Summary
هنا نقدم بروتوكولا لتكييف طريقة وضوح أنسجة الدماغ لشبكية العين كاملة جبل لتحسين نوعية تلطيخ المناعية القياسية والتصوير عالي الدقة من الخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية.
Abstract
تم تعديل طريقة التهذير الهيدروجيل الأنسجة (CLARITY)، التي وضعت أصلا من قبل مختبر Deisseroth، وتستخدم على نطاق واسع لاحتواء المناعة والتصوير لعينات الدماغ سميكة. ومع ذلك، لم يتم استخدام هذه التكنولوجيا المتقدمة بعد لشبكية العين كاملة التركيب. على الرغم من أن شبكية العين شفافة جزئيا، إلا أن سمكها البالغ حوالي 200 ميكرومتر (في الفئران) لا يزال يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة وكذلك الحد من اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة. هنا، قمنا بتكييف طريقة CLARITY لشبكية العين الماوس جبل كامل عن طريق البلمرة لهم مع مونومر الأكريلاميد لتشكيل هيدروجيل نانوبري ومن ثم تطهيرها في كبريتات دودسيل الصوديوم للحد من فقدان البروتين وتجنب تلف الأنسجة. كانت شبكية العين المجهزة بالوضوح ملطخة بالمناعة بأجسام مضادة للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية والبروتينات المتشابكة ، مثبتة في محلول مطابق لمؤشر الانكسار ، وصورت. تظهر بياناتنا أن CLARITY يمكن أن يحسن جودة تلطيخ المناعة الكيميائية القياسية والتصوير للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية في إعداد التركيب الكامل. على سبيل المثال ، تم تحسين الدقة ثلاثية الأبعاد للهياكل الدقيقة الشبيهة بالفأس والتشجرات لخلايا amacrine الدوبامين بشكل كبير من خلال CLARITY. بالمقارنة مع شبكية العين غير المصنعة كاملة التركيب ، يمكن أن يكشف CLARITY عن وجود مناعة للبروتينات المتشابكة مثل بروتين الكثافة بعد المتشابك 95. تظهر نتائجنا أن CLARITY يجعل شبكية العين أكثر شفافية بصريا بعد إزالة الدهون ويحافظ على الهياكل الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية وبروتيناتها ، والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني للحصول على تصوير عالي الدقة للخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية في إعداد التركيب الكامل.
Introduction
قد تكون الشبكية الفقارية هي الجزء الأكثر سهولة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وهي بمثابة نموذج ممتاز لدراسة تطور الدماغ وبنيته ووظيفته. يتم توزيع خمس فئات من الخلايا العصبية في شبكية العين في ثلاث طبقات نووية مفصولة طبقتين شكلية. تتكون الطبقة النووية الخارجية (ONL) من مستقبلات ضوئية كلاسيكية (قضبان ومخاريط) تحول الضوء إلى إشارات كهربائية. تتم معالجة الإشارات الكهربائية بواسطة الخلايا العصبية في الطبقة النووية الداخلية (INL)، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب والأفقية والأماكرين، ثم تنتقل إلى خلايا العقدة الشبكية (RGCs) في طبقة خلايا العقدة (GCL). RGCs هي الخلايا العصبية الناتجة من شبكية العين، مع محاور عصبية إسقاط إلى الدماغ للمساهمة في تشكيل الصورة وغير تشكيل الصورة وظيفة بصرية. بالإضافة إلى ذلك، توفر ثلاثة أنواع من الخلايا الدبقية (خلايا مولر، والأستروغليا، والميكروجليا) العناصر الغذائية للخلايا العصبية وتحمي الخلايا العصبية من التغيرات الضارة في بيئتها خارج الخلية.
واحد السكان الفرعية المتخصصة من خلايا الاماكرين تنتج وتطلق الدوبامين, neuromodulator هامة في الجهاز العصبي المركزي, إعادة تكوين الدوائر العصبية الشبكية خلال التكيف مع الضوء1,2. خلايا الدوبامين amacrine (DACs) لديها ميزة فريدة من ملامح مورفولوجية. وتقع سوماتا بهم في INL القريبة مع dendrites ramifying في الجزء الأكثر قاصرة من طبقة plexiform الداخلية (IPL). عمليات تشبه أكسون من DACs هي unmyelinated، رقيقة وطويلة، متفرعة بشكل متفرق، وتحمل الدوالي (مواقع إطلاق الدوبامين). أنها تشكل الضفيرة الكثيفة مع dendrites في IPL، بما في ذلك هياكل تشبه حلقة حول سوماتا من خلايا AII amacrine. المحاور أيضا تشغيل من خلال INL نحو OPL, تشكيل مسار الطرد المركزي عبر شبكية العين3. لقد أثبتنا أن عمليات DAC تعبر عن المستقبلات استجابة لإطلاق الغلوتامات من الخلايا العصبية presynaptic، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب وخلايا العقدة الشبكية الحساسة للضوء في جوهرها (ipRGCs)4،5،6. ومع ذلك، فمن غير الواضح ما إذا كانت مستقبلات الغلوتامات تعبر عن محاور الفأس، التشعبات، أو كليهما لأنها مقطوعة في أقسام الشبكية الرأسية ولا يمكن تمييزها عن بعضها البعض5،6. يجب إجراء التلطخ المناعي في شبكية العين الكاملة للكشف عن تفريع ثلاثي الأبعاد ل DACs ووجود مستقبلات الغلوتامات على المقصورات دون الخلوية. على الرغم من أن شبكية العين شفافة نسبيا، إلا أن سمك شبكية العين ذات التركيب الكامل للفأر يبلغ حوالي 200 ميكرومتر، مما يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة، فضلا عن تقليل اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة بسبب تشتت الأنسجة الخفيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتكييف طريقة التهذييل الهيدروجيل الأنسجة المتوافقة (CLARITY) التي تم تطويرها مؤخرا لأقسام الدماغ السميكة إلى شبكية العين الماوس جبل كامل7.
