Summary
여기서 우리는 표준 면역 조직 화학 염색 및 망막 뉴런및 그 하위 세포 구조의 고해상도 화상 진찰의 질을 향상시키기 위하여 전산 망막에 대한 뇌 조직의 CLARITY 방법을 적응하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
원래 Deisseroth 실험실에서 개발한 조직 하이드로겔 탈지법(CLARITY)은 두꺼운 뇌 샘플의 면역 염색 및 이미징에 널리 사용되었습니다. 그러나 이 첨단 기술은 아직 전체 마운트 망막에 사용되지 않았습니다. 망막은 부분적으로 투명하지만, 약 200 μm (마우스)의 두께는 여전히 고해상도 이미징을위한 광 침투를 감소시킬뿐만 아니라 깊은 조직으로 항체의 침투를 제한합니다. 여기서, 우리는 아크릴아미드 단조로 중합하여 나노다공성 하이드로겔을 형성한 다음 단백질 손실을 최소화하고 조직 손상을 피하기 위해 나트륨 도데실 황산염으로 이를 제거함으로써 마우스 망막 전체를 위한 CLARITY 방법을 적용했습니다. CLARITY 처리망막은 망막 뉴런, 글리아 세포 및 시냅스 단백질을 위한 항체로 면역염색되었고, 굴절지수 매칭 용액에 장착되고, 이미지화되었다. 우리의 데이터는 CLARITY가 전체 마운트 준비에서 망막 뉴런 및 신경교 세포를 위한 표준 면역 조직화학 염색 및 화상 진찰의 질을 향상할 수 있다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 도파민성 막막 세포의 미세 축삭 과 수지상 구조의 3D 해상도는 CLARITY에 의해 훨씬 개선되었습니다. 비가공 된 전체 마운트 망막에 비해, CLARITY는 포스트 냅스 밀도 단백질 95와 같은 시냅스 단백질에 대한 면역 스테인링을 나타낼 수 있습니다. 우리의 결과는 CLARITY가 지질제거 후에 망막을 보다 광학적으로 투명하게 만들고 망막 뉴런과 단백질의 미세한 구조를 보존한다는 것을 보여주며, 이는 망막 뉴런과 그 전산 준비에서 그들의 세포 세포 구조의 고해상도 이미징을 얻는 데 일상적으로 사용될 수 있습니다.
Introduction
척추지통은 아마도 중추 신경계 (CNS)의 가장 접근 할 수있는 부분이며 뇌의 발달, 구조 및 기능을 연구하기위한 훌륭한 모델역할을합니다. 망막에 있는 뉴런의 5개 종류는 2개의 플렉시폼 층에 의해 분리된 3개의 핵 층으로 분포됩니다. 외부 핵층(ONL)은 빛을 전기 신호로 변환하는 고전적인 광수용체(막대 및 원수)로 구성됩니다. 전기 신호는 양극성, 수평 및 막골 세포를 포함하는 내부 핵 층(INL)의 뉴런에 의해 처리된 다음 신경절 세포 층(GCL)에서 망막 신경절 세포(RGC)로 전염된다. RGC는 망막의 출력 뉴런이며, 축축은 이미지 형성 및 비 이미지 형성 시각 기능에 기여하기 위해 뇌에 투사됩니다. 또한, 신경 교 세포의 세 가지 유형 (뮬러 세포, 천체, 마이크로 글리 아) 뉴런에 영양분을 제공 하 고 그들의 세포 외 환경에서 유해한 변화에서 뉴런을 보호.
amacrine 세포의 1개의 특수한 하위 인구는 CNS에 있는 중요한 신경 변조기인 도파민을 생성하고 풀어 놓으며, 빛 적응 도중 망막 신경 회로를재구성1,2. 도파민성 막막 세포(DAC)는 형태학적 프로파일의 독특한 특징을 가지고 있습니다. 그들의 소마타는 내부 플렉시폼 층(IPL)의 가장 단산적인 부분에서 담수체가 마비된 근접 INL에 위치하고 있습니다. DAC의 축슨 과 같은 프로세스는 미근한, 얇고 긴, 희소하게 분기, 곰 정맥류 (도파민 방출의 사이트). 그(것)들은 AII amacrine 세포의 소마타 의 주위에 고리 같이 구조물을 포함하여 IPL에 있는 점선으로 조밀한 신경총을 형성합니다. 축축은 또한 InL을 통해 OPL을 향해 달려가 망막3을가로질러 원심 통로를 형성합니다. 우리는 DAC 프로세스가 양극성 세포 및 본질적으로 감광성 망막 신경절 세포 (ipRGCs)4,5,6을포함하여 사전 시냅스 뉴런에서 글루타민산 방출에 대한 응답으로 수용체를 발현한다는 것을입증했습니다. 그러나, 글루타민체 수용체가 축축산, 원원수 또는 둘 다에 발현되는지 여부는 수직 망막 섹션에서 차단되어 서로 구별될 수 없기 때문에5,6. 면역 염색은 DC의 3차원 분지 및 세포전 구획에 글루타민산 수용체의 존재를 밝히기 위해 전체 마운트 망막에서 수행되어야 합니다. 망막은 상대적으로 투명하지만 마우스 전체 마운트 망막의 두께는 약 200 μm이며, 이는 심부 조직으로 항체의 침투를 제한할 뿐만 아니라 조직 광 산란으로 인한 고해상도 이미징의 광 침투를 감소시킵니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 면역 염색 호환 조직 하이드로겔 탈면 방법 (CLARITY)를 조정하여 최근 두꺼운 뇌 섹션을 위해 전체 마운트 마우스 망막7에적응시켰다.
