Summary
ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。
Abstract
もともと、Deisseroth研究室で開発された組織ヒドロゲル脱脂法(CLARITY)は、厚い脳試料の免疫染色およびイメージングに改変され、広く使用されている。しかし、この高度な技術はまだ全マウントのレティナには使用されていません。レティナは部分的に透明ですが、その厚さは約200μm(マウス)であり、依然として抗体の深部組織への浸透を制限し、高解像度イメージングのための光の浸透を減少させる。ここでは、アクリルアミドモノマーで重合してナノ多孔質ヒドロゲルを形成し、タンパク質の損失を最小限に抑え、組織の損傷を避けるためにドデシル硫酸ナトリウムでクリアすることで、マウス全実装のレチナにCLARITY法を適合させました。CLARITY処理されたレチナを、レチナルニューロン、グリア細胞、シナプスタンパク質に対する抗体で免疫染色し、屈折率整合溶液に搭載し、画像化した。我々のデータは、CLARITYが全型実装におけるレチナルニューロンおよびグリア細胞の標準的な免疫物質化学的染色およびイメージングの品質を向上させることができることを示している。例えば、ドーパミン作動性アマリン細胞の微細軸索様および樹状構造の3D分解能は、CLARITYによって大幅に改善された。非処理型全型型レチナと比較して、CLARITYは、ポストナプティック密度タンパク質95などのシナプスタンパク質の免疫染色を明らかにすることができる。我々の結果は、CLARITYが脂質の除去後にレチナをより光学的に透明にし、レチナルニューロンとそのタンパク質の微細な構造を保存することを示し、これは全型実装中のレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングを得るために日常的に使用することができる。
Introduction
脊椎動物の残りは、おそらく中枢神経系(CNS)の最もアクセスしやすい部分であり、脳の発達、構造、機能を研究するための優れたモデルとして機能します。レチナ内の5つのクラスのニューロンは、2つのプレキシフォーム層で分離された3つの核層に分布する。外核層(ONL)は、光を電気信号に変換する古典的な感光体(ロッドとコーン)で構成されています。電気信号は、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞を含む内部核層(INL)のニューロンによって処理され、次いで神経節細胞層(GCL)の神経節細胞(RCL)に伝達される。RGCは、画像形成および非画像形成視覚機能に寄与するために脳に突出する軸索を有する、レティナの出力ニューロンである。さらに、3種類のグリア細胞(ミュラー細胞、アストログリア、ミクログリア)は、ニューロンに栄養素を提供し、細胞外環境の有害な変化からニューロンを保護します。
アマセリン細胞の特殊な亜集団の1つは、CNSにおける重要な神経調節薬であるドーパミンを産生および放出し、光の適応中に神経回路を再構成する1,2。ドーパミン作動性アマリン細胞(DAC)は、形態学的プロファイルのユニークな特徴を有する。彼らのソマトンは近位INLにあり、内膜層(IPL)の最も遠位部分にデンドライトが出る。DACの軸索のようなプロセスは、非髄膜、薄くて長く、まばらに分岐し、静脈瘤(ドーパミン放出の部位)です。それらはAIIアマトリン細胞のソマトンの周りのリングのような構造を含むIPLのデンドライトを有する密な神経叢を形成する。軸索はまた、OPLに向かってINLを通って走り、レティナ3を横切る遠心経路を形成する。我々は、DACプロセスが、双極性細胞および本質的に感光性神経節細胞(ipRGCs)4、5、6を含むシナプス前ニューロンからのグルタミン酸放出に応答して受容体を発現することを実証した。しかし、グルタミン酸受容体が軸索、樹状突起、あるいはその両方に発現するかどうかは、垂直の筋切片で切断され、互いに区別できないため5,6である。免疫染色は、DCの3次元分岐と細胞内区画上のグルタミン酸受容体の存在を明らかにするために、全型型のレチナで行う必要があります。レティナは比較的透明ですが、マウス全型型のレティナの厚さは約200μmで、深部組織への抗体の浸透を制限し、組織光散乱による高解像度イメージングのための光の浸透を低減します。これらの制限を克服するために、我々は、マウスのレチナを全マウントするに厚い脳切片のために最近開発された免疫染色適合組織ヒドロゲル脱脂質化法(CLARITY)を適応させました。