تم تطوير طريقة CLARITY في الأصل من قبل مختبر Deisseroth لاحتواء المناعة وتصوير عينات الدماغ السميكة7. ويستخدم المنظفات القوية، كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) والكهربائية لإزالة مكونات الدهون (التي تسبب تشتت الضوء الأنسجة)، وترك البروتينات والأحماض النووية في مكانها. يتم استبدال الدهون إزالتها مع سقالة شفافة تتكون من مونومرات هيدروجيل مثل الأكريلاميد لدعم بنية البروتين المتبقية. يمكن تسمية الأنسجة المطهية عن طريق الكيمياء المناعية وصورت مع زيادة كبيرة في عمق اختراق الضوء من خلال الأنسجة (تصل إلى عدة ملليمترات تحت سطح الأنسجة). ومنذ ذلك الحين، تم تحسين طريقة CLARITY وتبسيطها من قبل العديد من مجموعات البحث8و9و10. يستخدم بروتوكول CLARITY المعدل تقنية إزالة سلبية لتجنب تلف الأنسجة المحتمل الناتج عن الكهتروفورسيس لتطهير الدماغ كله والأعضاء الأخرى السليمة11. ومع ذلك، لم يتم تطبيق هذه الطريقة بعد على شبكية العين كاملة التركيب. هنا، قمنا بتكييف تقنية CLARITY السلبية لشبكية العين الكاملة لجعلها أكثر شفافية للكيمياء المناعية والتصوير. وجدنا أن غالبية بروتينات الشبكية التي تم اختبارها تم الحفاظ عليها خلال هذه العملية للكيمياء المناعية. باستخدام معامل الانكسار مطابقة الحل، كنا قادرين على صورة الخلايا العصبية الشبكية عبر سمك ما يقرب من 200 ميكرومتر من ONL إلى GCL في شبكية العين جبل كامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت رعاية الفئران وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة للحيوانات المختبرية ووافقت عليها اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة أوكلاند (البروتوكول رقم 18071).
ملاحظة: يتم سرد أسماء الحلول والتركيبات الخاصة بهم في الجدول 1.
1. إعداد الأنسجة
- قتل الفأر بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون،يليه خلع عنق الرحم.
- احث العينين بالملقط المنحني ونقلها إلى طبق بتري صغير مع 0.1 M PBS (الجدول 1). تحت مجهر تشريح، كزة حفرة صغيرة على طول تقاطع القرنية تصلب مع إبرة. نقل إلى 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة ساعة واحدة.
- نقل العين مرة أخرى إلى طبق مع برنامج تلفزيوني. تحت مجهر تشريح، استخدم مقص التشريح لقطع كل الطريق حول تقاطع القرنية والكليرا. إزالة القرنية والعدسة. قطع في قاعدة العصب البصري وتقشير بعناية تصلب قبالة مع ملقط لعزل شبكية العين.
- جعل أربعة تخفيضات صغيرة بالتساوي حول شبكية العين واستخدام فرشاة تلميح غرامة انخفض في برنامج تلفزيوني لوضعها مسطحة (GCL الجانب إلى أسفل) في شكل يشبه البرسيم على قطع مربع صغير من ورقة تصفية النيتروسليلوز لتحقيق الاستقرار في شبكية العين.
- نقل شبكية العين باستخدام ملقط لعقد زاوية ورقة النيتروسليلوز (دون لمس شبكية العين التي شنت) ووضعها في لوحة 48 جيدا مع 4٪ PFA لمدة 1 ساعة.
- نقل ورقة تصفية وشبكية العين إلى بئر مع برنامج تلفزيوني وغسل (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).
- نقل إلى A4P0 (الجدول 1) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C مع التحريض لطيف.
- زيت نباتي ماصة في البئر لتغطية تماما حل A4P0. احتضان في حمام مائي في 40 درجة مئوية لمدة 3 ساعات مع عدم وجود اهتزاز.
- غسل (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما) في برنامج تلفزيوني، والتأكد من أن جميع النفط قد تم شطف قبالة. إذا لزم الأمر، استخدم ماصة لإزالة الزيت المتبقي بعناية من أعلى البئر قبل الشطف الأخير.