CLARITY 방법은 원래 두꺼운 뇌 샘플7의면역 염색 및 이미징을 위한 Deisseroth 실험실에 의해 개발되었다. 강력한 세제, 도데딜 황산나트륨(SDS) 및 전기포고를 사용하여 지질 성분(조직 광산란을 유발함)을 제거하여 단백질과 핵산을 제자리에 두고 있습니다. 제거된 지질은 아크릴아미드와 같은 하이드로겔 단량체로 구성된 투명한 스캐폴드로 대체되어 남은 단백질 구조를 지원합니다. 지워진 조직은 면역 조직 화학을 통해 표지될 수 있고 조직을 통해 실질적으로 증가한 광 침투 깊이로 심화될 수 있습니다 (조직 표면 아래 최대 몇 밀리미터). 그 이후, CLARITY 방법은 여러 연구 그룹에 의해 최적화되고 단순화되어8,9,10. 수정된 CLARITY 프로토콜은 수동 클리어링 기술을 사용하여 전뇌 및 기타 온전한장기(11)를지우기 위해 전기전도에 의해 생성된 조직 손상을 방지한다. 그러나 이 방법은 아직 전체 탈산 망막에 적용되지 않았습니다. 여기서, 우리는 면역 히스토케및 이미징을 위해 더 투명하게 하기 위해 전산 망막에 대한 수동 적인 CLARITY 기술을 조정했습니다. 우리는 시험된 망막 단백질의 대다수가 면역 조직화학을 위한 이 프로세스 도중 보존되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 굴절지수 매칭 솔루션을 사용하여 ONL에서 GCL까지 약 200μm 두께의 망막 뉴런을 전신망막에서 이미지화할 수 있었습니다.
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Protocol
마우스 관리 및 모든 실험 절차는 실험실 동물에 대한 건강의 국가 학회 지침에 따라 실시하고 오클랜드 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다 (프로토콜 번호 18071).
참고: 솔루션 이름과 해당 컴포지션의 이름이 표 1에나열됩니다.
1. 조직 준비
- CO2의과다 복용으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.
- 구부러진 집게로 눈을 이결시키고 0.1 M PBS(표 1)와함께 작은 페트리 접시로 옮기습니다. 해부 현미경의 밑에, 바늘로 각막-clera 접합을 따라 작은 구멍을 찌르는. 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 전송합니다.
- 눈을 PBS로 접시에 다시 옮기. 해부 현미경에서, 각막 -clera 접합주위의 모든 방법을 잘라 해부 가위를 사용합니다. 각막과 렌즈를 제거합니다. 시신경의 기지에서 잘라 조심스럽게 망막을 분리하는 집게로 clera를 벗겨.
- 망막 주위에 네 개의 작은 컷을 고르게 만들고 PBS에 담근 미세 한 팁 브러시를 사용하여 망막을 안정화시키기 위해 니트로 셀룰로오스 필터 용지에서 작은 사각형 컷에 클로버 모양 (GCL 측면 다운)을 평평하게 놓습니다.
- (장착 된 망막을 만지지 않고) 니트로 셀룰로오스 종이의 모서리를 잡고 1 시간 동안 4 % PFA와 48 웰 플레이트에 배치하려면 집게를 사용하여 망막을 전송합니다.
- 필터 용지와 망막을 PBS와 잘 옮기고 씻습니다 (각각 5 분 당 3 배).
- A4P0(표 1)으로옮기고 부드러운 동요와 함께 4 °C에서 하룻밤 을 배양하십시오.
- 파이펫 식물성 오일은 A4P0 용액을 완전히 덮습니다. 흔들림 없이 3시간 동안 40°C의 수조에서 배양합니다.
