Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.
Abstract
שיטת ההזיה הידרוג'ל רקמה (CLARITY), שפותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth, שונתה בשימוש נרחב עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוח עבות. עם זאת, טכנולוגיה מתקדמת זו עדיין לא שימשה עבור רטינות הר שלם. למרות הרשתית היא שקופה חלקית, עובי של כ 200 מיקרומטר (בעכברים) עדיין מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם הפחתת חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה. כאן, התאמנו את שיטת הבהירות עבור רשתית עכבר הר שלם על ידי פילמור אותם עם מונומר אקרילאמיד כדי ליצור הידרוג'ל nanoporous ולאחר מכן לנקות אותם נתרן דודקיל סולפט כדי למזער את אובדן החלבון ולמנוע נזק לרקמות. רשתיות מעובדות בהירות היו immunostained עם נוגדנים עבור נוירונים ברשתית, תאי גליה, וחלבונים סינפטיים, רכוב בתמיסת התאמת אינדקס שבירה, ודימוי. הנתונים שלנו מראים כי CLARITY יכול לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים והדמיה עבור נוירונים ברשתית ותאי גליה בהכנה לכל ההר. לדוגמה, רזולוציה תלת-ממדית של מבנים דקים דמויי אקסון ודנדריטי של תאי אמקרין דופאמין השתפרה בהרבה על ידי CLARITY. בהשוואה לרטינות לא מעובדות של הרכבה שלמה, CLARITY יכולה לחשוף חיסונים לחלבונים סינפטיים כגון חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית 95. התוצאות שלנו מראות כי CLARITY הופך את הרשתית לשקופה יותר מבחינה אופטית לאחר הסרת השומנים ומשמר מבנים עדינים של נוירונים ברשתית וחלבונים שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם באופן שגרתי להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ומבנים תת-תאיים שלהם בהכנה לכל ההר.
Introduction
הרשתית החולייתנית היא אולי החלק הנגיש ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), והיא משמשת מודל מצוין לחקר ההתפתחות, המבנה והתפקוד של המוח. חמישה סוגים של נוירונים ברשתית מופצים בשלוש שכבות גרעיניות המופרדות על ידי שתי שכבות plexiform. השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) מורכבת מצלמי פוטורצפטורים קלאסיים (מוטות וקונוסים) הממירים אור לאותות חשמליים. אותות חשמליים מעובדים על ידי נוירונים בשכבה הגרעינית הפנימית (INL), כולל תאים דו קוטביים, אופקיים ואמקרין, ולאחר מכן מועברים לתאי גנגליון ברשתית (RGCs) בשכבת תא הגנגליון (GCL). RGCs הם נוירוני הפלט של הרשתית, כאשר האקסונים מקרינים למוח לתרום לתפקוד חזותי יוצר תמונה ולא יוצר תמונה. בנוסף, שלושה סוגים של תאי גליה (תאי מולר, אסטרגליה ומיקרוגליה) מספקים חומרים מזינים לנוירונים ומגנים על נוירונים מפני שינויים מזיקים בסביבה החוץ-תאית שלהם.
תת-אוכלוסין מיוחד אחד של תאי אמקרין מייצר ומשחרר דופמין, נוירומודולטור חשוב במערכת העצבים המרכזית, מגדיר מחדש מעגלים עצביים ברשתית במהלך הסתגלות אור1,2. לתאי אמקרין דופאמין (DACs) יש תכונה ייחודית של פרופילים מורפולוגיים. הסומטה שלהם ממוקמים INL proximal עם דנדריטים ramifying בחלק הדיסטלי ביותר של שכבת plexiform הפנימית (IPL). תהליכים דמויי אקסון של DACs הם unmyelinated, רזה וארוך, מסועף בדלילות, לשאת varicosities (האתרים של שחרור דופמין). הם יוצרים מקלעת צפופה עם דנדריטים ב- IPL, כולל מבנים דמויי טבעת סביב הסומטה של תאי אמקרין AII. האקסונים גם לרוץ דרך INL לכיוון OPL, יצירת מסלול צנטריפוגלי על פני הרשתית3. הוכחנו כי תהליכי DAC מבטאים קולטנים בתגובה לשחרור גלוטמט מתאי עצב פרה-קוטביים, כולל תאים דו קוטביים ותאי גנגליון רשתית רגישים באופן מהותי (ipRGCs)4,5,6. עם זאת, לא ברור אם קולטני גלוטמט מבטאים על האקסונים, הדנדריטים, או שניהם מכיוון שהם מנותקים בקטעי רשתית אנכיים ולא ניתן להבחין ביניהם5,6. חיסון צריך להתבצע ברשתיות הר שלם כדי לחשוף הסתעפות תלת מימדית של DACs ואת נוכחותם של קולטני גלוטמט על תאים תת תאיים. למרות הרשתית היא שקופה יחסית, עובי של רשתית הר עכבר כולו הוא כ 200 מיקרומטר, אשר מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם מפחית חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה עקב פיזור אור רקמה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התאמנו את שיטת ההידרוגל התואמת לרקמות (CLARITY) שפותחה לאחרונה עבור מקטעי מוח עבים לרטינות עכבר הר שלם7.
