Summary
Ici, nous présentons un protocole pour adapter la méthode CLARITY des tissus cérébraux pour les rétines de montage entier afin d’améliorer la qualité de la coloration immunohistochimique standard et de l’imagerie à haute résolution des neurones rétinins et de leurs structures subcellulaires.
Abstract
La méthode de dlipidation de l’hydrogel tissulaire (CLARITY), développée à l’origine par le laboratoire Deisseroth, a été modifiée et largement utilisée pour l’immunomarquage et l’imagerie d’échantillons de cerveau épais. Cependant, cette technologie de pointe n’a pas encore été utilisée pour les rétines à montage entier. Bien que la rétine soit partiellement transparente, son épaisseur d’environ 200 μm (chez la souris) limite toujours la pénétration des anticorps dans les tissus profonds et réduit la pénétration de la lumière pour l’imagerie à haute résolution. Ici, nous avons adapté la méthode CLARITY pour les rétines de souris à montage entier en les polymérisant avec un monomère d’acrylamide pour former un hydrogel nanoporeux, puis en les éliminant dans du sulfate de dodécyle de sodium pour minimiser la perte de protéines et éviter les lésions tissulaires. des rétines CLARTÉ-traitées immunostained avec des anticorps pour les neurones rétiniens, les cellules glial, et les protéines synaptiques, montés dans une solution d’appariement d’index réfractif, et imagés. Nos données démontrent que clarity peut améliorer la qualité de la souillure et de l’imagerie immunohistochemical standard pour les neurones rétiniennes et les cellules gliales dans la préparation de montage entier. Par exemple, la résolution 3D des structures axon-comme et dendritiques fines des cellules dopaminergiques d’amacrine ont été beaucoup améliorées par la CLARTÉ. Par rapport aux rétines à montage entier non traitées, CLARITY peut révéler une immunomarquage pour les protéines synaptiques telles que la protéine de densité postsynaptique 95. Nos résultats montrent que CLARITY rend la rétine plus transparente optiquement après l’élimination des lipides et préserve les structures fines des neurones rétiniennes et de leurs protéines, qui peuvent être couramment utilisées pour obtenir une imagerie à haute résolution des neurones rétiniennes et de leurs structures subcellulaires dans la préparation de montage entier.
Introduction
La rétine vertébrée est peut-être la partie la plus accessible du système nerveux central (SNC), et elle sert d’excellent modèle pour étudier le développement, la structure et la fonction du cerveau. Cinq classes de neurones de la rétine sont réparties en trois couches nucléaires séparées par deux couches plexiformes. La couche nucléaire externe (ONL) est constituée de photorécepteurs classiques (tiges et cônes) qui convertissent la lumière en signaux électriques. Les signaux électriques sont traités par les neurones de la couche nucléaire interne (INL), y compris les cellules bipolaires, horizontales et amacrines, puis transmis aux cellules ganglionnaires rétiniennes (RGCs) dans la couche cellulaire ganglionnaire (GCL). Les RGCs sont les neurones de sortie de la rétine, avec les axones projetant vers le cerveau pour contribuer à la fonction visuelle image-formation et non-formation d’image. En outre, trois types de cellules gliales (cellules de Muller, astroglie et microglie) fournissent des nutriments aux neurones et protègent les neurones contre les changements nocifs dans leur environnement extracellulaire.