- احتضان في 10٪ SDS في 40 درجة مئوية لمدة يومين مع اهتزاز لطيف. استبدال SDS مع حل جديد في اليوم الثاني.
- نقل ورقة تصفية وشبكية العين إلى برنامج تلفزيوني مع تريتون-X-100 (PBST، الجدول 1)وغسل (5x ل 1.5 ساعة لكل منهما).
- تخزين في 4 درجة مئوية في PBST مع 0.01٪ azide الصوديوم (NaN3)أو الانتقال مباشرة إلى نقص المناعة.
2. مطابقة مؤشر التخزين الانكساري والمناعة
- إزالة شبكية العين من ورقة التصفية عن طريق تقشير بلطف تشغيله مع فرشاة تلميح غرامة في PBST.
- احتضان شبكية العين في الأجسام المضادة الأولية (الجدول 2) المخفف في حل الحجب (الجدول 1) لمدة يومين عند 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
- غسل (5x، 1.5 ساعة لكل منهما) في PBST.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الجدول 3) المخفف في حل حجب لمدة 2 أيام في 40 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف وحماية من الضوء من خلال ما تبقى من الإجراء.
- اغسل (5x، 1.5 ساعة لكل منهما) في 0.02 متر من الفوسفات (انظر الجدول 1).
- احتضان في معامل الانكسار القائم على سوربيتول مطابقة الحل (sRIMS، انظر الجدول 1)في 40 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز لطيف.
3. تصاعد
- قم بوضع مخطط تفصيلي لشريحة زجاجية مقاس 18 مم × 18 مم × 1.5 مم مع علامة دائمة ذات طرف رفيع لوضع علامة على حد مربع على الجزء الخلفي من شريحة المجهر الزجاجي.
- الوجه الشريحة أكثر واستخدام حقنة لتتبع الحدود مع خط رفيع من الشحوم السيليكون على الجزء الأمامي من الشريحة، وترك فجوة صغيرة في زاوية واحدة لحل تصاعد الزائدة للهروب.
- نقل شبكية العين إلى وسط المنطقة المحيطة وترتيب مع فرشاة غرامة تلميح بحيث تقع مسطحة مع الجانب مستقبلات ضوئية ضد الشريحة الزجاجية.
- ماصة ما يقرب من 60 ميكرولتر من sRIMS بحيث يغطي شبكية العين بالارض ويمتد إلى زاوية واحدة من الضميمة، مع الحرص على أن شبكية العين يبقى شقة وفي مكانها.
- تطبيق coverslip بدءا من الزاوية مع SRIMS وخفض ببطء حتى يمس الشحوم على جميع الجوانب، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
- ضع كومة من 3 قطع تغطي على كل جانب من شبكية العين المركبة كمسافة. استخدام حافة طويلة من شريحة أخرى للضغط على أسفل coverslip بحيث جبل مسطحة وحتى.
- تخزين الشرائح مسطحة عند 4 درجة مئوية حتى التصوير.
4. التصوير
- عينات الصورة على المجهر الفلوري التقليدي أو المجهر الكونفوكوكال(جدول المواد). ابدأ بوضع الشريحة على مرحلة المجهر وتحديد موقع العينة.
ملاحظة: إذا تم استخدام مجهر موضوعي مقلوب، ضع الشريحة رأسا على عقب على المسرح، أولا ضمان أن المناطق المكشوفة من الشريحة واضحة من جميع الشحوم السيليكون والحل المتصاعد. - للحصول على صور مكدسة z لعينات تحمل علامة مشتركة، ركز أولا على الإشارة في كل قناة على حدة وحدد وقت التعرض أو سرعة المسح الضوئي، للمجاهر الفلورية أو البؤرية، على التوالي.
- تعيين النطاق للكدسة z إما عن طريق تعيين المستوى البؤري يدويا في أعلى وأسفل النطاق المطلوب، أو عن طريق تعيين نقطة الوسط ثم تحديد نطاق حول نقطة الوسط.
- ضبط حجم الخطوة أو عدد الشرائح حسب الرغبة.
- التقاط الصورة وحفظ الملف الأصلي وكذلك تصديره كملف TIFF أو تنسيق آخر المطلوب.
5. تحليل الصور
- استخدام برنامج تحليل الصور من اختيار(جدول المواد)لضبط السطوع والتباين في كل قناة حتى يتحقق الوضوح الأمثل في كل من الصور المفردة وتقديم 3 الأبعاد من z-كومة.
ملاحظة: إذا كان حجم الخطوة المحددة صغيرة بما فيه الكفاية، يمكن أيضا إجراء deconvolution 3D لتحسين الإشارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
شبكية العين المعدلة المعالجة CLARITY هي أنسجة شفافة بصريا.