שיטת CLARITY פותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוחעבות 7. הוא משתמש בחומר ניקוי חזק, נתרן דודציל סולפט (SDS) ואלקטרופרזה כדי להסיר את רכיבי השומנים (הגורמים לפיזור אור רקמות), ומשאיר את החלבונים וחומצות הגרעין במקומם. השומנים שהוסרו מוחלפים בפיגום שקוף המורכב ממונומרים הידרוג'ל כגון אקרילאמיד לתמיכה במבנה החלבון הנותר. ניתן לתייג את הרקמה המנוקה באמצעות אימונוהיסטוכימיה ולצלם אותה עם עומק חדירת אור מוגבר באופן משמעותי דרך הרקמה (עד כמה מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה). מאז, שיטת CLARITY עברה אופטימיזציה ופישוט על ידי מספר קבוצות מחקר8,9,10. פרוטוקול CLARITY שונה משתמש בטכניקת סליקה פסיבית כדי למנוע את הנזק האפשרי לרקמות המיוצר על ידי אלקטרופורזה לניקוי המוח כולו ואיברים שלמים אחרים11. עם זאת, שיטה זו עדיין לא הוחלה על רשתית הר שלם. כאן, התאמנו את טכניקת הבהירות הפסיבית עבור רטינות הר שלם כדי להפוך אותם שקופים יותר עבור אימונוהיסטוכימיה והדמיה. מצאנו כי רוב החלבונים ברשתית שנבדקו נשמרו במהלך תהליך זה עבור אימונוהיסטוכימיה. באמצעות פתרון התאמת אינדקס שבירה, הצלחנו לדמיין נוירונים ברשתית על פני עובי של כ 200 מיקרומטר מן ONL ל- GCL ברשתית הרכבה שלמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בעכבר וכל ההליכים הניסיוניים נערכו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות עבור חיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אוקלנד (פרוטוקול מס ' 18071).
הערה: שמות הפתרונות והיצירות שלהם מפורטים בטבלה 1.
1. הכנת רקמות
- המתת עכבר עם מנת יתר של CO2, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- להסב את העיניים עם מלקחיים מעוגלים ולהעביר אותם לצלחת פטרי קטנה עם 0.1 M PBS(טבלה 1). תחת מיקרוסקופ ניתוח, לתקוע חור קטן לאורך צומת הקרנית-סקלרה עם מחט. מעבירים ל-4% פארפורמלדהיד (PFA) למשך שעה.
- מעבירים את העין בחזרה למנה עם PBS. תחת מיקרוסקופ ניתוח, להשתמש מספריים ניתוח לחתוך את כל הדרך סביב צומת קרנית-סקלרה. מוציאים את הקרנית והעדשה. חותכים בבסיס עצב הראייה ומקלפים בזהירות את הסקלרה במלקחיים כדי לבודד את הרשתית.
- בצע ארבעה חתכים קטנים באופן שווה סביב הרשתית ולהשתמש מברשת קצה דק טבול PBS להניח אותו שטוח (GCL בצד למטה) בצורה דמוית תלתן על חתך מרובע קטן מנייר מסנן nitrocellulose כדי לייצב את הרשתית.
- מעבירים את הרשתית באמצעות מלקחיים כדי להחזיק את הפינה של נייר nitrocellulose (מבלי לגעת ברשתית רכוב) ומניחים אותו בצלחת 48-well עם 4% PFA במשך שעה אחת.
- מעבירים את נייר המסנן והרשתית לבאר עם PBS ושוטפים (3x למשך 5 דקות כל אחד).
- מעבירים ל-A4P0(שולחן 1)ומדגרת לילה ב-4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- שמן צמחי פיפטה לתוך הבאר כדי לכסות לחלוטין את הפתרון A4P0. דגירה באמבט מים ב 40 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ללא רעידות.
- לשטוף (3x במשך 5 דקות כל אחד) ב PBS, לוודא את כל השמן כבר שטף. במידת הצורך, השתמש בצינור כדי להסיר בזהירות את השמן שנותר מהחלק העליון של הבאר לפני השטיפה האחרונה.
- דגירה ב 10% SDS ב 40 מעלות צלזיוס במשך יומיים עם רעידות עדינות. החלף SDS עם פתרון טרי ביום השני.