Une sous-population spécialisée de cellules amacrines produit et libère de la dopamine, un neuromodulateur important dans le SNC, reconfigurant les circuits neuronaux rétiniennes lors de l’adaptation à la lumière1,2. Les cellules amacrines dopaminergiques (DAC) ont une caractéristique unique des profils morphologiques. Leur somata sont situés dans l’INL proximal avec des dendrites ramifiant dans la partie la plus distale de la couche plexiforme interne (IPL). Les processus axon-like des DAC sont unmyelinated, minces et longs, peu ramifiés, et portent des varicosities (les sites de libération de dopamine). Ils forment un plexus dense avec des dendrites dans l’IPL, y compris des structures en forme d’anneau autour de la somata des cellules amacrines AII. Les axones traversent également l’INL vers la BPO, formant une voie centrifuge à travers la rétine3. Nous avons démontré que les processus DAC expriment des récepteurs en réponse à la libération de glutamate par les neurones présynaptiques, y compris les cellules bipolaires et les cellules ganglionnaires rétiniennes intrinsèquement photosensibles (ipRGCs)4,5,6. Cependant, il n’est pas clair si les récepteurs du glutamate s’expriment sur les axones, les dendrites, ou les deux puisqu’ils sont coupés en sections rétiniennes verticales et ne peuvent pas être distingués les uns des autres5,6. Immunostaining doit être effectué dans les rétines entières de montage pour indiquer la ramification tridimensionnelle des DAC et la présence des récepteurs de glutamate sur les compartiments subcellulaires. Bien que la rétine soit relativement transparente, l’épaisseur d’une rétine à montage entier de souris est d’environ 200 μm, ce qui limite la pénétration des anticorps dans les tissus profonds et réduit la pénétration de la lumière pour l’imagerie à haute résolution en raison de la diffusion de la lumière dans les tissus. Pour surmonter ces limitations, nous avons adapté la méthode de délidation de l’hydrogel tissulaire compatible immunostaining (CLARITY) développée récemment pour les sections épaisses du cerveau aux rétines de souris à montage entier7.
La méthode CLARITY a été initialement développée par le laboratoire Deisseroth pour l’immunomarquage et l’imagerie d’échantillons de cerveau épais7. Il utilise un détergent puissant, le dodécyl sulfate de sodium (SDS) et l’électrophorèse pour éliminer les composants lipidiques (qui provoquent la diffusion de la lumière dans les tissus), laissant les protéines et les acides nucléiques en place. Les lipides éliminés sont remplacés par un échafaudage transparent composé de monomères d’hydrogel tels que l’acrylamide pour soutenir la structure protéique restante. Le tissu dégagé peut être marqué par immunohistochimie et étiqueté avec une profondeur de pénétration de la lumière sensiblement accrue à travers le tissu (jusqu’à plusieurs millimètres sous la surface du tissu). Depuis lors, la méthode CLARITY a été optimisée et simplifiée par plusieurs groupes de recherche8,9,10. Un protocole CLARITY modifié utilise une technique de compensation passive pour éviter les dommages tissulaires possibles produits par électrophorèse pour effacer l’ensemble du cerveau et d’autres organes intacts11. Cependant, cette méthode n’a pas encore été appliquée aux rétines à montage entier. Ici, nous avons adapté la technique passive CLARITY pour les rétines à montage entier afin de les rendre plus transparentes pour l’immunohistochimie et l’imagerie. Nous avons constaté qu’une majorité des protéines rétiniennes examinées ont été préservées pendant ce processus pour immunohistochemistry. En utilisant la solution d’appariement de l’indice de réfraction, nous avons pu imager les neurones rétiniennes sur l’épaisseur d’environ 200 μm de l’ONL à la GCL dans des rétines à montage entier.
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Protocol
Les soins de la souris et toutes les procédures expérimentales ont été effectués conformément aux lignes directrices des National Institutes of Health pour les animaux de laboratoire et ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’Oakland (protocole no 18071).
NOTA : Les noms des solutions et de leurs compositions sont indiqués dans le tableau 1.
1. Préparation des tissus
- Euthanasier la souris avec un surdosage de CO2, suivi d’une luxation cervicale.
- Enucleate les yeux avec des pinces incurvées et les transférer dans une petite boîte de Pétri avec 0,1 M PBS (Tableau 1). Sous un microscope de dissection, piquer un petit trou le long de la jonction cornée-sclérotique avec une aiguille. Transférer à 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 1 heure.
- Recarz l’œil dans un plat avec du PBS. Sous un microscope de dissection, utilisez des ciseaux de dissection pour couper tout autour de la jonction cornée-sclérotique. Retirez la cornée et le cristallin. Couper à la base du nerf optique et décoller soigneusement la sclérotique avec une pince pour isoler la rétine.
- Faites quatre petites coupes uniformément autour de la rétine et utilisez une brosse à pointe fine trempée dans du PBS pour la déposer à plat (côté GCL vers le bas) en forme de trèfle sur une petite coupe carrée de papier filtre à nitrocellulose pour stabiliser la rétine.
- Transférer la rétine à l’aide d’une pince pour maintenir le coin du papier nitrocellulose (sans toucher la rétine montée) et la placer dans une plaque de 48 puits avec 4% de PFA pendant 1 heure.