لصياغة طريقة تطهير الأنسجة التي تتوافق مع التطبيقات المناعية الكيميائية في شبكية العين مع توفير الهذيان الكافي والاحتفاظ السلامة الهيكلية للبروتينات الخلوية، قمنا بتكييف طريقة إزالة الأنسجة وضوح لشبكية العين الماوس جبل كامل. تمكنا من تبسيط البروتوكول وتعديله لشبكية العين كاملة التركيب (انظر البروتوكول). بعد الانتهاء من التهجين الأنسجة, تطهير, ومطابقة مؤشر الانكسار, شبكية العين معالجتها مع هذا البروتوكول وضوح تعديل أظهرت الشفافية البصرية كاملة تقريبا في جميع أنحاء سمك شبكية العين (الشكل 1A) بالمقارنة مع شبكية العين التحكم غير المجهزة (الشكل 1B). وتشير هذه النتيجة إلى أن هذا التعديل لبروتوكول CLARITY يوفر أنسجة شبكية العين الكاملة التركيب التي تم تطهيرها بما فيه الكفاية.
تحسين التصوير ثلاثي الأبعاد للخلايا العصبية في شبكية العين المجهزة الوضوح المعدلة.
لتقييم جودة وعملية تلطيخ المناعة الكيميائية التي توفرها هذه الطريقة تعديل الوضوح، ونحن ملطخة وضوح شبكية العين المجهزة مع مختلف الأجسام المضادة الأولية (الجدول 2). هذه الأجسام المضادة علامة كل نوع الخلية الرئيسية في شبكية العين: مستقبلات ضوئية مخروطية, قضيب الخلايا ثنائية القطب, خلايا الأمارين, RGCs, والخلايا الدبقية, فضلا عن الأجسام المضادة ضد البروتينات متشابك دون الخلوية. وباستثناء علامة نشاط الخلية فوسفو-S6 (pS6)، أثبتت جميع الأجسام المضادة التي تم اختبارها أنها متوافقة مع CLARITY. ويتضح من الأمثلة النموذجية في الشكل 2. قمنا بالوسم الثلاثي مع الأجسام المضادة ضد مخروط arrestin، التيروزين هيدروكسيلاز (TH)، وبروتين الحمض النووي الريبي ملزمة مع الربط المتعدد (RBPMS). أخذنا سلسلة من ض--كومة صور المجهر confocal من ONL إلى GCL. وأظهرت الصور الفردية المخاريط arrestin المسمى في ONL (الشكل 2A)، TH المسمى DACs في INL (الشكل 2B) وRBPMS ملحوظ RGCs في GCL (الشكل 2C). كشفت صورة تراكب الموقع النسبي لهذه الخلايا العصبية في جميع أنحاء سمك شبكية العين(الشكل 2D). تشير هذه النتائج إلى أن CLARITY يمكن أن يحسن جودة العديد من التلطيخ الكيميائي المناعي القياسي ويكشف بوضوح عن البنية ثلاثية الأبعاد للخلايا العصبية عبر سمك الشبكية بالكامل في الاستعدادات الكاملة.
تعديل وضوح يوفر تحسين دقة 3D من العمليات الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية والبروتينات متشابك.
قمنا بتحليل كذلك TH تلطيخ في وضوح معالجتها كامل جبل شبكية العين (الأرقام 3A، ب) ومقارنتها التصوير التي تم الحصول عليها من إعداد كامل جبل القياسية (الأرقام 3C، D). تظهر الصور Confocal أن التشعبات والعمليات الشبيهة بالمكون المحوري ل DACs تم الكشف عنها بشكل أكثر وضوحا في شبكية العين المجهزة CLARITY(الشكل 3A)مما كانت عليه في شبكية العين القياسية(الشكل 3C). وعلى وجه الخصوص، أظهرت العمليات الشبيهة بالمحور في أجهزة ال DACs هياكل تشبه الحلقة أكثر اكتمالا في شبكية العين CLARITY (انظر إدراج في الشكل 3A)مما كانت عليه في شبكية العين القياسية (انظر إدراج في الشكل 3C). وتجدر الإشارة إلى أن الهياكل الشبيهة بالحلقة لشبكية شبكية العين CLARITY التي تم التقاطها باستخدام المجهر الفلوري(الشكل 3B)كانت متطابقة تقريبا مع تلك التي لوحظت باستخدام الكونفوكوكال(الشكل 3A). وبالإضافة إلى ذلك، ركض أيضا عمليات تشبه المحور نحو شبكية العين الخارجية، والتي لوحظت في الصور الموجهة X-Z(الشكل 4A). تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام CLARITY لتحديد العمليات الشبيهة بالمؤن المحوري ل DACs في شبكية العين الكاملة حتى مع استخدام المجهر الفلوري التقليدي.
عندما تم فحص وحدة مستقبلات AMPA الفرعية GluA2 وبروتين الكثافة ما بعد المتشابك 95 (PSD-95) في شبكية العين القياسية كاملة التركيب ، لم يتم اكتشاف أي منهما ، على الأرجح بسبب ضعف اختراق الأجسام المضادة ضد هذه البروتينات المتشابكة في شبكية العين العميقة. لتحديد ما إذا كانت شبكية العين المجهزة من CLARITY تسمح لهذه الأجسام المضادة بالبروتينات المتشابكة المناعية، قمنا بتسمية TH ثلاث مرات مع وحدة GluA2 وPSD-95 الفرعية. وأظهرت immunostaining ضد GluA2 و PSD-95 puncta متميزة تكشف عن مستقبلات AMPA الفردية التي تحتوي على GluA2 (الشكل 4B) ومواقع postynaptic المفترضة (الشكل 4C)، على التوالي. وأظهرت صورة تراكب بعض puncta واضحة على عمليات لجنة المساعدة الإنمائية(الشكل 4D). صورنا نقطة من الكولوكال المفترض مع كل البقع الثلاثة وقدمناها في وجهات النظر 3D (الشكل 5). من جميع وجهات النظر الثلاثة ، TH colocalized بوضوح مع كل من GluA2 و PSD - 95(الشكل 5 A - C). هذه النتائج منظور 3D من شبكية العين جبل كامل التحقق من صحة تقاريرنا السابقة من التعبير متشابك من مستقبلات AMPA GluA2 التي تحتوي على عمليات DAC في شرائح الشبكية الرأسية5,6.