- העבר את נייר המסנן והרשתית ל- PBS עם Triton-X-100 (PBST, טבלה 1) ושטוף (5x עבור 1.5 שעות כל אחד).
- יש לאחסן ב-4°C ב-PBST עם 0.01% נתרן אזיד (NaN3)או לעבור ישירות לחיסון.
2. התאמת אינדקס חיסוני ושבירה
- הסר את הרשתית מנייר הסינון על-ידי קילוף עדין שלה באמצעות מברשת קצה עדינה ב- PBST.
- דגירה הרשתית בנוגדן ראשוני (טבלה 2) מדולל בתמיסת חסימה (טבלה 1) במשך 2 ימים ב 40 מעלות צלזיוס עם טלטול עדין.
- לשטוף (5x, 1.5 שעות כל אחד) ב PBST.
- דגירה עם הנוגדנים המשניים המתאימים (טבלה 3) מדוללת בתמיסת חסימה במשך יומיים ב 40 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות ולהגן מפני אור לאורך שארית ההליך.
- לשטוף (5x, 1.5 שעות כל אחד) במאגר פוספט 0.02 M (ראה טבלה 1).
- דגירה בפתרון התאמת אינדקס שבירה מבוסס סורביטול (sRIMS, ראה טבלה 1)ב 40 °C (70 °F) לילה עם רעידות עדינות.
3. הרכבה על הרכבה
- מיתאר כיסויי זכוכית בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ x 1.5 מ"מ עם סמן קבוע עדין לסימון גבול מרובע בגב שקופית מיקרוסקופ זכוכית.
- הפוך את השקופית והשתמש במזרק כדי לעקוב אחר הגבול עם קו דק של גריז סיליקון בחזית השקופית, משאיר רווח קטן בפינה אחת עבור פתרון הרכבה עודף לברוח.
- מעבירים את הרשתית למרכז האזור התחום ומסדרים עם מברשת קצה דק כך שהיא שוכנת שטוחה עם הצד photoreceptor נגד שקופית הזכוכית.
- פיפטה כ 60 μL של sRIMS כך שהוא מכסה את הרשתית שטוח משתרע על פינה אחת של המתחם, דואג כי הרשתית נשארת שטוחה במקום.
- החל את הכיסוי החל מהפינה עם sRIMS ולהוריד אותו לאט עד שהוא נוגע בשמן מכל הצדדים, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.
- מניחים ערימה של 3 כיסויים בכל צד של הרשתית המותקנת כמרווח. השתמש בקצה הארוך של שקופית אחרת כדי ללחוץ על החלקה כדי שההרכבה יהיה שטוח ושווה.
- יש לאחסן שקופיות שטוחות ב-4°C עד להדמיה.
4. הדמיה
- דגימות תמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי או מיקרוסקופ קונפוקלי (שולחן החומרים). התחל על ידי הצבת השקופית על שלב המיקרוסקופ ואיתור המדגם.
הערה: אם נעשה שימוש במיקרוסקופ אובייקטיבי הפוך, הנח את השקופית במהופך על הבמה, תחילה כדי להבטיח שהאזורים החשופים של השקופית נקיים מכל גריז הסיליקון ותמיסת ההרכבה. - כדי להשיג תמונות מוערמות z של דגימות בעלות תווית משותפת, התמקדו תחילה באות בכל ערוץ בנפרד וקבעו את זמן החשיפה או מהירות הסריקה, למיקרוסקופים פלואורסצנטיים או קונפוקליים, בהתאמה.
- הגדר את הטווח עבור מחסנית z על-ידי הגדרה ידנית של מישור המוקד בחלק העליון והתחתון של הטווח הרצוי, או על-ידי הגדרת נקודת האמצע ולאחר מכן ציון טווח סביב נקודת האמצע.
- התאימו את גודל הצעד או את מספר הפרוסות לפי הצורך.
- ללכוד את התמונה ולשמור את הקובץ המקורי, כמו גם לייצא אותו כקובץ TIFF או בפורמט רצוי אחר.
5. ניתוח תמונה
- השתמש בתוכנת ניתוח התמונה המועדפת (טבלה של חומרים) כדי להתאים את הבהירות והניגודיות בכל ערוץ עד שיושג בהירות אופטימלית הן בתמונות הבודדות והן בעיבוד התלת מימדי של מחסנית z.
הערה: אם גודל הצעד שנבחר קטן מספיק, ניתן לבצע גם ניתור תלת-ממדי כדי לשפר את האות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רשתית מעובדת בהירות שונה הם רקמה שקופה אופטית.