- PBS에서 세척(각 3배 5분)을 세척하여 모든 오일이 헹구었는지 확인합니다. 필요한 경우 파이프를 사용하여 마지막 헹구기 전에 우물 상단에서 남은 오일을 조심스럽게 제거합니다.
- 부드러운 흔들림으로 2 일 동안 40 °C에서 10 % SDS로 배양하십시오. 두 번째 날에는 SDS를 신선한 솔루션으로 교체합니다.
- 트리톤-X-100(PBST, 표 1)을사용하여 필터 용지와 망막을 PBS로 옮기고 세척(각각 1.5시간 동안 5배).
- PBST에 4°C에 0.01% 나트륨 아지드(NaN3)로저장하거나 면역염색으로 직접 이동하십시오.
2. 면역 염색 및 굴절률 일치
- PBST의 미세 한 팁 브러시로 부드럽게 벗겨서 필터 용지에서 망막을 제거하십시오.
- 1차항체(표 2)에서망막을 배양하여 블로킹 용액(표1)에서2일간 40°C에서 부드러운 흔들림으로 배양한다.
- PBST에서 세척(각각 5배, 1.5h).
- 적절한 이차항체(표 3)로배양하여 40°C에서 2일간 블로킹 용액에 희석되어 부드러운 흔들림을 하고 나머지 시술을 통해 빛으로부터 보호한다.
- 0.02 M 인산염 버퍼(표 1참조)에서 세척(5배, 각 1.5h).
- 소르비톨 기반 굴절 인덱스 매칭 솔루션(sRIMS, 표 1참조)에서 하룻밤 사이에 40°C에서 부드러운 흔들림으로 배양합니다.
3. 장착
- 유리 현미경 슬라이드 뒷면의 정사각형 경계를 표시하는 미세 팁 영구 마커가있는 18mm x 18mm x 1.5mm 유리 커버 슬립을 간략하게 설명합니다.
- 슬라이드를 뒤집어 주사기를 사용하여 슬라이드 앞쪽에 얇은 실리콘 그리스 라인으로 경계를 추적하여 과도한 장착 용액을 피하기 위해 한 모서리에 작은 간격을 남깁니다.
- 망막을 경계 영역의 중앙으로 옮기고 미세 한 브러시로 배열하여 유리 슬라이드에 대한 광수용체 측면이 평평하도록 하십시오.
- 파이펫약 60 μL의 sRIMS는 평평한 망막을 덮고 망막이 평평하고 제자리에 머무르는 것을 주의하여 인클로저의 한 구석으로 확장합니다.
- 스림으로 모퉁이에서 시작하여 커버슬립을 바르고 기포가 형성되지 않도록 사방의 그리스에 닿을 때까지 천천히 낮춥힙슬립을 적용합니다.
- 장착된 망막의 양쪽에 3개의 커버립을 스페이서로 놓습니다. 다른 슬라이드의 긴 가장자리를 사용하여 마운트가 평평하고 균일하도록 커버 슬립을 누릅니다.
- 이미징까지 4°C에서 평평하게 슬라이드를 저장합니다.
4. 이미징
- 기존의 형광 현미경 또는 공초점현미경(재료의 표)에 대한이미지 샘플. 현미경 단계에 슬라이드를 배치하고 샘플을 찾는 것으로 시작합니다.
참고: 반전된 목표 현미경이 사용되는 경우 슬라이드를 무대에 거꾸로 놓고 먼저 슬라이드의 노출된 영역이 모든 실리콘 그리스 및 장착 용액이 지워지도록 합니다. - 공동 표지된 샘플의 z-stacked 이미지를 얻으려면 먼저 각 채널의 신호에 개별적으로 초점을 맞추고 노출 시간 또는 스캔 속도를 각각 설정합니다.
- 원하는 범위의 위쪽과 하단에 초점 평면을 수동으로 설정하거나 중간점을 설정한 다음 중간점 주변의 범위를 지정하여 z 스택의 범위를 설정합니다.
- 원하는 대로 단계 크기 또는 슬라이스 수를 조정합니다.
- 이미지를 캡처하고 원래 파일을 저장하고 TIFF 파일 또는 기타 원하는 형식으로 내보냅니다.
5. 이미지 분석
- 선택한 이미지 분석 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 단일 이미지와 z스택의3차원 렌더링 모두에서 최적의 선명도가 달성될 때까지 각 채널의 밝기와 콘트라스트를 조정합니다.
참고: 선택한 단계 크기가 충분히 작으면 신호를 향상시키기 위해 3D 데온볼루션도 수행할 수 있습니다.
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Representative Results
수정 된 CLARITY 처리 망막은 광학적으로 투명한 조직입니다.