- Transférer le papier filtre et la rétine dans un puits avec pbs et laver (3x pendant 5 min chacun).
- Transvaire sur A4P0(tableau 1)et incuber pendant une nuit à 4 °C avec une agitation douce.
- Pipetter l’huile végétale dans le puits pour couvrir complètement la solution A4P0. Incuber au bain-marie à 40 °C pendant 3 heures sans secouer.
- Laver (3x pendant 5 min chacun) dans du PBS, en vous assurant que toute l’huile a été rincée. Si nécessaire, utilisez un tuyau pour retirer soigneusement l’huile restante du haut du puits avant le dernier rinçage.
- Incuber dans une FDS à 10% à 40 °C pendant deux jours en secouant doucement. Remplacez la FDS par une solution fraîche le deuxième jour.
- Transférer le papier filtre et la rétine dans le PBS avec Triton-X-100 (PBST, tableau 1)et laver (5x pour 1,5 h chacun).
- Conserver à 4 °C dans du PBST contenant 0,01 % d’azide de sodium(NaN3)ou passer directement à l’immunomarquage.
2. Immunomarquage et appariement de l’indice de réfraction
- Retirez la rétine du papier filtre en l’épluchant doucement avec une brosse à pointe fine dans du PBST.
- Incuber la rétine dans un anticorps primaire(tableau 2)dilué dans une solution bloquante(tableau 1)pendant 2 jours à 40 °C avec une légère secousse.
- Laver (5x, 1,5 h chacun) en PBST.
- Incuber avec les anticorps secondaires appropriés(tableau 3)dilués dans une solution bloquante pendant 2 jours à 40 °C avec une légère secousse et protéger de la lumière pendant le reste de la procédure.
- Lavage (5x, 1,5 h chacun) dans un tampon phosphate 0,02 M (voir tableau 1).
- Incuber dans une solution d’appariement de l’indice de réfraction à base de sorbitol (sRIMS, voir tableau 1)à 40 °C pendant la nuit avec une légère secousse.
3. Montage
- Contour d’une lame de verre de 18 mm x 18 mm x 1,5 mm avec un marqueur permanent à pointe fine pour marquer une limite carrée à l’arrière d’une lame de microscope en verre.
- Retournez la glissière et utilisez une seringue pour tracer la limite avec une fine ligne de graisse de silicone sur le devant de la glissière, laissant un petit espace dans un coin pour que la solution de montage excédentaire s’échappe.
- Transférer la rétine au centre de la zone délimitée et disposer avec une brosse à pointe fine de sorte qu’elle se trouve à plat avec le côté photorécepteur contre la lame de verre.
- Pipetter environ 60 μL de sRIMS afin qu’il couvre la rétine aplati et s’étende jusqu’à un coin de l’enceinte, en prenant soin que la rétine reste plate et en place.
- Appliquez la lamelle à partir du coin avec le sRIMS et abaissez-la lentement jusqu’à ce qu’elle touche la graisse de tous les côtés, en évitant la formation de bulles d’air.
- Placez une pile de 3 lamelle de chaque côté de la rétine montée comme entretoise. Utilisez le bord long d’une autre diapositive pour appuyer sur la lame de couverture afin que le support soit plat et uniforme.
- Conserver les diapositives à plat à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
4. Imagerie
- Échantillons d’images sur un microscope à fluorescence conventionnel ou un microscope confocal(Table des matériaux). Commencez par placer la lame sur l’étage du microscope et localiser l’échantillon.
REMARQUE: Si un microscope objectif inversé est utilisé, placez la lame à l’envers sur la scène, en vous assurant d’abord que les zones exposées de la lame sont débrêchées de toute graisse de silicone et de toute solution de montage. - Pour obtenir des images empilées z d’échantillons co-marqués, concentrez-vous d’abord sur le signal dans chaque canal individuellement et définissez le temps d’exposition ou la vitesse de balayage, pour les microscopes à fluorescence ou confocaux, respectivement.
- Définissez la plage de la pile z en définissant manuellement le plan focal en haut et en bas de la plage souhaitée, ou en définissant le point médian, puis en spécifiant une plage autour du milieu.
- Ajustez la taille de l’étape ou le nombre de tranches comme vous le souhaitez.