כדי לגבש שיטת ניקוי רקמות התואמת ליישומים אימונוהיסטוכימיים ברשתית תוך מתן לשון נאותה ושימור השלמות המבנית של החלבונים התאיים, התאמנו את שיטת ניקוי רקמת CLARITY לרשתיות עכברים שלמות. הצלחנו לפשט את הפרוטוקול ולשנות אותו עבור רשתית הר שלם (ראה פרוטוקול). לאחר השלמת הכלאה, סליקה והתאמה לאינדקס שבירה, רשתית המעובדת בפרוטוקול CLARITY שונה זה הראתה שקיפות אופטית כמעט מוחלטת לאורך עובי הרשתית (איור 1A) בהשוואה לרשתיות בקרה לא מעובדות(איור 1B). תוצאה זו מצביעה על כך ששינוי זה של פרוטוקול CLARITY מספק רקמת רשתית שלמה מנוקה מספיק.
הדמיה תלת-ממדית משופרת של נוירונים ברשתית מעובדת CLARITY שונה.
כדי להעריך את האיכות והמעשיות של כתמים אימונוהיסטוכימיים המוענקים על ידי שיטת CLARITY שונה זו, הכתמנו את הבהירות מעובדת ברשתית עם נוגדנים ראשוניים שונים (טבלה 2). נוגדנים אלה מסמנים כל סוג תא מרכזי ברשתית: קולטני חרוט, תאים דו קוטביים מוט, תאים אמקרין, RGCs, ותאי גלייה, כמו גם נוגדנים נגד חלבונים סינפטיים תת תאיים. למעט סמן פעילות התא phospho-S6 (pS6), כל הנוגדנים שנבדקו הוכיחו להיות תואמים בהירות. דוגמאות אופייניות מוצגות באיור 2. ביצענו תיוג משולש עם נוגדנים נגד קונוס עצורין, טירוסין הידרוקסילאז (TH) וחלבון מחייב RNA עם שחבור מרובה (RBPMS). לקחנו סדרה של z-מחסנית תמונות מיקרוסקופיה confocal מן ONL כדי GCL. תמונות בודדות הראו את קונוסים שכותרתם arrestin ב- ONL (איור 2A), DACs עם תווית TH ב- INL (איור 2B) ו- RGCs המסומנים ב- RBPMS ב- GCL (איור 2C). תמונת כיסוי חשפה את מיקומם היחסי של נוירונים אלה לאורך כל עובי הרשתית(איור 2D). תוצאות אלה מראות כי בהירות יכולה לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים רבים ולחשוף בבירור את המבנה 3D של נוירונים על פני כל עובי הרשתית בהכנות הר שלם.
CLARITY שהשתנתה מספקת רזולוציה תלת-ממדית משופרת של תהליכים עדינים של נוירונים ברשתית וחלבונים סינפטיים.
ניתחנו עוד יותר כתמי TH ברשתיות הרכבה שלמות מעובדות בהירות(איורים 3A,B)והשווינו אותו להדמיה המתקבלת מהכנה סטנדרטית של הרכבה שלמה(איורים 3C, D). תמונות קונפוקל מראות שדנדריטים ותהליכים דמויי אקסון של DACs נחשפו בצורה הרבה יותר ברורה ברשתית מעובדת של CLARITY(איור 3A)מאשר ברשתית סטנדרטית(איור 3C). בפרט, תהליכים דמויי אקסון של DACs הציגו מבנים שלמים יותר דמויי טבעת ברשתית CLARITY (ראו הוספה באיור 3A)מאשר ברשתית רגילה (ראו הוספה באיור 3C). יש לציין כי מבנים דמויי טבעת של רשתית CLARITY שנלקחה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי(איור 3B)היו כמעט זהים לאלה שנצפו באמצעות קונפוקל(איור 3A). בנוסף, תהליכים דמויי אקסון רצו גם לכיוון הרשתית החיצונית, שנצפתה בתמונות בכיוון X-Z (איור 4A). נתונים אלה מראים כי בהירות ניתן להשתמש כדי לזהות תהליכים דמויי אקסון של DACs ברשתית הרכבה שלמה אפילו עם השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.
כאשר תת-היחידה של קולטן אמפא GluA2 וחלבון צפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD-95) נבדקו ברשתיות סטנדרטיות של הרכבה שלמה, אף אחת מהן לא זוהתה, ככל הנראה בשל חדירה לקויה של נוגדנים נגד חלבונים סינפטיים אלה לרשתית העמוקה. כדי לקבוע אם רשתיות מעובדות בהירות מאפשרות לנוגדנים אלה לחלבונים סינפטיים של אימונוסטיין, אנו מסומנים שלוש פעמים TH עם subunit GluA2 ו PSD-95. חיסון נגד GluA2 ו-PSD-95 הראה פנצ'טה מובהקת החושפת קולטני אמפא בודדים המכילים GluA2 (איור 4B) ואתרים פוסט-סינפטיים פואטיים (איור 4C), בהתאמה. תמונת שכבת-על הראתה ניקוב מסוים שנראה בתהליכי DAC (איור 4D). חשבנו על נקודה של קולוקליזציה פואטית עם כל שלושת הכתמים והצגנו אותה בתצוגות תלת מימדיות(איור 5). מכל שלוש התצוגות, TH התמזגה בבירור הן עם GluA2 והן עם PSD-95(איור 5 A-C). אלה 3D פרספקטיבה תוצאות רשתית הרכבה שלמה לאמת את הדיווחים הקודמים שלנו של ביטוי סינפטי של קולטני אמפא המכילים GluA2 על תהליכי DAC בפרוסות רשתית אנכית5,6.