クラリティ法は、もともと、太い脳試料7の免疫染色およびイメージングのためにDeisseroth研究所によって開発されました。強力な洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、電気泳動を使用して脂質成分(組織光散乱を引き起こす)を除去し、タンパク質と核酸を所定の位置に残します。除去された脂質は、残りのタンパク質構造を支持するためにアクリルアミドなどのヒドロゲルモノマーで構成された透明な足場に置き換えられる。クリアされた組織は、免疫組織化学を介して標識することができ、組織を通して実質的に増加した光の浸透深さ(組織表面の下数ミリメートルまで)で画像化することができます。それ以来、CLARITY法は、いくつかの研究グループ8、9、10によって最適化され、簡素化されています。修飾されたCLARITYプロトコルは、受動的なクリア技術を使用して、全脳および他の無傷の器官11をクリアするための電気泳動によって生じる可能性のある組織損傷を回避する。しかし、この方法はまだ全マウントのレティナには適用されていません。ここでは、全身マウントレチナの受動的なCLARITY技術を応用し、免疫組織化学やイメージングに対して透明性を高めました。我々は、試験されたレチンタンパク質の大部分が免疫細胞化学のこのプロセス中に保存されたことを発見した。屈折率マッチングソリューションを用いて、ONLからGCLまでの約200μmの厚さにわたって、全型型のレティナでレチン性ニューロンを画像化することができました。
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Protocol
マウスケアと実験手順は、実験動物のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行われ、オークランド大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されました(プロトコルNo. 18071)。
注: ソリューションの名前とその構成を 表 1に示します。
1. 組織の準備
- マウスをCO2の過剰摂取で安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
- 湾曲した鉗子で目を核とし、0.1 M PBSの小さなシャーレに移す(表1)。解剖顕微鏡の下で、角膜スクレラ接合部に沿って小さな穴を針で突く。4%パラホルムアルデヒド(PFA)に1時間移します。
- 目をPBSの皿に戻します。解剖顕微鏡の下で、角膜スクレラ接合部の周りのすべての方法をカットするために解剖はさみを使用しています。角膜とレンズを取り外します。視神経の基部で切断し、慎重に脱皮を鉗子で剥がし、残性を分離します。
- レティナの周りに4つの小さな切り傷を均等にし、PBSに浸した細かい先端ブラシを使用して、ニトロセルロース濾紙から切り取られた小さな正方形の上にクローバーのような形で平らに(GCL側を下に)置き、レチナを安定させます。
- 鉗子を使ってレチナをニトロセルロース紙の角を保持し(取り付けられたレチナに触れず)、4%PFAの48ウェルプレートに1時間置きます。
- フィルターペーパーとレチナをPBSでウェルに移し、洗浄します(3倍で5分間ずつ)。
- A4P0(表1)に移し、穏やかな攪拌で一晩4°Cでインキュベートする。
- ピペット植物油を井戸に入れ、A4P0溶液を完全にカバーします。40°Cの水浴で3時間、振盪を起さないでインキュベートします。
- PBSで(それぞれ5分間3倍)洗浄し、すべての油が洗い流されていることを確認します。必要に応じて、最後のすすめの前に、残りの油を慎重にウェルの上部から除去するためにピペットを使用してください。
- 穏やかな揺れで2日間40°Cで10%SDSでインキュベート。2日目にSDSを新しいソリューションに交換してください。
- 濾紙とレチナをトリトンX-100(PBST、 表1)でPBSに移し、洗浄(それぞれ1.5時間5倍)します。
- PBSTで4°Cで0.01%アジドナトリウム(NaN3)で保存するか、免疫染色に直接移動します。
2. 免疫染色と屈折率のマッチング
- PBSTの細かい先端ブラシで軽く剥がして、フィルター紙からレチナを取り除きます。
- 一次抗体にレチナをインキュベートする (表2)ブロッキング溶液に希釈した(表1)を緩やかに振るとともに40°Cで2日間培養する。
- PBSTで(5倍、1.5時間)洗浄します。
- 適切な二次抗体を用いてインキュベートする(表3)を緩やかに振盪して40°Cで2日間ブロッキング溶液に希釈し、残りの手順を通して光から保護する。