- Capturez l’image et enregistrez le fichier d’origine ainsi que l’exportez en tant que fichier TIFF ou autre format souhaité.
5. Analyse d’image
- Utilisez le logiciel d’analyse d’image de choix(Table des matériaux)pour ajuster la luminosité et le contraste dans chaque canal jusqu’à ce qu’une clarté optimale soit atteinte à la fois dans les images uniques et dans le rendu en 3 dimensions de la pile z.
REMARQUE: Si la taille de pas sélectionnée est suffisamment petite, la déconvolution 3D peut également être effectuée pour améliorer le signal.
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Representative Results
Les rétines modifiées traitées par CLARITY sont des tissus optiquement transparents.
Pour formuler une méthode de nettoyage des tissus compatible avec les applications immunohistochimiques dans la rétine tout en fournissant une délidation adéquate et en conservant l’intégrité structurelle des protéines cellulaires, nous avons adapté la méthode de nettoyage des tissus CLARITY aux rétines de souris à montage entier. Nous avons pu simplifier le protocole et le modifier pour les rétines à montage entier (voir Protocole). Après avoir terminé l’hybridation tissulaire, le dégagement et l’appariement de l’indice de réfraction, les rétines traitées avec ce protocole CLARITY modifié ont montré une transparence optique presque complète sur toute l’épaisseur de la rétine(figure 1A)par rapport aux rétines de contrôle non traitées(figure 1B). Ce résultat indique que cette modification du protocole CLARITY fournit suffisamment de tissu rétine de montage entier dégagé.
Amélioration de l’imagerie 3D des neurones dans les rétines traitées clarity modifiées.
Pour évaluer la qualité et la praticité de la coloration immunohistochimique offerte par cette méthode CLARITY modifiée, nous avons coloré clarity traité rétines avec divers anticorps primaires (Tableau 2). Ces anticorps marquent chaque type de cellule majeur dans la rétine: photorécepteurs coniques, cellules bipolaires en bâtonnets, cellules amacrines, RGCs et cellules gliales, ainsi que des anticorps contre les protéines synaptiques subcellulaires. À l’exception du marqueur d’activité cellulaire phospho-S6 (pS6), tous les anticorps testés se sont avérés compatibles avec CLARITY. Des exemples typiques sont illustrés à la figure 2. Nous avons exécuté le étiquetage triple avec des anticorps contre l’arrestin de cône, l’hydroxylase de tyrosine (TH), et la protéine ARN-contraignante avec l’épissage multiple (RBPMS). Nous avons pris une série d’images de microscopie confocale z-pile de l’ONL à la GCL. Des images individuelles ont montré les cônes marqués d’arrestin dans l’ONL(figure 2A),les DAC marqués par TH dans l’INL(figure 2B)et les RGCs marqués rbpms dans le GCL(figure 2C). Une image de superposition a révélé l’emplacement relatif de ces neurones sur toute l’épaisseur de la rétine(figure 2D). Ces résultats suggèrent que la CLARTÉ puisse améliorer la qualité de beaucoup de souillure immunohistochemical standard et indiquer clairement la structure 3D des neurones à travers toute l’épaisseur de la rétine dans des préparations de tout-montage.
Modified CLARITY offre une résolution 3D améliorée des processus fins des neurones rétiniennes et des protéines synaptiques.
Nous avons ensuite analysé la coloration TH dans des rétines à montage entier traitées par CLARITY(figures 3A,B)et l’avons comparée à l’imagerie obtenue à partir d’une préparation standard à montage entier(figures 3C,D). Les images confocales montrent que les dendrites et les processus axoniques des DAC ont été révélés beaucoup plus clairement dans une rétine traitée par CLARITY(figure 3A)que dans une rétine standard(figure 3C). En particulier, les procédés de type axone des DAC présentaient des structures en forme d’anneau plus complètes dans une rétine CLARITY (voir un insert de la figure 3A)que dans une rétine standard (voir un insert de la figure 3C). Notamment, les structures en forme d’anneau d’une rétine CLARITY prises par microscopie à fluorescence(figure 3B)étaient presque identiques à celles observées à l’aide de confocaux(figure 3A). En outre, des processus de type axone ont également couru vers la rétine externe, ce qui a été observé dans les images orientées X-Z (Figure 4A). Ces données suggèrent que la CLARTÉ puisse être employée pour identifier axon-comme des processus de DAC dans les rétines entières-montées même avec l’utilisation de la microscopie conventionnelle de fluorescence.