איור 1. CLARITY מספקת רקמה שקופה אופטית. רשתיות עכבר תושבות שלמות עובדו בשיטת CLARITY ששונתה (ראה פרוטוקול) והרשתית כולה בתמונה עם מיקרוסקופ ניתוח, מכוסה ברשת מרובעת בגודל 0.67 ס"מ כדי להציג קנה מידה. A: רשתית הרכבה שלמה מעובדת בהירות, עם קווי רשת גלויים בבירור למרות הרקמה השקופה. החצים מציין את מיקום הרשתית. B: B: רשתית בקרה ללא בהירות מעובדת, קבועה ב- PFA למשך שעה ודגרה ב- PBS. קווי רשת מוסתרים על ידי האטימות היחסית של הרקמה. סרגל קנה מידה: כ 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. הדמיה תלת-ממדית משופרת של נוירונים על פני עובי הרשתית ברשתית המעובדת על-ידי CLARITY. רשתיות CLARITY של כל ההר היו חיסוניות עם נוגדנים נגד קונוסים, TH ו- RBPMS. התמונה מייצגת רינדור עוצמת קול תלת-ממדי של תמונת confocal מוערמת z, המוצגת בכיוון X-Z. A: קולטני חרוט (חץ) שכותרתו על ידי קונוס arrestin (כחול). כתמים קלים נראים ברשתית הפנימית (ראשי חץ), ככל הנראה עקב כתמי רקע. B: B: DAC סומה ודנדריטים (חץ) שכותרתם TH (אדום). ראשי חץ מצביעים על כלי דם ברשתית ברשתית הפנימית, הנראים לעין בשל הכשל החיסוני מרובה התוויות. ג: ג: סומטה (חץ) של RGC המסומנת על-ידי RBPMS (ירוק). ראשי חץ מצביעים על כלי דם ברשתית הנראים לעין עקב שפעת אוטומטית וכתמים לא ספציפיים של כלי הדם. ד: תמונה ממוזגת של הכתם המשולש שכותרתו, חושף את המיקום היחסי של נוירונים אלה על פני עובי הרשתית, עם פוטורצפטורים חרוט ממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית, DACs בשכבה הגרעינית הפנימית, ו RGCs בשכבת תא הגנגליון. קנה המידה של תצוגת אמצעי האחסון מסומן במרווחים של 20 מיקרומטר.
איור 3. CLARITY חושף מבנים עדינים של מורפולוגיה DAC. המערכת החיסונית של TH בוצעה ברשתיות (C ו-D) סטנדרטיות. תמונות מוערמות Z צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (A ו- C) ופלואורסצנטית (B ו- D). הוספה ממישור אופטי יחיד בכל תמונה מדגישה מבנים דמויי טבעת שנוצרו ככל הנראה על-ידי תהליכים דמויי אקסון. ראשי חץ מציינים סומטה DAC, ומבנים רבים דמויי טבעת גלויים (דוגמאות מסומנות על ידי חצים) ב מקלעת צפופה של דנדריטים ותהליכים דמויי אקסון מתגלים ברשתיות מעובדות בהירות (A ו- B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. CLARITY שהשתנתה מספקת רזולוציה תלת-ממדית משופרת של מבנים דנדריטיים עדינים וחלבונים סינפטיים. חיסון משולש בוצע ברשתיות הרכבה שלמות מעובדות בהירות עם נוגדנים נגד TH, GluA2 ו- PSD-95. עיבוד אמצעי אחסון שוחזר מהדמיה קונפוקלית מוערמת z והוצג בכיוון X-Z זוויתי. A: סומטה DAC (ראשי חץ) עם תווית TH בשכבה הגרעינית הפנימית ותהליכים (חצים צהובים) המריבדים בשכבת ה-plexiform הפנימית הדיסטלית (אדום). חצים לבנים מצביעים על תהליכים צנטריפוגליים הנמשכים לכיוון הרשתית החיצונית. B: B: ביטוי ניקוב צפוף של קולטני אמפא המכילים GluA2 על פני שכבת plexiform הפנימית (ירוק). חץ מציין שפעת אוטומטית מכלי דם ברשתית. ג: ג: Puncta חושף אתרים פוסט סינפטיים שכותרתו PSD-95 בשכבת plexiform הפנימית (כחול). החצים מצביעים על כלי דם, לכאורה עקב שימוש בנוגדן חד שבטי לעכבר נגד PSD-95. ד: תמונת שכבת-על המדגימה חפיפה של תהליכי DAC בעלי תווית TH עם הביטוי של GluA2 ו- PSD-95. קנה המידה של תצוגת אמצעי האחסון מסומן במרווחים של 20 מיקרומטר.