- 0.02 Mリン酸緩衝液( 表1参照)で洗浄(5x、1.5時間ずつ)
- ソルビトールベースの屈折率マッチング溶液(sRIMS、 表1参照)で一晩で穏やかな揺れでインキュベートする。
3. 取り付け
- ガラス顕微鏡スライドの背面に正方形の境界をマークするために、細かい先端の永久マーカーと18 mm x 18 mm x 1.5 mmガラスカバースリップを概説します。
- スライドを裏返し、シリンジを使用してスライドの前面にシリコーングリースの細い線で境界をトレースし、余分な取り付け溶液が逃げるために1つのコーナーに小さなギャップを残します。
- 有形分を境界領域の中央に移し、ガラススライドに対して感光体側に平らに置くように細かい先端ブラシで配置します。
- ピペットのsRIMSは約60 μLで平坦なレチナを覆い、エンクロージャの一角まで伸び、レチナは平らで所定の位置に留まるように注意します。
- sRIMSでコーナーから始まるカバースリップを塗布し、気泡の形成を避け、すべての側面のグリースに触れるまでゆっくりと下げます。
- 取り付けられたレティナの両側に3つのカバーリップのスタックをスペーサーとして配置します。別のスライドの長いエッジを使用してカバースリップを押し下げて、マウントが平らで均等になるようにします。
- スライドはイメージングまで4°Cで平らに保管してください。
4. イメージング
- 従来の蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡上の画像サンプル (材料表)顕微鏡のステージにスライドを配置し、サンプルを見つけることから始めます。
注:反転された目的顕微鏡を使用している場合は、スライドを上向きに上に置き、まずスライドの露出した領域がすべてのシリコーングリースと取り付け溶液から離れているかどうかを確認します。 - 共標識サンプルのZ積層画像を得るためには、まず各チャンネルの信号に個別に焦点を合わせ、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡の露光時間または走査速度を設定します。
- 目的の範囲の上部と下部に焦点面を手動で設定するか、中点を設定してから中点の周囲の範囲を指定して、Z スタックの範囲を設定します。
- 必要に応じて、ステップサイズまたはスライス数を調整します。
- イメージをキャプチャして元のファイルを保存し、TIFF ファイルまたはその他の目的の形式でエクスポートします。
5. 画像解析
- 選択の画像解析ソフトウェアを使用して選択して (材料表)、Zスタックの単一の画像と3次元レンダリングの両方で最適な明瞭度が達成されるまで、各チャンネルの明るさとコントラストを調整します。
注:選択したステップサイズが十分に小さい場合、3Dデコンボリューションを実行して信号を強化することもできます。
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Representative Results
修飾されたCLARITY処理されたレチナは、光学的に透明な組織である。
十分な脱脂を提供し、細胞タンパク質の構造的完全性を保持しながら、レチナにおける免疫組織化学的用途と互換性のある組織クリアリング方法を策定するために、我々は、マウスの全実装にCLARITY組織クリアリング法を適合させた。プロトコルを簡素化し、全体マウントの retinas 用に変更することができました (プロトコルを参照)。組織ハイブリダイゼーション、クリア、および屈折率マッチングを完了した後、この修飾されたCLARITYプロトコルで処理されたレチナは、非処理対照レチナと比較した場合に、レチナの厚さ全体にわたってほぼ完全な光学透過性を示した(図1B)。この結果は、CLARITYプロトコルのこの改変が十分にクリアされた全マウントの残りの組織を提供することを示す。
修飾したCLARITY処理されたレティナにおけるニューロンの3Dイメージングを改善した。