Quand la sous-unité GluA2 d’AMPA-récepteur et la protéine postsynaptic de densité 95 (PSD-95) ont été examinées dans les rétines standard de tout-monter, ni l’un ni l’autre n’ont été détectés, probablement en raison de la pénétration pauvre des anticorps contre ces protéines synaptiques dans la rétine profonde. Pour déterminer si les rétines traitées par CLARITY permettent à ces anticorps d’immuno-tacheter des protéines synaptiques, nous avons triplé TH marqué avec la sous-unité GluA2 et PSD-95. Immunostaining contre GluA2 et PSD-95 a montré puncta distinct révélant les récepteurs AMPA individuels GluA2-contenants (Figure 4B) et les sites postsynaptiques putatifs (Figure 4C), respectivement. Une image de superposition a montré quelques puncta apparents sur les processus DAC (Figure 4D). Nous avons image un point de colocalisation putative avec les trois taches et l’avons présenté en vues 3D (Figure 5). De ces trois points de vue, TH s’est clairement colocalisé avec GluA2 et PSD-95(Figure 5 A-C). Ces résultats de perspective 3D des rétines de montage entier valident nos rapports précédents de l’expression synaptique des récepteurs AMPA contenant GluA2 sur les processus DAC dans les tranches rétiniennes verticales5,6.
Figure 1. CLARITY fournit des tissus optiquement transparents. Les rétines de souris à monture entière ont été traitées avec la méthode CLARITY modifiée (voir protocole) et la rétine entière esso traductionnée avec un microscope de dissection, superposée sur une grille carrée de 0,67 cm pour montrer l’échelle. R : Rétine à montage entier traitée par CLARITY, avec des lignes de grille clairement visibles à travers le tissu transparent. Les flèches délimitent le placement de la rétine. B : Rétine de contrôle non-CLARITY-traitée, fixée dans PFA pendant 1 h et incubée dans PBS. Les lignes de grille sont obscurcies par l’opacité relative du tissu. Barre d’échelle: environ 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Amélioration de l’imagerie 3D des neurones sur l’épaisseur de la rétine dans les rétines traitées par CLARITY. des rétines de CLARTÉ de Entier-montage immunostained avec des anticorps contre l’arrestin, le TH, et le RBPMS de cône. L’image représente un rendu de volume 3D d’une image confocale empilée en z, affichée dans une orientation X-Z. R : Photorécepteurs cononiques (flèche) marqués par l’arrestine conique (bleu). Une légère tache est visible dans la rétine interne (pointes de flèche), probablement en raison de la coloration de fond. B : Soma dac et dendrites (flèche) étiquetés par TH (rouge). Les pointes de flèche indiquent les vaisseaux sanguins rétiniens dans la rétine interne, visibles en raison de l’immunomarquage multimarques. C : RGC somata (flèche) étiqueté par RBPMS (vert). Les pointes de flèche indiquent les vaisseaux sanguins rétiniens visibles en raison de l’autofluorescence et de la coloration non spécifique des vaisseaux sanguins. D : Image fusionnée de la triple coloration étiquetée, révélant le placement relatif de ces neurones à travers l’épaisseur de la rétine, avec des photorécepteurs de cône situés dans la couche nucléaire externe, des DAC dans la couche nucléaire interne, et des RGCs dans la couche de cellules ganglionnaires. L’échelle de la vue de volume est marquée par incréments de 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 3. CLARITY révèle des structures fines de morphologie dac. TH immunostaining a été exécuté dans les rétines CLAIR-traitées(A et B)et standard(C et D). des images Z-empilées ont été prises utilisant confocal(A et C) et la microscopie de fluorescence (B et D). Un insert à partir d’un seul plan optique dans chaque image met en évidence des structures en forme d’anneau vraisemblablement formées par des processus de type axone. Les pointes de flèche indiquent la somata dac, et de nombreuses structures en forme d’anneau sont visibles (les exemples sont indiqués par des flèches) dans le plexus dense des dendrites et des processus en forme d’axone révélés dans les rétines traitées par CLARITY(A et B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Modified CLARITY offre une résolution 3D améliorée des structures dendritiques fines et des protéines synaptiques. Immunostaining triple a été exécuté dans les rétines entier-montées CLARTÉ-traitées avec des anticorps contre TH, GluA2, et PSD-95. Un rendu de volume a été reconstruit à partir de la formation image confocale z-empilée et présenté dans une orientation X-Z inclinée. R : Somata DAC (pointes de flèche) marqués TH dans la couche nucléaire interne et les processus (flèches jaunes) stratifiant dans la couche plexiforme interne distale (rouge). Les flèches blanches indiquent des processus centrifuges s’étendant vers la rétine externe. B : Expression ponctuée dense des récepteurs AMPA contenant du GluA2 à travers la couche plexiforme interne (vert). Arrow indique l’autofluorescence d’un vaisseau sanguin rétinien. C : Puncta révélant des sites post-synaptiques étiquetés par PSD-95 dans la couche plexiforme interne (bleu). Les flèches indiquent les vaisseaux sanguins, apparents en raison de l’utilisation d’un anticorps monoclonal de souris contre PSD-95. D : Image de superposition montrant le chevauchement des processus DAC étiquetés TH avec l’expression de GluA2 et PSD-95. L’échelle de la vue de volume est marquée par incréments de 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Expression synaptique des récepteurs AMPA contenant du GluA2 sur les DAC. Un point de triple colocalisation putative de TH, GluA2 et PSD-95 illustré à la figure 4 a été sélectionné et étudié en 3D. A1 représente un segment d’un processus DAC (rouge) dans l’orientation X-Z (A5). A2 et A3 montrent un seul punctum GluA2 (vert) et un punctum PSD-95 (bleu), respectivement, dans la même orientation. L’image fusionnée (A4) montre la triple colocalisation de TH, GluA2 et PSD-95 (flèche). B1-B4 montrent le même point de colocalisation (flèche) dans une orientation Y-Z (B5). C1-C4 montrent la colocalisation du même point (flèche) dans le plan X-Y (C5). La triple colocalisation est clairement apparente dans chaque orientation. Barre d’échelle: 2 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| solution | composition | Notes |
| 0,1 M PBS | NaCl 137 mM | Ajuster le pH à 7,4 |
| 26,8 mM KCl | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% d’acrylamide | Préparer sur la glace, la partie aliquote et entreposer à -20 ºC |
| 0,25 % VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | 0,1 % (v/v) Triton-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Solution de blocage | 2 % de SND ou 1 % de BSA | |
| 0,01 % NaN3 | ||
| PBST | ||
| 0,1 M Tampon phosphate | 11,93 g Na2HPO4/litre | Ajuster le pH à 7,5 |
| 15,34 g NaH2PO4/litre | ||
| ddH2O | ||
| sRIMS | 70% de sorbitol | Ajuster le pH à 7,5 avec NaOH |
| 0,1 % entre 20 ans | ||
| 0,01 % NaN3 | ||
| Tampon phosphate 0,02 M | ||
Tableau 1. Composition des solutions.
| anticorps | CSI | hôte | dilution | catalogue # | fournisseur | ID de Registre Ab | cible |
| Opsine sensible au bleu | +3 | Chèvre polyclonale | 1:1000 | SC-14363 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_2158332 | Cône en S |
| Cône arrestin | +2 | Lapin polyclonal | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | cône |
| Protéine kinase C alpha (PKC-α) | +3 | Lapin polyclonal | 1:1000 | SC-208 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_2168668 | Cellule bipolaire à tige |
| Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) | +3 | Chèvre polyclonale | 1:500 | SC-6170 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_641021 | Astrocyte |
| Tyrosine hydroxylase (TH) | +3 | Mouton polyclonnal | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Cellule amacrine dopaminergique |
| Tyrosine hydroxylase (TH) | +2 | Lapin polyclonal | 1:500 | OPA1-04050 | ThermoFisher | AB_325653 | Cellule amacrine dopaminergique |
| Choline acétyltransférase (ChAT) | +1 | Chèvre polyclonale | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Cellule amacrine starburst |
| Protéine de liaison à l’ARN avec épissage multiple (RBPMS) | +1 | Cobaye polyclonal | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Cellule ganglionnaire rétinienne |
| GluA2 | +3 | Lapin polyclonal | 1:500 | AB1768-I | EMD Millipore | AB_2247874 | Récepteur AMPA Ca2+-imperméable |
| GluA2 | +2 | Souris monoclonale | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Récepteur AMPA Ca2+-imperméable |
| Protéine de densité postsynaptique 95 (PSD-95) | +3 | Souris monoclonale | 1:1000 | 75-028 | NeuroMab | AB_2877189 | Sites synaptiques |
| Phospho-S6 (pS6) | 0 | Lapin polyclonal | 1:500 | 44-923G | ThermoFisher | AB_2533798 | Marqueur d’activité cellulaire |
Tableau 2. Résumé des anticorps primaires testés. Légende du CSI : +3 = coloration cohérente et très spécifique; +2 = coloration toujours bonne, fond minimal; +1 = bonne coloration, un peu de fond; 0 = incompatible avec CLARITY.
