Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing
Summary
Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l’imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.
Abstract
Il metodo di delipidazione dell’idrogel tissutale (CLARITY), originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth, è stato modificato e ampiamente utilizzato per l’immunosociezione e l’imaging di campioni cerebrali spessi. Tuttavia, questa tecnologia avanzata non è ancora stata utilizzata per retine a montaggio intero. Sebbene la retina sia parzialmente trasparente, il suo spessore di circa 200 μm (nei topi) limita ancora la penetrazione di anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l’imaging ad alta risoluzione. Qui, abbiamo adattato il metodo CLARITY per le retine di topo a montaggio intero polimerizzandole con un monomero di acrilammide per formare un idrogel nanoporous e quindi cancellandole in solfato di dodecil di sodio per ridurre al minimo la perdita di proteine ed evitare danni ai tessuti. Le retine elaborate da CLARITY sono state immunosostenibili con anticorpi per neuroni retinali, cellule gliali e proteine sinaptiche, montate in una soluzione di corrispondenza dell’indice di rifrazione e immagini. I nostri dati dimostrano che CLARITY può migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e dell’imaging per neuroni retinali e cellule gliali in preparazione a montaggio intero. Ad esempio, la risoluzione 3D delle strutture astronomie fini e dendritiche delle cellule di amacrina dopaminergica è stata molto migliorata da CLARITY. Rispetto alle retine integrali non lavorate, CLARITY può rivelare l’immunostaining per proteine sinaptiche come la proteina a densità postsinaptica 95. I nostri risultati mostrano che CLARITY rende la retina più otticamente trasparente dopo la rimozione dei lipidi e preserva le strutture fini dei neuroni retinali e delle loro proteine, che possono essere utilizzate regolarmente per ottenere l’imaging ad alta risoluzione dei neuroni retinali e delle loro strutture subcellulari in preparazione a montaggio intero.
Introduction
La retina vertebrata è forse la parte più accessibile del sistema nervoso centrale (SNC), e serve come un modello eccellente per studiare lo sviluppo, la struttura e la funzione del cervello. Cinque classi di neuroni nella retina sono distribuite in tre strati nucleari separati da due strati plexiformi. Lo strato nucleare esterno (ONL) è costituito da fotorecettori classici (aste e coni) che convertono la luce in segnali elettrici. I segnali elettrici vengono elaborati dai neuroni nello strato nucleare interno (INL), comprese le cellule bipolari, orizzontali e amacrine, e quindi trasmessi alle cellule gangliari retiniche (RGC) nello strato cellulare ganglio (GCL). Le RGC sono i neuroni di uscita della retina, con gli assoni che si proiettano al cervello per contribuire alla funzione visiva che forma immagini e non forma immagini. Inoltre, tre tipi di cellule gliali (cellule di Muller, astroglia e microglia) forniscono nutrienti ai neuroni e proteggono i neuroni dai cambiamenti dannosi nel loro ambiente extracellulare.
Una sottopopolazione specializzata di cellule amacrine produce e rilascia dopamina, un importante neuromodulatore nel SNC, riconfigurando i circuiti neurali retinali durantel’adattamento della luce 1,2. Le cellule amacrine dopaminergiche (DAC) hanno una caratteristica unica dei profili morfologici. I loro somata si trovano nell’INL prossimale con dendriti che ramificano nella parte più distale dello strato plexiforme interno (IPL). I processi simili ad axon dei DAC sono non meelini, sottili e lunghi, scarsamente ramificati e sopportano variacosità (i siti di rilascio della dopamina). Formano un plesso denso con dendriti nell’IPL, incluse strutture simili ad anelli attorno ai somi delle cellule di amacrina AII. Gli assoni attraversano anche l’INL verso l’OPL, formando un percorso centrifugo attraverso la retina3. Abbiamo dimostrato che i processi DAC esprimono recettori in risposta al rilascio di glutammato dai neuroni presnaptici, comprese le cellule bipolari e le cellule gangliari retiniche intrinsecamente fotosensibili (IPRGC)4,5,6. Tuttavia, non è chiaro se i recettori del glutammato esprimono sugli assoni, sui dendriti o entrambi poiché sono tagliati in sezioni retiniche verticali e non possono essere distinti l’unodall’altro 5,6. L’immunostaining deve essere effettuato in retine a montaggio intero per rivelare la ramificazione tridimensionale dei DAC e la presenza di recettori del glutammato sui compartimenti subcellulari. Sebbene la retina sia relativamente trasparente, lo spessore di una retina a montaggio intero del topo è di circa 200 μm, il che limita la penetrazione degli anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l’imaging ad alta risoluzione a causa della diffusione della luce tissutale. Per superare questi limiti, abbiamo adattato il metodo di delipidazione dell’idrogel tissutale compatibile immunosottenibile (CLARITY) sviluppato di recente per sezioni cerebrali spesse alle retine di topomontate su intero 7.
Il metodo CLARITY è stato originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth per l’immunosociezione e l’imaging di campioni cerebralispessi 7. Utilizza un detergente forte, il solfato di dodecil di sodio (SDS) e l’elettroforesi per rimuovere i componenti lipidici (che causano lo scattering della luce dei tessuti), lasciando le proteine e gli acidi nucleici in posizione. I lipidi rimossi vengono sostituiti con un’impalcatura trasparente composta da monomeri idrogel come l’acrilammide per sostenere la restante struttura proteica. Il tessuto eliminato può essere etichettato tramite immunoistochimica e immaginato con una profondità di penetrazione della luce notevolmente aumentata attraverso il tessuto (fino a diversi millimetri sotto la superficie del tessuto). Da allora, il metodo CLARITY è stato ottimizzato e semplificato da diversi gruppidi ricerca 8,9,10. Un protocollo CLARITY modificato utilizza una tecnica di compensazione passiva per evitare i possibili danni ai tessuti prodotti dall’elettroforesi per lo sgombero di tutto il cervello e di altri organiintatti 11. Tuttavia, questo metodo non è ancora stato applicato alle retine a montaggio intero. Qui, abbiamo adattato la tecnica PASSIVA CLARITY per retine a montaggio intero per renderle più trasparenti per l’immunoistochimica e l’imaging. Abbiamo scoperto che la maggior parte delle proteine retiniche testate sono state conservate durante questo processo per l’immunoistochimica. Utilizzando la soluzione di corrispondenza dell’indice di rifrazione, siamo stati in grado di visualizzare i neuroni retini attraverso lo spessore di circa 200 μm dall’ONL al GCL nelle retine a montaggio intero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifica del protocollo CLARITY per retine a montaggio intero.
Abbiamo semplificato il protocollo CLARITY per ottenere un’adeguata polimerizzazione senza la necessità di una camera di evacuazione o essiccazione sottovuoto, come viene utilizzato nella maggior partedegli studi precedenti 7,9,11. Il processo di polimerizzazione è inibito dall’ossigeno, richiedendo che il campione sia isolato dall’aria durante …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Bing Ye, Nathan Spix e Hao Liu per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) e dall’Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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