الشكل 1. يوفر الوضوح أنسجة شفافة بصريا. تمت معالجة شبكية العين الماوس كامل جبل مع طريقة وضوح تعديل (انظر البروتوكول) وشبكية العين بأكملها صورت مع المجهر تشريح، مضافا على شبكة مربعة 0.67 سم لإظهار الحجم. أ: وضوح معالجتها كامل جبل شبكية العين، مع خطوط الشبكة مرئية بوضوح على الرغم من الأنسجة الشفافة. تحدد الأسهم موضع الشبكية. ب: شبكية العين التحكم غير الوضوح معالجتها، ثابتة في PFA لمدة 1 ساعة واحتضانها في برنامج تلفزيوني. يتم حجب خطوط الشبكة من خلال التعتيم النسبي للأنسجة. شريط المقياس: حوالي 2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تحسين التصوير ثلاثي الأبعاد للخلايا العصبية عبر سمك الشبكية في شبكية العين المجهزة بوضوح. كانت شبكية العين الوضوح كامل جبل مناعة مع الأجسام المضادة ضد مخروط arrestin، TH، وRBPMS. تمثل الصورة عرض وحدة تخزين ثلاثية الأبعاد لصورة كونفوج ثلاثية الأبعاد مكدسة، يتم عرضها في اتجاه X-Z. أ: مخروط مستقبلات ضوئية (السهم) المسمى من قبل مخروط arrestin (الأزرق). بقعة طفيفة مرئية في شبكية العين الداخلية (رؤوس الأسهم)، على الأرجح بسبب تلطيخ الخلفية. ب: DAC سوما وdendrites (السهم) المسمى من قبل TH (أحمر). تشير رؤوس الأسهم إلى الأوعية الدموية الشبكية في شبكية العين الداخلية ، مرئية بسبب اللعلام المناعي المتعدد التسميات. جيم: RGC سوماتا (السهم) المسمى من قبل RBPMS (الأخضر). تشير رؤوس الأسهم إلى الأوعية الدموية الشبكية المرئية بسبب الفلورة الذاتية وتلطيخ الأوعية الدموية غير المحدد. دال: صورة مدمجة للتلوين الثلاثي المسمى ، مما يكشف عن الموضع النسبي لهذه الخلايا العصبية عبر سمك شبكية العين ، مع مستقبلات ضوئية مخروطية تقع في الطبقة النووية الخارجية ، وDACs في الطبقة النووية الداخلية ، وRGCs في طبقة خلايا العقدة. مقياس عرض وحدة التخزين تم وضع علامة بزيادات 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. وضوح يكشف عن هياكل غرامة من مورفولوجيا DAC. تم إجراء TH المناعي في وضوح معالجتها (A و B) ومعيار (C و D) شبكية العين. تم التقاط صور مكدسة Z باستخدام confocal (A و C) ومجهر مضان(B و D). إدراج من طائرة بصرية واحدة في كل صورة يسلط الضوء على هياكل تشبه حلقة يفترض أن شكلتها عمليات تشبه المحور. تشير رؤوس الأسهم إلى سوماتا DAC ، والعديد من الهياكل الشبيهة بالحلقة مرئية (يشار إلى الأمثلة بالسهام) في الضفيرة الكثيفة من التشعبات والعمليات الشبيهة بالمحور التي تم الكشف عنها في شبكية العين المجهزة بوضوح(A و B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تعديل وضوح يوفر تحسين دقة 3D من الهياكل التشجرات غرامة والبروتينات متشابك. تم إجراء التثليث المناعي الثلاثي في شبكية العين الكاملة التركيب المجهزة من CLARITY مع أجسام مضادة ضد TH و GluA2 و PSD-95. تم إعادة بناء عرض وحدة التخزين من التصوير الكونفوفكال مكدسة z وقدمت في اتجاه X-Z الزاوية. أ: TH المسمى DAC سوماتا (رؤوس الأسهم) في الطبقة النووية الداخلية والعمليات (الأسهم الصفراء) طبقات في طبقة plexiform الداخلية البعيدة (الأحمر). تشير الأسهم البيضاء إلى عمليات الطرد المركزي الممتدة نحو الشبكية الخارجية. ب: تعبير دقيق كثيف لمستقبلات AMPA المحتوية على GluA2 عبر الطبقة البليكسية الداخلية (خضراء). يشير السهم إلى الفلورة الذاتية من الأوعية الدموية في الشبكية. جيم: Puncta الكشف عن مواقع ما بعد متشابك المسمى من قبل PSD-95 في طبقة plexiform الداخلية (الأزرق). تشير الأسهم إلى الأوعية الدموية ، على ما يبدو بسبب استخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر ضد PSD-95. دال: صورة تراكب توضح تداخل عمليات DAC المسماة ب TH مع التعبير عن GluA2 و PSD-95. مقياس عرض وحدة التخزين تم وضع علامة بزيادات 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. تعبير متشابك لمستقبلات AMPA المحتوية