적절한 탈착을 제공하고 세포 단백질의 구조적 무결성을 유지하면서 망막내의 면역 조직 화학 적 응용 프로그램과 호환되는 조직 청산 방법을 공식화하기 위해, 우리는 전산 마우스 망막에 CLARITY 조직 클리어링 방법을 적용했습니다. 프로토콜을 단순화하고 전체 마운트 망막용으로 수정할 수 있었습니다(프로토콜 참조). 조직 혼성화, 청산 및 굴절률 매칭을 완료한 후, 이러한 수정된 CLARITY 프로토콜로 처리된 망막은 비처리 된 제어 망막(도1B)에비해 망막의 두께 전반에 걸쳐 거의 완전한 광학 투명성을 보였다. 이 결과는 CLARITY 프로토콜의 이 수정이 충분히 지워진 전체 마운트 망막 조직을 제공한다는 것을 나타냅니다.
수정 된 CLARITY 처리 망막에서 뉴런의 개선 된 3D 이미징.
이러한 수정된 CLARITY 방법에 의해 제공되는 면역히스토케미칼 염색의 품질과 실용성을 평가하기 위해, 우리는 다양한 1차항체(표 2)를사용하여 CLARITY 처리망막을 염색하였다. 이러한 항체는 망막에 있는 각 주요 세포 모형을 표시합니다: 원뿔 광수용체, 막대 양극성 세포, amacrine 세포, RGCs 및 신경교 세포, 뿐만 아니라 세포 세포 외 시냅스 단백질에 대하여 항체. 세포 활성 마커 인-S6(pS6)을 제외하고, 모든 항체는 CLARITY와 호환되는 것으로 입증되었습니다. 일반적인 예는 도 2에도시되어 있습니다. 우리는 원뿔 체포, 티로신 하이드록실라제 (TH), 및 다중 접합 (RBPMS)을 가진 RNA 결합 단백질에 대하여 항체로 삼중 라벨을 수행했습니다. ONL에서 GCL에 이르는 공초점 현미경 이미지를스택하는일련의 z를 취했습니다. 개별 이미지는 ONL(그림2A),INL(도 2B)의 TH 라벨D와 GCL(도2C)의RBPMS 표시 RG에서 알테인 표시 콘을 나타냈다. 오버레이 이미지는 망막의 전체 두께에 걸쳐 이러한 뉴런의 상대적 위치를드러냈다(도 2D). 이러한 결과는 CLARITY가 많은 표준 면역히스토케미칼 염색의 품질을 개선하고 전체 마운트 제제에서 망막의 전체 두께에 걸쳐 뉴런의 3D 구조를 명확하게 드러낼 수 있음을 시사한다.
수정된 CLARITY는 망막 뉴런과 시냅스 단백질의 미세 한 공정의 향상된 3D 분해능을 제공합니다.
우리는 또한 CLARITY 처리 된 전체 마운트 망막(그림 3A,B)에서TH 염색을 분석하고 표준 전체 마운트 준비(그림 3C,D)에서얻은 이미징과 비교했습니다. 공초점 이미지는 DAC의 원원수 및 축삭 과 같은 프로세스가 표준 망막(도3C)보다CLARITY 처리망막(도3A)에서훨씬 더 명확하게 밝혀졌다는 것을 보여줍니다. 특히, 축삭과 같은 DAC 공정은 표준 망막보다 CLARITY 망막(도 3A에삽입 참조)에서 보다 더 완전한 링과 같은 구조를 나타냈다(도 3C에삽입 참조). 특히, 형광현미경(도 3B)을사용하여 취한 CLARITY 망막의 고리 같은 구조는 공초점(도3A)을사용하여 관찰된 것과 거의 동일하였다. 또한 축축과 같은 공정도 X-Z 지향이미지(도 4A)에서관찰된 외부 망막을 향해 달렸다. 이러한 데이터는 CLARITY가 기존의 형광 현미경 검사를 사용하여도 전체 마운트 망막에서 축삭과 유사한 DACs 프로세스를 식별하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다.