この修飾したCLARITY法によって与えられる免疫組織化学的染色の質と実用性を評価するために、我々は様々な一次抗体でレチナを処理したクラリティを染色した(表2)。これらの抗体は、ノキノミの主要な細胞タイプを示す:円錐型の光受容体、ロッドバイポーラ細胞、アマリン細胞、RGC、グリア細胞、ならびに細胞下シナプスタンパク質に対する抗体。細胞活性マーカーホスホ-S6(pS6)を除いて、試験されたすべての抗体は、CLARITYと互換性があることが判明した。一般的な例を 図 2に示します。コーン・アレスチンに対する抗体、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、RNA結合タンパク質(RBPMS)を用いたトリプルラベリングを行いました。ONLからGCLまでの一連のz-スタック共焦点顕微鏡画像を撮影しました。個々の画像は、INL(図2A)、THラベル付きDAC(図2B)およびGCL内のRBPMSマーク付きRMC(図2C)に、アナリンチラベル付けコーンを示した。オーバーレイ画像は、これらのニューロンの相対位置を、その全ての厚さ以上のレティナを示した(図2D)。これらの結果は、CLARITYが多くの標準的な免疫組織化学的染色の質を向上させ、全実装調製物における全厚さのニューロンの3D構造を明らかにできることを示唆している。
修飾された明瞭さは、レチナルニューロンとシナプスタンパク質の微細なプロセスの改善された3D解像度を提供します。
更に、CLARITY加工全マウントレチナ(図3A、B)のTH染色を分析し、標準の全実装準備から得られたイメージングと比較した(図3C、D)。共焦点画像は、DACのデンドライトと軸索のようなプロセスが、標準的なretina(図3C)よりもCLARITY処理されたレティナ(図3A)ではるかに明確に明らかにされたことを示しています( 図3C)。特に、DACの軸索状のプロセスは、標準的なretinaよりも、より完全なリング状の構造を呈した(図3Aの挿入物を参照)。特に、蛍光顕微鏡を用いて採取したCLARITYレティナの環状構造(図3B)は共焦点を用いて観察されたものとほぼ同じであった(図3A)。また、軸索状のプロセスも、X-Z指向画像で観察された外れ線に向かって走った(図4A)。これらのデータは、CLARITYが従来の蛍光顕微鏡を使用しても、全マウントレチナにおけるDACの軸索様プロセスを同定するために使用できることを示唆している。
AMPA受容体サブユニットGluA2およびポストナプティクス密度タンパク質95(PSD-95)を標準的な全型型レチナで調べたところ、いずれも検出されなかったが、これらのシナプスタンパク質に対する抗体が深部レチナに浸透しにくいためである可能性が高い。クラリティ処理されたレチナが免疫染色体シナプスタンパク質に対してこれらの抗体を許容するかどうかを判断するために、サブユニットGluA2およびPSD-95でTHを三重に標識した。GluA2およびPSD-95に対する免疫染色は、個々のGluA2含有AMPA受容体(図4B)および推定ポストナプティック部位(図4C)をそれぞれ明らかにする明確な穿刺を示した。オーバーレイ画像は、DACプロセスで明らかないくつかの穿刺を示した(図4D)。3つの汚れすべてを含む局所的な共局在化のポイントを画像化し、3Dビューで表示しました(図5)。3 つのビューすべてから、TH は GluA2 と PSD-95 の両方と明確に共局化されます (図 5 A-C)。これらの3D遠近法は、全マウントレチナからの結果、垂直レチナルスライス5,6におけるDACプロセス上のGluA2含有AMPA受容体のシナプス発現に関する以前の報告を検証する。
図 1.CLARITYは光学的に透明なティッシュを提供する。 全マウントマウスのレチナは、変更されたCLARITY法(プロトコルを参照)と全体のレティナを解剖顕微鏡で画像化し、スケールを示すために0.67センチメートルの正方形のグリッド上に重ね合わせて処理しました。 A: 透明な組織を通して明確に見えるグリッド線を有するCLARITY処理全型マウントレティナ。矢印は、レティナの配置を示します。 B: 非クラリティ処理対照レティナは、PFAで1時間固定し、PBSでインキュベートした。グリッド線は、組織の相対的な不透明度によって隠されます。スケールバー:約2mm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.CLARITY処理されたレティナにおける、レティナの厚さ全体のニューロンの3Dイメージングを改善した。全マウントのクラリティレチナは、コーンアレプチン、TH、およびRBPMSに対する抗体で免疫染色された。イメージは、Z スタックの共焦点イメージの 3D ボリューム レンダリングを表し、X-Z 方向で表示されます。A:コーンアレスプシン(青)によって標識された錐体(矢印)。わずかにスペックルは、背景染色のために、内側のretina(矢印頭)に見えます。B:DACソーマと樹状突起(矢印)はTH(赤)でラベル付けされています。矢印は、多重標識免疫染色のために見える内のレチナの血管を示す。C:RGCソマタ(矢印)はRBPMS(緑色)によって標識される。矢印は、自己蛍光および血管の非特異的染色によって目に見える血管のレチンを示す。D:三重標識染色の合成画像は、外側核層に位置する円錐光受容体、内核層のDAC、および神経節細胞層のRGCを用いて、レティナの厚さ全体にわたってこれらのニューロンの相対的な配置を明らかにする。ボリュームビューのスケールは20 μm単位でマークされています。