| hôte | Espèces cibles | conjuguer | dilution | fournisseur |
| âne | Anti-moutons | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogène |
| âne | Anti-moutons | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogène |
| âne | Anti-lapin | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogène |
| âne | Anti-lapin | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogène |
| chèvre | Anti-lapin | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogène |
| âne | Anti-souris | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogène |
| âne | Anti-souris | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogène |
| âne | Anti-chèvre | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogène |
| âne | Anti-chèvre | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogène |
| chèvre | Anti-cobaye | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogène |
Tableau 3. Résumé des anticorps secondaires testés.
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Discussion
Modification du protocole CLARITY pour les rétines à monture entière.
Nous avons simplifié le protocole CLARITY pour obtenir une polymérisation adéquate sans avoir besoin d’une chambre d’évacuation sous vide ou de dessiccation, comme cela est utilisé dans la plupart des études précédentes7,9,11. Le processus de polymérisation est inhibé par l’oxygène, ce qui nécessite que l’échantillon soit isolé de l’air pendant l’étape de polymérisation du protocole. Cependant, plutôt que de dégazer avec de l’azote, nous avons constaté que le fait de recouvrir l’échantillon d’huile 22 a suffisamment isolé l’échantillon pour permettre la polymérisation sans nuire au reste du protocole après un rinçage complet, comme précédemment documenté12. Nous avons encore simplifié le protocole avec une méthode de compensation passive pour limiter le risque de brunissement des tissus et d’endommagement de la structure tissulaire associé à la compensation électrophorétique11. La clairance passive est accélérée par une agitation douce et une température élevée, permettant un nettoyage complet des tissus en seulement deux jours. Pendant cette période, une délipidation suffisante est réalisée pour entraîner un tissu optiquement transparent tout en minimisant la perte de protéines et d’autres biomolécules faisant partie intégrante de la structure cellulaire et de la coloration immunohistochimique.
CLARITY préserve les protéines des neurones rétiniennes et des cellules gliales dans des préparations à montage entier.
Nos résultats montrent que presque tous les anticorps testés fonctionnent dans les rétines traitées par CLARITY. Ces anticorps marquent les photorécepteurs, les cellules bipolaires, les cellules amacrines, les RGCs et les cellules gliales. Bien que nous n’ayons pas pu tester les anticorps pour les sous-types de chaque classe de neurones rétiniens, nos résultats impliquent que les rétines traitées par CLARITY peuvent être utilisées pour la majorité des marqueurs cellulaires de la rétine. Bien que la plupart des anticorps que nous avons testés puissent également immunostain neurones rétiniens dans les rétines traitées non-CLARITY, nous avons constaté que CLARITY permettait une pénétration adéquate des anticorps dans les tissus profonds de la rétine, fournissant une bonne spécificité de la coloration dans la couche intermédiaire de la rétine. De plus, nous avons constaté que CLARITY améliorait la pénétration de la lumière sur toute l’épaisseur de la rétine, réduisant la diffusion de la lumière et permettant une imagerie haute résolution à travers même les couches les plus profondes. Ces facteurs contribuent à une amélioration de la coloration et de l’imagerie dans les rétines à montage entier traitées par CLARITY par rapport à l’IHC13à montage entier non standard CLARITY. Le fond réduit et l’amélioration de l’imagerie 3D et des rendus de volume permettent une étude complète des structures cellulaires à travers toutes les couches de l’épaisseur de la rétine.