AMPA 수용체 하위 단위 GluA2 및 포스트 냅스 밀도 단백질 95 (PSD-95)가 표준 전체 마운트 망막에서 검사되었을 때, 이들 중 어느 것도 검출되지 않았으며, 이러한 시냅스 단백질에 대한 항체의 침투가 심층망막으로 침투할 가능성이 높습니다. CLARITY 처리망막이 이러한 항체가 면역스테인 시냅스 단백질을 허용할지 여부를 결정하기 위해, 우리는 서브유닛 GluA2 및 PSD-95로 TH를 세 배로 표지했습니다. GluA2 및 PSD-95에 대한 면역 염색은 각각 개별 GluA2 함유 AMPA수용체(도 4B)및 푸티드 포스트 냅틱사이트(도 4C)를드러내는 뚜렷한 말장난을 보였다. 오버레이 이미지는 DAC프로세스(그림 4D)에서명백한 몇 가지 말장난을 보여 주었다. 세 가지 얼룩이 모두 있는 퍼티코코리티화를 이미지화하여 3D뷰(그림 5)로제시했습니다. 세 가지 보기 모두에서 TH는 GluA2 및 PSD-95(그림5 A-C)와명확하게 공존했습니다. 이러한 3D 원근도 결과 전체 마운트 망막에서 유래수직 망막 조각5,6DAC프로세스에 GluA2 함유 AMPA 수용체의 시냅스 발현의 우리의 이전 보고서를 검증한다.
그림 1. CLARITY는 광학적으로 투명한 조직을 제공합니다. 전체 마운트 마우스 망막은 변형 된 CLARITY 방법 (프로토콜 참조)과 전체 망막이 0.67cm 평방 그리드에 오버레이하여 스케일을 표시하여 해부 현미경으로 이미지화하여 처리되었습니다. A: 투명하게 처리된 전체 마운트 망막, 투명 조직을 통해 그리드 라인이 선명하게 보입니다. 화살표는 망막의 배치를 묘사합니다. B: 비 선명도 처리 제어 망막, 1 시간 동안 PFA에 고정 및 PBS에서 배양. 그리드 라인은 조직의 상대적 불투명도에 의해 가려져 있습니다. 규모 표시줄: 약 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. CLARITY 처리망막에서 망막의 두께를 가로 질러 뉴런의 개선 된 3D 이미징. 전산 CLARITY 망막은 콘 체포, TH 및 RBPMS에 대한 항체로 면역 염색되었다. 이미지는 X-Z 방향으로 보이는 z 누적 된 공초점 이미지의 3D 볼륨 렌더링을 나타냅니다. A: 콘 광수용체 (화살표) 콘 체포 (파란색)에 의해 표시. 배경 얼룩으로 인해 내부 망막 (화살촉)에서 약간의 반점이 보입니다. B: TH(빨간색)로 표시된 DAC 소마 및 수상자(화살표). 화살장은 내부 망막에 있는 망막 혈관을 나타내며, 다중 라벨 면역 염색으로 인해 보입니다. C: RBPMS(녹색)로 표시된 RGC 소마타(화살표). 화살장은 혈관의 자동 불발과 비특이적 염색으로 인해 눈에 보이는 망막 혈관을 나타냅니다. D: 삼중 표지 염색의 병합된 이미지는 망막의 두께를 가로질러 이들 뉴런의 상대적 배치를 드러내며, 외부 핵층에 위치한 원뿔 광수용체, 내부 핵층의 DAC 및 신경절 세포 층의 RGC를 드러낸다. 볼륨 뷰의 배율은 20 μm단위로 표시됩니다.
그림 3. CLARITY는 DAC 형태학의 미세한 구조를 보여줍니다. TH 면역염색은 CLARITY처리(A 및 B)및 표준(C 및 D)망막에서 수행되었다. Z-스택 된 이미지는 공초점(A 및 C)및 형광 현미경 검사법(B 및 D)을사용하여 촬영하였다. 각 이미지의 단일 광학 평면의 인서트가 축삭과 같은 공정으로 형성된 링 과 같은 구조를 강조합니다. 애로우헤드는 DAC 소마타를 나타내며, 많은 고리 모양의 구조물이 선명도 처리망막(A 및 B)에서드러난 선점과 축삭 같은 공정의 조밀한 신경총에서 볼 수 있습니다(예는 화살표로 표시됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 수정된 CLARITY는 미세 수지상 구조와 시냅스 단백질의 향상된 3D 분해능을 제공합니다. 트리플 면역스테인링은 TH, GluA2 및 PSD-95에 대한 항체를 가진 CLARITY 처리된 전체 마운트 망막에서 수행되었다. 볼륨 렌더링은 z 스택 된 공초점 이미징에서 재구성되었으며 각진 X-Z 방향으로 제시되었습니다. A: TH 라벨DAC 소마타(arrowheads)는 내부 핵층및 공정(노란색 화살표)에서 황실 내부 플렉시폼 층(빨간색)으로 계층화된다. 백색 화살표는 외부 망막을 향해 연장하는 원심 프로세스를 표시합니다. B: 내부 플렉시폼 층(green)을 가로지르는 GluA2 함유 AMPA 수용체의 조밀한 천공 발현. 화살은 망막 혈관에서 자가 발광을 나타냅니다. C: Puncta 내부 플렉시폼 층(파란색)에서 PSD-95로 레이블이 부착된 시냅스 후 사이트를 공개합니다. 화살표는 PSD-95에 대하여 마우스 단클론 항체의 사용때문에 명백한 혈관을 표시합니다. D: GLUA2 및 PSD-95의 발현과 함께 TH 레이블이 부착된 DAC 프로세스의 중복을 보여주는 오버레이 이미지입니다. 볼륨 뷰의 배율은 20 μm단위로 표시됩니다.