図 3.クラリティはDAC形態の微細構造を明らかにする。 TH免疫染色は、CLARITY処理(A および B)および標準(C および D)のレチナで行った。Z積層画像は、共焦点(A および C)および蛍光顕微鏡(B および D)を用いて撮影した。各画像の単一の光学面からの挿入は、おそらく軸索のようなプロセスによって形成されたリングのような構造を強調する。アローヘッドはDACソマタを示し、多くのリング状の構造が、CLARITY処理されたレティナ(A および B)で明らかにされたデンドライトおよび軸索様プロセスの緻密な叢に目に見える(例は矢印で示される)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.修飾された明瞭さは、微細樹状構造およびシナプスタンパク質の改善された3D解像度を提供します。TH、GluA2、およびPSD-95に対する抗体を有するCLARITY処理全型レチナにおいてトリプル免疫染色を行った。ボリューム レンダリングは、Z スタックの共焦点イメージングから再構築され、角度付きの X-Z 方向で表示されます。A:THラベルDACソマタ(矢印頭)内部核層とプロセス(黄色の矢印)は、遠位内神経叢層(赤)に階層化する。白い矢印は、外側のレティナに向かって伸びる遠心プロセスを示します。B:内型プレキシフォーム層(緑色)を介してGluA2含有AMPA受容体の緻密な穿刺発現。矢印は、胎児の血管からの蛍光を示す。C:プンクタは、内側のプレキシフォーム層(青)でPSD-95によってラベル付けされたシナプス後のサイトを明らかにする。矢印は、PSD-95に対するマウスモノクローナル抗体の使用による明らかな血管を示す。D:TH ラベル付き DAC プロセスの重複を示すオーバーレイ画像と GluA2 と PSD-95 の表現。ボリュームビューのスケールは20 μm単位でマークされています。
図 5.DAC上のGluA2含有AMPA受容体のシナプス発現図4に示すTH,GluA2,PSD-95の三重共局化の点を3Dで選択し、調査した。A1 は、X-Z 方向 (A5) の DAC プロセスのセグメント (赤) を表します。A2とA3は、同じ向きで、それぞれ単一のGluA2パンクタム(緑)とPSD-95パンクタム(青)を示しています。合成された画像(A4)はTH、GluA2およびPSD-95(矢印)の三重共局在を示す。B1-B4は、同じ同一局在化点(矢印)をY-Z方向(B5)で示す。C1-C4は、X-Y平面(C5)における同一点(矢印)の共局在化を示す。トリプル共局在化は、各向きで明らかです。スケールバー:2 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 組成 | 筆記 |
| 0.1 M PBS | 137 mM ナクル | pH を 7.4 に調整する |
| 26.8 mM KCl | ||
| 10.1 mM Na2HPO4 | ||
| 17.6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% アクリルアミド | 氷、アリコート、および -20 ºC で保管する準備 |
| 0.25% VA-044 | ||
| 0.1 M PBS | ||
| PBST | 0.1% (v/v) トリトン-X-100 | |
| 0.1 M PBS | ||
| ブロッキング ソリューション | 2% NDS または 1% BSA | |
| 0.01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| 0.1 Mリン酸バッファー | 11.93 g Na2HPO4/リットル | pH を 7.5 に調整する |
| 15.34 g NaH2PO4/リットル | ||
| ddH2O | ||
| スライムス | 70% ソルビトール | NaOH で pH を 7.5 に調整する |
| 0.1% トゥイーン-20 | ||
| 0.01% NaN3 | ||
| 0.02 Mリン酸緩衝液 | ||
表 1.ソリューションの構成:
| 抗体 | IHC | ホスト | 希釈 | カタログ# | サプライヤー | Ab レジストリ ID | ターゲット |
