piuttosto che degassare con azoto, abbiamo scoperto che coprire il campione con olio ha isolato sufficientemente il campione per consentire la polimerizzazione senza influire negativamente sul resto del protocollo dopo un risciacquo completo, come precedentementedocumentato 12. Abbiamo ulteriormente semplificato il protocollo con un metodo di compensazione passiva per limitare il rischio di doratura dei tessuti e danni alla struttura tissutale associati alla pulizia elettroforetica11. La radura passiva è accelerata da una delicata agitazione e da una temperatura elevata, consentendo la completa pulizia dei tessuti in soli due giorni. Durante questo periodo di tempo, si ottiene una delipidazione sufficiente per ottenere tessuto otticamente trasparente riducendo al minimo la perdita di proteine e altre biomolecole integranti alla struttura cellulare e alla colorazione immunoistochimica.
CLARITY preserva le proteine dei neuroni retinali e delle cellule gliali in preparati a montaggio intero.
I nostri risultati mostrano che quasi tutti gli anticorpi testati lavorano in retine elaborate CLARITY. Questi anticorpi segnano fotorecettori, cellule bipolari, cellule di amacrina, RGC e cellule gliali. Sebbene non siamo stati in grado di testare gli anticorpi per i sottotipi di ogni classe di neuroni retinali, i nostri risultati implicano che le retine elaborate CLARITY possono essere utilizzate per la maggior parte dei marcatori cellulari nella retina. Sebbene la maggior parte degli anticorpi che abbiamo testato possano anche immunostain neuroni retinali in retine lavorate non CLARITY, abbiamo scoperto che CLARITY ha permesso un'adeguata penetrazione degli anticorpi nel tessuto profondo della retina, fornendo una buona specificità di colorazione nello strato intermedio della retina. Inoltre, abbiamo scoperto che CLARITY ha migliorato la penetrazione della luce durante lo spessore della retina, riducendo la dispersione della luce e consentendo l'imaging ad alta risoluzione anche attraverso gli strati più profondi. Questi fattori contribuiscono a migliorare sia la colorazione che l'imaging delle retine a montaggio intero elaborate clarity rispetto all'IHC13standard non CLARITY. Lo sfondo ridotto e il miglioramento dell'imaging 3D e dei rendering del volume consentono un'indagine completa delle strutture cellulari in tutti gli strati attraverso lo spessore della retina.
CLARITY rivela processi fini e struttura sinaptica delle TAC nelle retine a montaggio intero.
I nostri risultati dimostrano che le strutture ad anello e i processi centrifuga dei DAC sono rivelati in CLARITY-processed meglio che nelle retine a montaggio intero non CLARITY. In particolare, l'immunostaining con tessuto trattato CLARITY consente una buona risoluzione di queste strutture fini anche con microscopia a fluorescenza standard senza la necessità di imaging confocale. Data l'importanza delle CCI nella funzione visiva, la preparazione CLARITY può essere utilizzata per studiare le strutture delle CCI nelle retine normali e i cambiamenti morfologici in condizioni di malattia.
Al momento dell'immunosottenzione per PSD-95 e GluA2 con tessuto standard wholemount, abbiamo osservato poca o nessuna etichettatura di queste strutture subcellulari negli strati profondi della retina, indicando una scarsa penetrazione degli anticorpi. L'applicazione del protocollo CLARITY consente una colorazione distinta di queste proteine negli strati interni della retina, indicando una migliore penetrazione degli anticorpi nel tessuto profondo. I nostri risultati mostrano che CLARITY consente il rilevamento di proteine sinaptiche su processi DAC in retine a montaggio intero, che si osserva normalmente nei preparati a fette verticali6. Poiché i processi simili all'assone non possono essere distinti dai dendriti nelle fette verticali, le retine a montaggio intero CLARITY offrono l'opportunità di determinare se gli input sinaptici ai DAC di altri neuroni come le cellule bipolari e gli IPRGC si verificano nei dendriti, nei processi simili all'assone osia 5,6. Poiché i recettori AMPA e le proteine PSD-95 sono ampiamente distribuiti in tutto l'IPL, l'espressione di queste proteine sui DAC è un ottimo esempio per le retine CLARITY da utilizzare per l'identificazione delle proteine sinaptiche in altri neuroni retinali.
Considerazioni, limitazioni e applicazioni future del protocollo CLARITY per retine a montaggio intero.
In primo luogo, i protocolli di polimerizzazione e compensazione per le retine a montaggio intero elaborate da CLARITY aggiungono diversi giorni al processo di preparazione dei tessuti. Tuttavia, il metodo è ancora reso altamente pratico dal fatto che retine chiarificato possono essere conservate in PBS contenente azide di sodio per un massimo di due settimane con una degradazione minima dei tessuti. In secondo luogo, è stata osservata una certa espansione del tessuto durante tutto il processo di compensazione, come documentato nelle precedenti applicazioni di CLARITY7,11. Tuttavia, la Corte ha riscontrato che la retina è tornata a dimensioni approssimativamente originali al momento dell'equilibrazione con la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. I potenziali cambiamenti minori nel volume dei tessuti potrebbero non causare distorsioni significative della struttura cellulare osubcellulare 7,11. In terzo luogo, quando si imaging campioni cerebrali più spessi, l'obiettivo del microscopio è spesso immerso direttamente nel supporto di montaggio per consentire la completa corrispondenza dell'indice di rifrazione dalla lente del microscopioattraverso il tessuto 12. Con campioni più sottili come la retina, abbiamo usato coverlips per il montaggio per rendere i campioni più lusinghieri e più anche per l'imaging. Gli effetti della rifrazione attraverso il coverslip sembrano essere minimi sull'imaging. In quarto luogo, alcune delle nostre immagini mostrano la colorazione non specifica dei vasi sanguigni perché non abbiamo perfuso l'intero animale con perfusione intracardiaca (suggerito per essere usato per evitare macchie non specifiche) prima di enucleare gli occhi. Infine, l'attuale protocollo adattato per i topi può essere utilizzato per retine di altre specie. In particolare, le retine di animali di grandi dimensioni come cani, maiali, cavalli e primati sono molto più spesse di quelle dei topi. Questo protocollo CLARITY potrebbe rendere le retine di questi animali più otticamente trasparenti dopo la rimozione dei lipidi e preservare le strutture fini dei neuroni retinali e delle loro proteine per l'immunosocienza.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Bing Ye, Nathan Spix e Hao Liu per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) e dall'Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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