CLARITY révèle des processus fins et la structure synaptique des DAC dans les rétines à montage entier.
Nos résultats démontrent que les structures en forme d’anneau et les processus centrifuges des DAC sont révélés dans clarity-processed mieux que dans les rétines entières non-CLARITY. En particulier, l’immunomarquage avec le tissu CLARITY-traité permet la bonne résolution de ces structures fines même avec la microscopie de fluorescence standard sans besoin de formation image confocale. Compte tenu de l’importance des DAC dans la fonction visuelle, la préparation CLARITY peut être utilisée pour étudier les structures des DAC dans les rétines normales et les changements morphologiques dans des conditions malades.
Sur immunostaining pour PSD-95 et GluA2 avec le tissu entier standard, nous avons observé peu ou pas d’étiquetage de ces structures subcellulaires dans les couches profondes de la rétine, indiquant la pénétration pauvre d’anticorps. L’application du protocole CLARITY permet une coloration distincte de ces protéines dans les couches rétiniennes internes, indiquant une meilleure pénétration des anticorps dans les tissus profonds. Nos résultats montrent que CLARITY permet la détection de protéines synaptiques sur les processus DAC dans les rétines à montage entier, ce qui est normalement observé dans les préparations de tranches verticales6. Étant donné que les processus de type axone ne peuvent pas être distingués des dendrites dans les tranches verticales, les rétines à montage entier CLARITY offrent l’occasion de déterminer si les entrées synaptiques dans les DAC provenant d’autres neurones tels que les cellules bipolaires et les ipRGCs se produisent dans les dendrites, les processus de type axone, ou les deux5,6. Étant donné que les récepteurs AMPA et les protéines PSD-95 sont largement distribués dans l’ensemble de l’IPL, l’expression de ces protéines sur les DAC constitue un excellent exemple pour les rétines CLARITY à utiliser pour l’identification des protéines synaptiques dans d’autres neurones rétiniennes.
Considérations, limitations et applications futures du protocole CLARITY pour les rétines à montage entier.
Tout d’abord, les protocoles de polymérisation et de nettoyage pour les rétines à montage entier traitées par CLARITY ajoutent plusieurs jours au processus de préparation des tissus. Cependant, la méthode est toujours très pratique par le fait que les rétines clarifiées peuvent être stockées dans du PBS contenant de l’azide de sodium jusqu’à deux semaines avec une dégradation tissulaire minimale. Deuxièmement, une certaine expansion du tissu a été observée tout au long du processus de nettoyage, comme documenté dans les applications précédentes de CLARITY7,11. Cependant, nous avons constaté que la rétine est revenue à la taille approximativement originale sur l’équilibre avec la solution d’appariement d’index réfractif. Les changements mineurs potentiels dans le volume tissulaire peuvent ne pas provoquer de distorsion significative de la structure cellulaire ou subcellulaire7,11. Troisièmement, lors de l’imagerie d’échantillons de cerveau plus épais, l’objectif du microscope est souvent immergé directement dans le support de montage pour permettre une correspondance complète de l’indice de réfraction à partir de la lentille du microscope à travers le tissu12. Avec des échantillons plus minces tels que la rétine, nous avons utilisé des lamelle de couverture pour le montage afin de rendre les échantillons plus plats et plus uniformes pour l’imagerie. Les effets de la réfraction à travers la lamelle semblent être minimes sur l’imagerie. Quatrièmement, certaines de nos images montrent une coloration non spécifique des vaisseaux sanguins parce que nous n’avons pas permé l’animal entier avec une perfusion intracardiaque (suggérée pour être utilisée pour éviter une coloration non spécifique) avant d’énucléer les yeux. Enfin, le protocole actuel adapté aux souris peut être utilisé pour les rétines d’autres espèces. En particulier, les rétines de grands animaux tels que les chiens, les porcs, les chevaux et les primates sont beaucoup plus épaisses que celles des souris. Ce protocole CLARITY pourrait rendre les rétines de ces animaux plus transparentes optiquement après l’élimination des lipides et préserver les structures fines des neurones rétiniennes et leurs protéines pour l’immunomarquage.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Bing Ye, Nathan Spix et Hao Liu pour leur soutien technique. Ces travaux ont été appuyés par le National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) et le Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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