| 青に敏感なオプシン | +3 | ヤギポリクローナル | 1:1000 | SC-14363 | サンタクルスバイオテクノロジー | AB_2158332 | Sコーン |
| コーン・アレプチン | +2 | ウサギのポリクローナル | 1:1000 | AB15282 | エムディ ミリポア | AB_1163387 | 円錐 |
| プロテインキナーゼCアルファ(PKC-α) | +3 | ウサギのポリクローナル | 1:1000 | SC-208 | サンタクルスバイオテクノロジー | AB_2168668 | ロッドバイポーラセル |
| グリア性原線維酸性タンパク質(GFAP) | +3 | ヤギポリクローナル | 1:500 | SC-6170 | サンタクルスバイオテクノロジー | AB_641021 | アストロサイト |
| チロシンヒドロキシラーゼ (TH) | +3 | 羊のポリクローナル | 1:500 | AB1542 | エムディ ミリポア | AB_90755 | ドーパミン作動性アマセリン細胞 |
| チロシンヒドロキシラーゼ (TH) | +2 | ウサギのポリクローナル | 1:500 | OPA1-04050 | サーモフィッシャー | AB_325653 | ドーパミン作動性アマセリン細胞 |
| コリンアセチルトランスフェリン酵素 (ChAT) | +1 | ヤギポリクローナル | 1:500 | AB144P | エムディ ミリポア | AB_2079751 | スターバーストアマキュリン細胞 |
| 多重スプライシング(RBPMS)を有するRNA結合タンパク質 | +1 | モルモットポリクローナル | 1:2000 | ABN1376 | エムディ ミリポア | AB_2687403 | 神経節細胞 |
| グルア2 | +3 | ウサギのポリクローナル | 1:500 | AB1768-I | エムディ ミリポア | AB_2247874 | Ca2+不透過性 AMPA 受容体 |
| グルア2 | +2 | マウスモノクローナル | 1:250 | MABN1189 | エムディ ミリポア | AB_2737079 | Ca2+不透過性 AMPA 受容体 |
| ポストナプティクス密度タンパク質 95 (PSD-95) | +3 | マウスモノクローナル | 1:1000 | 75-028 | ニューロマブ | AB_2877189 | シナプスサイト |
| ホスホ-S6 (pS6) | 0 | ウサギのポリクローナル | 1:500 | 44-923G | サーモフィッシャー | AB_2533798 | セルアクティビティマーカー |
表 2. 試験された一次抗体の概要。 IHCの伝説:+3 =一貫した、非常に特異的な染色。+2 =一貫して良好な染色、最小限の背景。+1 = 良好な染色、いくつかの背景。0 = クラリティと互換性がありません。
| ホスト | 標的種 | 共役 | 希釈 | サプライヤー |
| 驢馬 | アンチヒツジ | アレクサ・フルーオール 568 | 1:500 | インビトロジェン |
| 驢馬 | アンチヒツジ | アレクサ・フルーオール 594 | 1:500 | インビトロジェン |
| 驢馬 | 抗ウサギ | アレクサ・フルーオール 488 | 1:500 | インビトロジェン |
| 驢馬 | 抗ウサギ | アレクサ・フルーオール 594 | 1:500 | インビトロジェン |
| 山羊 | 抗ウサギ | アレクサ・フルーオール 647 | 1:500 | インビトロジェン |
| 驢馬 | アンチマウス | アレクサ・フルーオール 488 | 1:500 | インビトロジェン |
| 驢馬 | アンチマウス | アレクサ・フルーオール 647 | 1:500 | インビトロジェン |
| 驢馬 | アンチヤギ | アレクサ・フルーオール 568 | 1:500 | インビトロジェン |
| 驢馬 | アンチヤギ | アレクサ・フルーオール 594 | 1:500 | インビトロジェン |
| 山羊 | 抗モルモット | アレクサ・フルーオール 488 | 1:500 | インビトロジェン |
表 3.二次抗体の概要をテストしました。
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Discussion
全マウントのレティナのためのCLARITYプロトコルの変更。