على GluA2 على DACs. تم اختيار نقطة من الكولوكالات الثلاثية المفترضة ل TH و GluA2 و PSD-95 الموضحة في الشكل 4 والتحقيق فيها في 3D. A1 يمثل مقطع من عملية DAC (أحمر) في اتجاه X-Z (A5). A2 و A3 تظهر واحدة GluA2 punctum (الأخضر) وPSD-95 punctum (الأزرق)، على التوالي، في نفس الاتجاه. الصورة المدمجة (A4) يوضح كولوكالينس الثلاثي من TH، GluA2 و PSD-95 (السهم). B1-B4 إظهار نفس نقطة كولوكالنج (السهم) في اتجاه Y-Z (B5). C1-C4 إظهار كولوكالين من نفس النقطة (السهم) في الطائرة X-Y (C5). التكبر الثلاثي واضح بوضوح في كل اتجاه. شريط المقياس: 2 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل | تكوين | تلاحظ |
| 0.1 م برنامج تلفزيوني | 137 مليون متر كلوريد NaCl | ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 |
| 26.8 مليون كيلو متر كل عام | ||
| 10.1 مليون متر Na2HPO4 | ||
| 17.6 م م KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4٪ أكريلاميد | الاستعداد على الجليد، aliquot، وتخزينها في -20 درجة مئوية |
| 0.25٪ VA-044 | ||
| 0.1 م برنامج تلفزيوني | ||
| برنامج تلفزيوني | 0.1٪ (v/v) تريتون-X-100 | |
| 0.1 م برنامج تلفزيوني | ||
| حل الحظر | 2٪ NDS أو 1٪ BSA | |
| 0.01٪ NaN3 | ||
| برنامج تلفزيوني | ||
| 0.1 متر فوسفات عازل | 11.93 غ Na2HPO4/لتر | ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 |
| 15.34 غرام NaH2PO4/لتر | ||
| ddH2O | ||
| SRIMS | 70٪ سوربيتول | ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 مع NaOH |
| 0.1٪ توين-20 | ||
| 0.01٪ NaN3 | ||
| 0.02 متر عازلة فوسفات | ||
الجدول 1 - الجداول تكوين الحلول.
| جسم | IHC | مضيف | التخفيف | كتالوج # | مورد | معرف التسجيل Ab | هدف |
| أوبسين الأزرق الحساس | +3 | الماعز متعدد النسيلة | 1:1000 | SC-14363 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | AB_2158332 | S-مخروط |
| مخروط الاعتقال في | +2 | أرنب متعدد النسيلة | 1:1000 | AB15282 | إمد ميليبور | AB_1163387 | مخروط |
| بروتين كيناز C ألفا (PKC-α) | +3 | أرنب متعدد النسيلة | 1:1000 | SC-208 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | AB_2168668 | خلية رود ثنائية القطب |
| بروتين حمضي الرجفان الدبقية (GFAP) | +3 | الماعز متعدد النسيلة | 1:500 | SC-6170 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | AB_641021 | الخلايا الفلكية |
| التيروزين هيدروكسي اسي (TH) | +3 | الأغنام متعددة النسيلة | 1:500 | AB1542 | إمد ميليبور | AB_90755 | خلية الماكرين الدوبامين |
| التيروزين هيدروكسي اسي (TH) | +2 | أرنب متعدد النسيلة | 1:500 | OPA1-04050 | ثيرمو فيشر | AB_325653 | خلية الماكرين الدوبامين |
| أستيل الكولين (ChAT) | +1 | الماعز متعدد النسيلة | 1:500 | AB144P | إمد ميليبور | AB_2079751 | خلية أستانة النجوم |
| بروتين ملزم RNA مع الربط المتعدد (RBPMS) | +1 | خنزير غينيا متعدد النسيلة | 1:2000 | ABN1376 | إمد ميليبور | AB_2687403 | خلية العقدة الشبكية |
| غلوا2 | +3 | أرنب متعدد النسيلة | 1:500 | AB1768-I | إمد ميليبور | AB_2247874 | مستقبلات CA2+-منيعة AMPA |
| غلوا2 | +2 | فأر أحادي النسيلة | 1:250 | مابن1189 | إمد ميليبور | AB_2737079 | مستقبلات CA2+-منيعة AMPA |
| بروتين الكثافة ما بعد المتشابك 95 (PSD-95) | +3 | فأر أحادي النسيلة | 1:1000 | 75-028 | نيوروب | AB_2877189 | مواقع متشابكة |
| فوسفو-S6 (pS6) | 0 | أرنب متعدد النسيلة | 1:500 | 44-923G | ثيرمو فيشر | AB_2533798 | علامة نشاط الخلية |
الجدول 2 - الأرباح ملخص الأجسام المضادة الأولية التي تم اختبارها. أسطورة IHC: +3 = تلطيخ متناسق ومحدد للغاية؛ +2 = تلطيخ جيدة باستمرار، والخلفية الحد الأدنى؛ +1 = تلطيخ جيدة، وبعض الخلفية. 0 = غير متوافق مع وضوح.