איור 5. ביטוי סינפטי של קולטני אמפא המכילים GluA2 על DACs. נקודה של קולוקליזציה משולשת של TH, GluA2 ו- PSD-95 המוצגת באיור 4 נבחרה ונחקרה בתלת-ממד. A1 מייצג מקטע של תהליך DAC (אדום) בכיוון X-Z (A5). A2 ו- A3 מציגים סימני פיסוק בודדים של GluA2 (ירוק) ודייקן PSD-95 (כחול), בהתאמה, באותו כיוון. התמונה הממוזגת (A4) מדגימה קולוקליזציה משולשת של TH, GluA2 ו- PSD-95 (חץ). B1-B4 מציג את אותה נקודת קולוקליזציה (חץ) בכיוון Y-Z (B5). C1-C4 מציג קולוקליזציה של אותה נקודה (חץ) במישור X-Y (C5). קולוקליזציה משולשת ניכרת בבירור בכל אוריינטציה. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| תמיסה | הרכב | הערות |
| 0.1 מ' PBS | 137 מ"מ NaCl | כוונון pH ל- 7.4 |
| 26.8 מ"מ KCl | ||
| 10.1 מ"מ Na2HPO4 | ||
| 17.6 מ"מ KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% אקרילאמיד | היכונו על קרח, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס |
| 0.25% VA-044 | ||
| 0.1 מ' PBS | ||
| בסט (PBST) | 0.1% (v/v) טריטון-X-100 | |
| 0.1 מ' PBS | ||
| פתרון חסימה | 2% NDS או 1% BSA | |
| 0.01% NaN3 | ||
| בסט (PBST) | ||
| 0.1 מאגר פוספט M | 11.93 גרם Na2HPO4/ליטר | כוונון pH ל- 7.5 |
| 15.34 גר' NaH2PO4/ליטר | ||
| ddH2O | ||
| sRIMS | 70% סורביטול | כוונון pH ל- 7.5 עם NaOH |
| 0.1% טווין-20 | ||
| 0.01% NaN3 | ||
| 0.02 M מאגר פוספט | ||
שולחן 1. הרכב פתרונות.
| נוגדן | IHC | מארח | דילול | קטלוג # | הספק | מזהה רישום Ab | יעד |
| אופסין כחול רגיש | +3 | פוליקלונל עז | 1:1000 | SC-14363 | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | AB_2158332 | קונוס S |
| מעצר חרוט | +2 | פוליקלונל ארנב | 1:1000 | AB15282 | EMD מילפור | AB_1163387 | חרוט |
| חלבון קינאז C אלפא (PKC-α) | +3 | פוליקלונל ארנב | 1:1000 | SC-208 | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | AB_2168668 | תא דו קוטבי רוד |
| חלבון חומצי פרפור גליאלי (GFAP) | +3 | פוליקלונל עז | 1:500 | SC-6170 | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | AB_641021 | אסטרוציטים (אסטרוציטים) |
| טירוסין הידרוקסילאז (TH) | +3 | כבשים פוליקלונליות | 1:500 | AB1542 | EMD מילפור | AB_90755 | תא אמקרין דופאמין |
| טירוסין הידרוקסילאז (TH) | +2 | פוליקלונל ארנב | 1:500 | OPA1-04050 | תרמופישר | AB_325653 | תא אמקרין דופאמין |
| כולין אצטילטרנספראז (ChAT) | +1 | פוליקלונל עז | 1:500 | AB144P | EMD מילפור | AB_2079751 | תא אמקרין סטארבורסט |
| חלבון מחייב RNA עם שחבור מרובה (RBPMS) | +1 | פוליקלונל חזיר גינאה | 1:2000 | ABN1376 | EMD מילפור | AB_2687403 | תא גנגליון רשתית |
| גלוA2 | +3 | פוליקלונל ארנב | 1:500 | AB1768-I | EMD מילפור | AB_2247874 | קולטן אמפא אמפר אמפר |
| גלוA2 | +2 | חד שבטי של העכבר | 1:250 | MABN1189 | EMD מילפור | AB_2737079 | קולטן אמפא אמפר אמפר |
| חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD-95) | +3 | חד שבטי של העכבר | 1:1000 | 75-028 | נוירומאב | AB_2877189 | אתרים סינפטיים |
| פוספו-S6 (עמ' 6) | 0 | פוליקלונל ארנב | 1:500 | 44-923G | תרמופישר | AB_2533798 | סמן פעילות תא |
שולחן 2. סיכום של נוגדנים ראשוניים שנבדקו. אגדת IHC: +3 = עקבי, כתמים ספציפיים מאוד; +2 = כתמים טובים באופן עקבי, רקע מינימלי; +1 = כתמים טובים, קצת רקע; 0 = לא תואם בהירות.