그림 5. DACs에 GluA2 함유 AMPA 수용체의 시냅스 발현. 도 4에 나타난 TH, GluA2 및 PSD-95의 세 배의 공동 지역화 지점을 선택및 조사하여 3D로 조사되었다. A1은 X-Z 방향(A5)에서 DAC 프로세스(빨간색)의 세그먼트를 나타냅니다. A2와 A3은 각각 동일한 방향으로 하나의 GluA2 펑크(녹색)와 PSD-95 펑크(파란색)를 표시합니다. 병합된 이미지(A4)는 TH, GluA2 및 PSD-95(화살표)의 3중 지역화를 보여 줍니다. B1-B4는 Y-Z 방향(B5)에서 동일한 지역화(화살표)를 표시합니다. C1-C4는 X-Y 평면(C5)에서 동일한 점(화살표)의 공동 지역화를 표시합니다. 트리플 코만전은 각 방향에서 분명하게 드러나고 있습니다. 스케일 바: 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 구성 | 노트 |
| 0.1 M PBS | 137 mM NaCl | pH를 7.4로 조정 |
| 26.8 mM KCl | ||
| 10.1 mM Na2HPO4 | ||
| 17.6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 아크릴아미드 4% | 얼음, 알리쿼트, 저장 -20 ºC |
| 0.25% VA-044 | ||
| 0.1 M PBS | ||
| PBST | 0.1% (v/v) 트리톤-X-100 | |
| 0.1 M PBS | ||
| 블로킹 솔루션 | 2% NDS 또는 1% BSA | |
| 0.01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| 0.1 M 인산염 버퍼 | 11.93 g Na2HPO4/리터 | pH를 7.5로 조정 |
| 15.34 g NaH2PO4/리터 | ||
| ddH2O | ||
| 스림 | 70% 소르비톨 | NaOH로 pH를 7.5로 조정 |
| 0.1% 트위엔-20 | ||
| 0.01% NaN3 | ||
| 0.02 M 인산염 버퍼 | ||
표 1. 솔루션의 구성.
| 항체 | IHC | 호스트 | 희석 | 카탈로그 # | 공급 업체 | Ab 레지스트리 ID | 과녁 |
| 청색 에민감한 오신 | +3 | 염소 폴리클로날 | 1:1000 | SC-14363 | 산타 크루즈 생명 공학 | AB_2158332 | S콘 |
| 콘 체포 | +2 | 토끼 폴리클로날 | 1:1000 | AB15282 | EMD 밀리포어 | AB_1163387 | 원뿔 |
| 단백질 키나아제 C 알파 (PKC-α) | +3 | 토끼 폴리클로날 | 1:1000 | SC-208 | 산타 크루즈 생명 공학 | AB_2168668 | 로드 양극성 셀 |
| 글리아 세동 산 성 단백질 (GFAP) | +3 | 염소 폴리클로날 | 1:500 | SC-6170 | 산타 크루즈 생명 공학 | AB_641021 | 성상세포 |
| 티로신 하이드록실라제 (TH) | +3 | 양 폴리클로날 | 1:500 | AB1542 | EMD 밀리포어 | AB_90755 | 도파민성 막시린 세포 |
| 티로신 하이드록실라제 (TH) | +2 | 토끼 폴리클로날 | 1:500 | OPA1-04050 | 써모피셔 | AB_325653 | 도파민성 막시린 세포 |
| 콜린 아세틸 트랜스퍼라제 (ChAT) | +1 | 염소 폴리클로날 | 1:500 | AB144P | EMD 밀리포어 | AB_2079751 | 스타버스트 아막린 셀 |
| 다발성 접합을 가진 RNA 결합 단백질 (RBPMS) | +1 | 기니피그 폴리클로날 | 1:2000 | ABN1376 | EMD 밀리포어 | AB_2687403 | 망막 신경절 세포 |
| 글루A2 | +3 | 토끼 폴리클로날 | 1:500 | AB1768-I | EMD 밀리포어 | AB_2247874 | Ca2+불투과성 AMPA 수용체 |
| 글루A2 | +2 | 마우스 모노클로날 | 1:250 | MABN1189 | EMD 밀리포어 | AB_2737079 | Ca2+불투과성 AMPA 수용체 |
| 포스트냅스 밀도 단백질 95 (PSD-95) | +3 | 마우스 모노클로날 | 1:1000 | 75-028 | 신경마비 | AB_2877189 | 시냅틱 사이트 |
| 인S6 (pS6) | 0 | 토끼 폴리클로날 | 1:500 | 44-923G | 써모피셔 | AB_2533798 | 세포 활동 마커 |
표 2. 1 차적인 항체의 요약은 시험했습니다. IHC 범례: +3 = 일관되고 매우 구체적인 염색; +2 = 일관되게 좋은 염색, 최소한의 배경; +1 = 좋은 염색, 일부 배경; 0 = 선명도와 호환되지 않습니다.