| مضيف | الأنواع المستهدفة | المرافقه | التخفيف | مورد |
| حمار | مكافحة الأغنام | أليكسا فلور 568 | 1:500 | إنفيتروجين |
| حمار | مكافحة الأغنام | أليكسا فلور 594 | 1:500 | إنفيتروجين |
| حمار | مكافحة الأرنب | أليكسا فلور 488 | 1:500 | إنفيتروجين |
| حمار | مكافحة الأرنب | أليكسا فلور 594 | 1:500 | إنفيتروجين |
| ماعز | مكافحة الأرنب | أليكسا فلور 647 | 1:500 | إنفيتروجين |
| حمار | مكافحة الماوس | أليكسا فلور 488 | 1:500 | إنفيتروجين |
| حمار | مكافحة الماوس | أليكسا فلور 647 | 1:500 | إنفيتروجين |
| حمار | مكافحة الماعز | أليكسا فلور 568 | 1:500 | إنفيتروجين |
| حمار | مكافحة الماعز | أليكسا فلور 594 | 1:500 | إنفيتروجين |
| ماعز | خنزير مضاد لغينيا | أليكسا فلور 488 | 1:500 | إنفيتروجين |
الجدول 3 - الأرباح ملخص الأجسام المضادة الثانوية التي تم اختبارها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعديل بروتوكول CLARITY لشبكية العين كاملة التركيب.
لقد قمنا بتبسيط بروتوكول CLARITY لتحقيق البلمرة الكافية دون الحاجة إلى إخلاء فراغ أو غرفة الجفاف ، كما هو مستخدم في معظم الدراسات السابقة7و9و11. يتم تثبيط عملية البلمرة عن طريق الأكسجين ، مما يتطلب عزل العينة عن الهواء أثناء خطوة البلمرة في البروتوكول. ومع ذلك ، بدلا من إزالة الغاز مع النيتروجين ، وجدنا أن تغطية العينة بالزيت عزلت العينة بما يكفي للسماح بالبوليمرة دون التأثير سلبا على ما تبقى من البروتوكول بعد شطف شامل ، كما تم توثيقه سابقا12. كما قمنا بتبسيط البروتوكول بطريقة تطهير سلبية للحد من خطر براوننج الأنسجة وتلف بنية الأنسجة المرتبطة بالمقاصة الكهربائية11. يتم تسريع المقاصة السلبية عن طريق التحريض اللطيف وارتفاع درجة الحرارة ، مما يسمح بإزالة الأنسجة الكاملة في يومين فقط. خلال هذه الفترة الزمنية ، يتم تحقيق دلي كافي ليؤدي إلى أنسجة شفافة بصريا مع تقليل فقدان البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى التي تشكل جزءا لا يتجزأ من البنية الخلوية وتلطيخ المناعة الكيميائية.
يحافظ CLARITY على بروتينات الخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية في الاستعدادات الكاملة.
تظهر نتائجنا أن جميع الأجسام المضادة تقريبا التي تم اختبارها تعمل في شبكية العين المجهزة CLARITY. هذه الأجسام المضادة علامة مستقبلات ضوئية، والخلايا ثنائية القطب، وخلايا الأمارين، RGCs والخلايا الدبقية. على الرغم من أننا لم نتمكن من اختبار الأجسام المضادة للأنواع الفرعية من كل فئة من الخلايا العصبية الشبكية، نتائجنا تشير إلى أن وضوح شبكية العين المصنعة يمكن استخدامها لغالبية العلامات الخلوية في شبكية العين. على الرغم من أن معظم الأجسام المضادة التي اختبرناها يمكن أن تحتوي أيضا على خلايا عصبية شبكية العين في شبكية العين غير واضحة المعالجة، وجدنا أن وضوح سمح اختراق الأجسام المضادة الكافية في الأنسجة العميقة للشبكية، وتوفير خصوصية جيدة من تلطيخ في الطبقة الوسطى من شبكية العين. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن CLARITY حسن اختراق الضوء في جميع أنحاء سمك شبكية العين، والحد من تشتت الضوء والسماح للتصوير عالي الدقة من خلال حتى أعمق الطبقات. هذه العوامل تسهم في تحسين كل من تلطيخ والتصوير في شبكية العين كامل جبل الوضوح معالجتها مقارنة مع غير وضوح معيار كامل جبل IHC13. تسمح الخلفية المنخفضة والتصوير ثلاثي الأبعاد المحسن وتقديمات الحجم بإجراء تحقيق كامل في الهياكل الخلوية في جميع الطبقات عبر سمك شبكية العين.