| מארח | מיני יעד | היטה | דילול | הספק |
| חמור | אנטי כבשים | אלקסה פלואור 568 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| חמור | אנטי כבשים | אלקסה פלואור 594 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| חמור | אנטי ארנב | אלקסה פלואור 488 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| חמור | אנטי ארנב | אלקסה פלואור 594 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| עז | אנטי ארנב | אלכסה פלואור 647 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| חמור | נגד עכבר | אלקסה פלואור 488 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| חמור | נגד עכבר | אלכסה פלואור 647 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| חמור | אנטי עז | אלקסה פלואור 568 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| חמור | אנטי עז | אלקסה פלואור 594 | 1:500 | אינוויטרוגן |
| עז | חזיר נגד גינאה | אלקסה פלואור 488 | 1:500 | אינוויטרוגן |
שולחן 3. סיכום של נוגדנים משניים שנבדקו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינוי פרוטוקול CLARITY עבור רשתית הרכבה שלמה.
פישטנו את פרוטוקול CLARITY כדי להשיג פולמור הולם ללא צורך בפינוי ואקום או תא ייבוש, כפי שנעשה ברוב המחקריםהקודמים 7,9,11. תהליך הפולמליזציה מעוכב על ידי חמצן, הדורש כי המדגם להיות מבודד מהאוויר במהלך שלב פולמור של הפרוטוקול. עם זאת, במקום degassing עם חנקן, מצאנו כי כיסוי המדגם עם שמן מבודד מספיק את המדגם כדי לאפשר פולמור מבלי להשפיע לרעה על שאר הפרוטוקול לאחר שטיפה יסודית, כפי שתועד בעבר12. פישטנו עוד יותר את הפרוטוקול בשיטת סליקה פסיבית כדי להגביל את הסיכון להשחמת רקמות ולנזק למבנה הרקמות הקשור לקרחת אלקטרופורטיקה11. הסליקה הפסיבית מואצת על ידי תסיסה עדינה וטמפרטורה גבוהה, ומאפשרת ניקוי רקמות מלא תוך יומיים בלבד. במהלך תקופה זו, השחתה מספקת מושגת כדי לגרום לרקמות שקופות אופטית תוך מזעור אובדן חלבונים וביומולקולות אחרות כחלק בלתי נפרד מהמבנה התאי והכתמים האימונוהיסטוכימיים.
CLARITY משמר חלבונים של נוירונים ברשתית ותאי גליה בהכנות הר שלם.
התוצאות שלנו מראות שכמעט כל הנוגדנים שנבדקו עובדים ברשתיות מעובדות של CLARITY. נוגדנים אלה מסמנים פוטורצפטורים, תאים דו קוטביים, תאי אמקרין, RGCs ותאי גליה. למרות שלא הצלחנו לבדוק נוגדנים עבור תת סוגים של כל סוג של נוירונים ברשתית, התוצאות שלנו מרמזות כי רשתית מעובדת CLARITY יכול לשמש עבור רוב סמנים הסלולר ברשתית. למרות שרוב הנוגדנים שבדקנו יכולים גם לאמונוסטיין של נוירונים ברשתית מעובדת שאינה CLARITY, מצאנו כי CLARITY אפשר חדירת נוגדנים נאותה לרקמה העמוקה של הרשתית, מתן ספציפיות טובה של כתמים בשכבה האמצעית של הרשתית. בנוסף, מצאנו כי CLARITY שיפרה את חדירת האור לאורך עובי הרשתית, צמצמה את פיזור האור ואפשרה הדמיה ברזולוציה גבוהה אפילו דרך השכבות העמוקות ביותר. גורמים אלה תורמים לשיפור הן בכתמים והן בהדמיה ברשתית הרכבה שלמה המעובדת על ידי CLARITY בהשוואה ל- IHC13רגיל שאינו CLARITY . הרקע המצומצם ועיבודי הנפח וההדמיה התת-ממדית המשופרים מאפשרים חקירה מלאה של מבנים תאיים בכל השכבות על עובי הרשתית.
CLARITY חושפת תהליכים עדינים ומבנה סינפטי של DACs ברשתיות של הרכבה שלמה.