| 호스트 | 대상 종 | 활용하다 | 희석 | 공급 업체 |
| 당나귀 | 안티 양 | 알렉사 플루어 568 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 당나귀 | 안티 양 | 알렉사 플루어 594 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 당나귀 | 안티 래빗 | 알렉사 플루어 488 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 당나귀 | 안티 래빗 | 알렉사 플루어 594 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 염소 | 안티 래빗 | 알렉사 플루어 647 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 당나귀 | 마우스 방지 | 알렉사 플루어 488 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 당나귀 | 마우스 방지 | 알렉사 플루어 647 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 당나귀 | 염소 방지 | 알렉사 플루어 568 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 당나귀 | 염소 방지 | 알렉사 플루어 594 | 1:500 | 인비트로겐 |
| 염소 | 안티 기니 피그 | 알렉사 플루어 488 | 1:500 | 인비트로겐 |
표 3. 시험된 이차 항체의 요약.
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Discussion
전체 마운트 망막에 대한 CLARITY 프로토콜의 수정.
우리는 대부분의 이전 연구에서 사용되는 것처럼 진공 배출 또는 건조 챔버없이 적절한 중합을 달성하기 위해 CLARITY 프로토콜을단순화7,9,11. 중합 공정은 산소에 의해 억제되며, 프로토콜의 중합 단계 동안 시료를 공기로부터 분리하도록 요구한다. 그러나, 질소로 탈가스를 방출하는 대신, 이전에 문서화된12와같이 철저한 헹구기 후 프로토콜의 나머지 부분에 악영향을 미치지 않으면서 중합화를 허용하기 위해 샘플을 충분히 분리한 오일로 샘플을 덮는 것을 발견하였다. 우리는 또한 조직 브라우닝의 위험과 전기 경화와 관련된 조직 구조의 손상을 제한하는 수동 청산 방법으로 프로토콜을단순화(11). 수동 클리어링은 부드러운 동요와 높은 온도에 의해 가속되어 단 2 일 만에 완전한 조직 정리를 허용합니다. 이 기간 동안, 충분한 탈착은 세포 구조 및 면역 조직 화학 얼룩에 필수적인 단백질 및 기타 생체 분자의 손실을 최소화하면서 광학적으로 투명한 조직을 초래하기 위하여 달성됩니다.
CLARITY는 망막 뉴런과 신경교 세포의 단백질을 전산 제제에서 보존합니다.
우리의 결과는 거의 모든 항체가 CLARITY 가공망막에서 작동을 시험했다는 것을 보여줍니다. 이 항체는 광수용체, 양극성 세포, 막시린 세포, RGCs 및 신경교 세포를 표시합니다. 우리는 망막 뉴런의 각 클래스의 하위 유형에 대한 항체를 테스트 할 수 없었지만, 우리의 결과는 CLARITY 처리 망막망막의 대다수에 사용될 수 있음을 암시한다. 우리가 시험한 대부분의 항체는 또한 비 CLARITY 처리망막에 있는 면역스테인 망막 뉴런을 할 수 있더라도, 우리는 CLARITY가 망막의 깊은 조직에 적당한 항체 침투를 허용한다는 것을 것을을 발견했습니다, 망막의 중간 층에 얼룩의 좋은 특이성을 제공하. 또한 CLARITY가 망막 두께 전반에 걸쳐 빛의 침투를 개선하여 광 산란을 줄이고 가장 깊은 층을 통해 고해상도 이미징을 허용하는 것을 발견했습니다. 이러한 요인은 비 선명도 표준 전체 마운트 IHC13에비해 CLARITY 처리 된 전체 마운트 망막에서 염색 및 이미징 모두에서 개선에 기여한다. 감소된 배경과 개선된 3D 이미징 및 볼륨 렌더링을 통해 망막 두께에 걸쳐 모든 층에서 세포 구조를 완벽하게 조사할 수 있습니다.