وضوح يكشف عن العمليات الدقيقة وهيكل متشابك من DACs في شبكية العين جبل كامل.
تظهر نتائجنا أن الهياكل الشبيهة بالحلقة وعمليات الطرد المركزي ل DACs يتم الكشف عنها في CLARITY-processed بشكل أفضل مما كانت عليه في شبكية العين غير الوضوحية الكاملة. على وجه الخصوص ، يسمح التلطخ المناعي مع الأنسجة المجهزة CLARITY بحل جيد لهذه الهياكل الدقيقة حتى مع المجهر الفلوري القياسي دون الحاجة إلى التصوير الكونفوكوكال. ونظرا لأهمية DACs في الوظيفة البصرية ، يمكن استخدام إعداد CLARITY للتحقيق في هياكل DACs في شبكية العين العادية والتغيرات المورفولوجية في ظل الظروف المريضة.
عند الالتقاط المناعي لPSD-95 و GluA2 مع أنسجة كاملة القياسية، لاحظنا القليل أو لا يوجد وضع علامات على هذه الهياكل دون الخلوية في الطبقات العميقة من شبكية العين، مما يشير إلى ضعف اختراق الأجسام المضادة. يسمح تطبيق بروتوكول CLARITY بتلطيخ واضح لهذه البروتينات في طبقات الشبكية الداخلية ، مما يشير إلى تحسن اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة. تظهر نتائجنا أن CLARITY يسمح بالكشف عن البروتينات المتشابكة على عمليات DAC في شبكية العين الكاملة ، والتي تتم ملاحظتها عادة في تحضيرات الشرائح الرأسية6. نظرا لأنه لا يمكن تمييز العمليات الشبيهة بالمكون عن التشعبات في الشرائح الرأسية ، فإن شبكية العين الكاملة الوضوح توفر فرصة لتحديد ما إذا كانت المدخلات المتشابكة إلى DACs من الخلايا العصبية الأخرى مثل الخلايا ثنائية القطب وipRGCs تحدث في dendrites أو العمليات الشبيهة بالمكون أو كليهما5و6. منذ مستقبلات AMPA والبروتينات PSD-95 موزعة على نطاق واسع في جميع أنحاء IPL, التعبير عن هذه البروتينات على DACs تعيين مثال ممتاز لشبكية العين وضوح لاستخدامها لتحديد البروتينات متشابك في الخلايا العصبية الشبكية الأخرى.
اعتبارات والقيود والتطبيقات المستقبلية لبروتوكول CLARITY لشبكية العين الكاملة التركيب.
أولا، تضيف بروتوكولات البلمرة والمقاصة لشبكية الشبكية الكاملة التركيب المجهزة من CLARITY عدة أيام إلى عملية إعداد الأنسجة. ومع ذلك ، لا تزال الطريقة عملية للغاية من خلال حقيقة أنه يمكن تخزين شبكية العين الموضحة في PBS المحتوي على أزيد الصوديوم لمدة تصل إلى أسبوعين مع الحد الأدنى من تدهور الأنسجة. ثانيا، لوحظ بعض التوسع في الأنسجة في جميع أنحاء عملية المقاصة كما هو موثق في التطبيقات السابقة من وضوح7،11. ومع ذلك، وجدنا أن الشبكية عادت إلى الحجم الأصلي تقريبا عند التوازن مع حل مطابقة مؤشر الانكسار. قد لا تسبب التغيرات الطفيفة المحتملة في حجم الأنسجة تشويها كبيرا للبنية الخلوية أو دون الخلوية7،11. ثالثا، عند تصوير عينات الدماغ سمكا، وغالبا ما مغمورة الهدف المجهر مباشرة في وسائل الإعلام المتصاعدة للسماح مؤشر الانكسار الكامل مطابقة من عدسة المجهر من خلال الأنسجة12. مع عينات أرق مثل شبكية العين، استخدمنا coverlips لتركيب لجعل العينات تملق وأكثر حتى للتصوير. آثار الانكسار من خلال coverlip يبدو أن الحد الأدنى على التصوير. رابعا، تظهر بعض صورنا تلطيخ الأوعية الدموية غير المحددة لأننا لم نثقب الحيوان بأكمله بالتشويش داخل القلب (المقترح استخدامه لتجنب التلطيخ غير المحدد) قبل تجميل العينين. وأخيرا، يمكن استخدام البروتوكول الحالي المكيف للفئران لشبكية العين من الأنواع الأخرى. وعلى وجه الخصوص، فإن شبكية العين للحيوانات الكبيرة مثل ال وخنازير وخيول والرئيسيات أكثر سمكا بكثير من تلك الموجودة في الفئران. يمكن أن يجعل بروتوكول CLARITY هذا شبكية العين لهذه الحيوانات أكثر شفافية بصريا بعد إزالة الدهون والحفاظ على الهياكل الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية وبروتيناتها لاحتواء المناعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ونود أن نشكر بينغ يي، وناثان سبيكس، وهاو ليو على الدعم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للمنح الصحية EY022640 (D.-Q.Z.) وجائزة أبحاث الطلاب الجامعيين في جامعة أوكلاند (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