התוצאות שלנו מראות כי מבנים דמויי טבעת ותהליכים צנטריפוגליים של DACs מתגלים ב- CLARITY מעובדים טוב יותר מאשר ברשתיות שאינן בהירות של הרכבה שלמה. בפרט, immunostaining עם רקמה מעובדת CLARITY מאפשר רזולוציה טובה של מבנים עדינים אלה אפילו עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית ללא צורך בהדמיה confocal. בהתחשב בחשיבות של DACs בתפקוד החזותי, הכנת CLARITY יכולה לשמש כדי לחקור את המבנים של DACs ברשתית רגילה ושינויים מורפולוגיים בתנאים חולים.
לאחר immunostaining עבור PSD-95 ו GluA2 עם רקמת wholemount סטנדרטית, ראינו מעט מאוד תיוג של מבנים תת תאיים אלה בשכבות העמוקות של הרשתית, המציין חדירת נוגדנים ירודה. היישום של פרוטוקול CLARITY מאפשר כתמים ברורים של חלבונים אלה בשכבות הרשתית הפנימיות, המציין חדירת נוגדנים משופרת לרקמה העמוקה. התוצאות שלנו מראות כי בהירות מאפשרת זיהוי של חלבונים סינפטיים על תהליכי DAC ברשתיות הר שלם, אשר נצפתה בדרך כלל בהכנות פרוסה אנכית6. מאז תהליכים דמויי אקסון לא ניתן להבחין בין דנדריטים בפרוסות אנכיות, בהירות רשתית הרכבה שלמה לספק הזדמנות לקבוע אם כניסות סינפטיות DACs מתאי עצב אחרים כגון תאים דו קוטביים IPRGCs להתרחש דנדריטים, תהליכים דמויי אקסון, או שניהם5,6. מאז קולטני אמפא וחלבוני PSD-95 מופצים באופן נרחב ברחבי IPL, הביטוי של חלבונים אלה על DACs לשמש דוגמה מצוינת עבור רשתית בהירות לשמש לזיהוי של חלבונים סינפטיים בנוירונים רשתית אחרים.
שיקולים, מגבלות ויישומים עתידיים של פרוטוקול CLARITY עבור רשתיות טעינה שלמות.
ראשית, פרוטוקולי הפולמליזציה והסליקה עבור רשתיות הרכבה שלמות מעובדות של CLARITY מוסיפות מספר ימים לתהליך הכנת הרקמות. עם זאת, השיטה עדיין נעשית מעשית מאוד על ידי העובדה כי רטינות הבהיר ניתן לאחסן PBS המכיל נתרן אזיד עד שבועיים עם השפלה רקמות מינימלית. שנית, הרחבה מסוימת של הרקמה נצפתה לאורך כלתהליךהסליקה כפי שתועד ביישומים קודמים של CLARITY 7,11. עם זאת, מצאנו כי הרשתית חזרה לגודל מקורי בקירוב עם שיווי משקל עם פתרון התאמת אינדקס שבירה. השינויים הקטנים הפוטנציאליים בנפח הרקמות לא יגרמו לעיוות משמעותי של המבנה התאי או התת-תאי7,11. שלישית, כאשר הדמיה דגימות מוח עבות יותר, מטרת המיקרוסקופ היא לעתים קרובות שקוע ישירות במדיה הרכבה כדי לאפשר התאמה מלאה אינדקס שבירה מן העדשה מיקרוסקופ דרך הרקמה12. עם דגימות דקות יותר כגון הרשתית, השתמשנו coverslips להרכבה כדי להפוך את הדגימות להחמיא ועוד יותר עבור הדמיה. ההשפעות של שבירה דרך העטיפה נראות מינימליות בהדמיה. רביעית, חלק מהתמונות שלנו מראות כתמי כלי דם לא ספציפיים מכיוון שלא חלחלנו לכל החיה בזלוף תוך-סחיר (הציע להשתמש בו כדי למנוע כתמים לא ספציפיים) לפני שאספנו את העיניים. לבסוף, הפרוטוקול הנוכחי המותאם לעכברים יכול לשמש רשתית של מינים אחרים. בפרט, רשתיות של בעלי חיים גדולים כגון כלבים, חזירים, סוסים ופרימטים הם הרבה יותר עבים מאלה של עכברים. פרוטוקול CLARITY זה יכול להפוך את הרשתיות של בעלי חיים אלה לשקופות יותר מבחינה אופטית לאחר הסרת השומנים ולשמר את המבנים העדינים של נוירונים ברשתית ואת החלבונים שלהם לחיסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לבינג יה, ניית'ן ספיקס והאו ליו על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למענקי בריאות EY022640 (D.-Q.Z.) ופרס מחקר הסטודנטים של אוניברסיטת אוקלנד (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