CLARITY는 전체 마운트 망막에서 DAC의 미세한 공정과 시냅스 구조를 보여줍니다.
우리의 결과는 DACs의 고리와 같은 구조물 및 원심 프로세스가 비 CLARITY 전체 마운트 망막에서 보다는 CLARITY 처리에 더 잘 드러난다는 것을 보여줍니다. 특히, CLARITY 처리 조직을 가진 면역 염색은 공초점 화상 진찰을 위한 필요 없이 표준 형광 현미경 검사법으로조차 이 정밀한 구조물의 좋은 해결을 허용합니다. 시각 기능에서 DAC의 중요성을 감안할 때, CLARITY 준비는 질병조건하에서 정상적인 망막 및 형태학적 변화에 있는 DACs의 구조물을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
표준 전체마운트 조직을 가진 PSD-95 및 GluA2를 위한 면역 염색시, 우리는 망막의 깊은 층에 있는 이 세포 체 구조의 거의 또는 전혀 표시를 관찰했습니다, 나쁜 항체 침투를 나타내는. CLARITY 프로토콜의 적용은 내부 망막 층에 있는 이 단백질의 명백한 염색을 허용합니다, 깊은 조직에 향상한 항체 침투를 나타내는. 우리의 결과는 CLARITY가 일반적으로 수직 슬라이스 준비6에서관찰되는 전체 마운트 망막에서 DAC 프로세스에 시냅스 단백질의 검출을 허용한다는 것을 보여줍니다. 축삭과 같은 공정은 수직 슬라이스의 원점과 구별될 수 없기 때문에 CLARITY 전체 마운트 망막은 양극성 세포 및 ipRGC와 같은 다른 뉴런으로부터 DAC에 대한 시냅스 입력이 점선, 축삭 과 같은 공정 또는5,6모두에서 발생하는지 여부를 결정할 수 있는 기회를 제공한다. AMPA 수용체와 PSD-95 단백질은 IPL 전체에 널리 분포되기 때문에, DACs에 이러한 단백질의 발현은 다른 망막 뉴런에서 시냅스 단백질의 식별에 사용되는 CLARITY 망막에 대한 훌륭한 예를 설정.
전체 마운트 망막에 대한 CLARITY 프로토콜의 고려 사항, 제한 및 향후 응용 프로그램.
첫째, CLARITY 처리된 전체 마운트 망막에 대한 중합 및 청산 프로토콜은 조직 준비 과정에 며칠을 추가합니다. 그러나, 이 방법은 여전히 정제된 망막이 최소한의 조직 분해로 최대 2주 동안 아지데 함유 PBS 나트륨에 저장될 수 있다는 사실에 의해 매우 실용적입니다. 둘째, 조직의 일부 확장은 CLARITY7,11의이전 응용 에 문서화 된 바와 같이 청산 과정을 통해 관찰되었다. 그러나, 우리는 망막이 굴절 지수 일치 솔루션과 평형시 대략 원래 크기로 돌아왔다는 것을 것을을 발견했습니다. 조직 부피의 잠재적 사소한 변화는 세포 또는 세포 전 세포 구조7,11의상당한 왜곡을 일으키지 않을 수 있다. 셋째, 두꺼운 뇌 샘플을 이미징할 때, 현미경 목적은 종종조직(12)을통해 현미경 렌즈로부터 완전한 굴절률을 일치시킬 수 있도록 마운팅 미디어에 직접 침지된다. 망막과 같은 얇은 샘플을 사용하여, 우리는 샘플을 아첨하고 이미징을 위해 더 균등하게 하기 위해 장착커버립을 사용했습니다. 커버슬립을 통한 굴절의 효과는 이미징에 미미한 것으로 보입니다. 넷째, 일부 이미지는 눈을 방출하기 전에 전체 동물을 심장 내 관류(비특이적 얼룩을 피하기 위해 사용제안)를 퍼프하지 않았기 때문에 비특이적 혈관 염색을 보여줍니다. 마지막으로, 마우스에 적응된 현재 프로토콜은 다른 종의 망막에 사용될 수 있다. 특히 개, 돼지, 말, 영장류 와 같은 큰 동물의 망막은 쥐보다 훨씬 두껍습니다. 이 CLARITY 프로토콜은 지질을 제거한 후 이러한 동물의 망막을 보다 광학적으로 투명하게 만들고 망막 뉴런의 미세한 구조와 면역 염색을 위한 단백질을 보존할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
빙예, 네이선 스픽스, 하오 류에게 기술지원을 부탁드립니다. 이 작품은 건강 보조금 EY022640 (D.-Q.Z.) 및 오클랜드 대학 프로보스트 학부 학생 연구 상 (E.J.A.)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