我々は、ほとんどの以前の研究7、9、11で使用されているように、真空排気または乾燥室を必要とせずに適切な重合を達成するためにCLARITYプロトコルを簡素化しました。重合プロセスは酸素によって阻害され、プロトコルの重合工程中に試料を空気から単離することを要求する。しかし、窒素で脱気するのではなく、前述の12のように、徹底的にリンスした後のプロトコルの残りの部分に悪影響を及ぼすことなく重合を可能にするサンプルを十分に単離したサンプルを油で覆うことを発見した。我々はさらに、受動的なクリアリング法を用いてプロトコルを簡素化し、電気泳動クリアリング11に関連する組織構造に対する組織の褐変および損傷のリスクを制限した。受動のクリアリングは穏やかな動揺および上昇温度によって加速され、たった2日で完全なティッシュの清算を可能にする。この期間中、十分な脱脂が達成され、細胞構造および免疫組織化学的染色に不可欠なタンパク質および他の生体分子の損失を最小限に抑えながら、光学的に透明な組織を生じさせる。
CLARITYは、全マウント調製物におけるレチナルニューロンおよびグリア細胞のタンパク質を保存する。
我々の結果は、ほぼすべての抗体がCLARITY処理されたレティナで働くことをテストしたことを示している。これらの抗体は、感光体、双極細胞、アマリン細胞、RGCおよびグリア細胞を示す。我々は、各クラスのレチナルニューロンのサブタイプの抗体をテストすることはできませんでしたが、我々の結果は、CLARITY処理されたretinasが、retinaの大部分の細胞マーカーに使用できることを示唆しています。我々が試験したほとんどの抗体は、非CLARITY処理されたレティナにおける免疫染色体神経細胞も可能であるが、CLARITYは、レティナの深部組織への適切な抗体の浸透を可能にし、その後、内層の中層で染色の良好な特異性を提供することを発見した。さらに、CLARITYは、レティナの厚さ全体の光の浸透を改善し、光散乱を低減し、最も深い層を通して高解像度のイメージングを可能にすることを発見しました。これらの要因は、非CLARITY標準全マウントIHC13と比較して、CLARITY処理全型型レチナにおける染色および画像化の両方の改善に寄与する。背景の縮小と 3D イメージングとボリューム レンダリングの改善により、すべての層の細胞構造を、retina の厚さ全体にわたって完全に調査できます。
CLARITYは、全体マウントのレチナにおけるDACの微細なプロセスとシナプス構造を明らかにします。
我々の結果は、DACのリング状構造および遠心プロセスが、非CLARITY全マウントレチナよりもCLARITY処理で明らかにされることを示している。特に、CLARITY処理組織による免疫染色は、共焦点イメージングを必要とせずに標準的な蛍光顕微鏡法を用いても、これらの微細構造の良好な分解能を可能にする。視覚機能におけるDACの重要性を考えると、CLARITY製剤は、正常なレチナにおけるDACの構造および病気の状態下での形態学的変化を調査するために使用することができる。
標準的な全マウント組織を用いたPSD-95およびGluA2の免疫染色では、これらの細胞下構造の標識が、レチナの深層においてほとんどまたは全く認められず、抗体の浸透が悪いことが示された。CLARITYプロトコルの適用は、これらのタンパク質を内のレチナル層で明確に染色することを可能にし、深部組織への抗体浸透の改善を示す。我々の結果は、CLARITYが、垂直スライス調製物6で通常観察される全マウントレチナにおけるDACプロセス上のシナプスタンパク質の検出を可能にすることを示している。軸索様プロセスは縦のスライスの樹状突起と区別できないため、CLARITY全型プリティナは、双極細胞やipRGCなどの他のニューロンからのDACへのシナプス入力が樹状突起、軸索様プロセス、または両方の5,6で発生するかどうかを判断する機会を提供します。AMPA受容体およびPSD-95タンパク質はIPL全体に広く分布しているため、DAC上でのこれらのタンパク質の発現は、他のレチナルニューロンにおけるシナプスタンパク質の同定に使用されるCLARITYレチナの優れた例を設定した。
全体マウントのretinasのためのCLARITYプロトコルの考慮事項、制限、および将来のアプリケーション。
まず、CLARITY処理された全マウントのレティナの重合および清算プロトコルは、組織調製プロセスに数日を追加します。しかし、この方法は、明確化されたレチナが最小限の組織分解で最大2週間、アジ化ナトリウム含有PBSに保存することができるという事実によって、依然として非常に実用的である。第二に、CLARITY7,11の以前のアプリケーションで文書化されているように、クリアリングプロセス全体を通して組織のいくつかの膨張が観察された。しかし、屈折率マッチング溶液との平衡化時に、レティナはほぼ元の大きさに戻ることがわかりました。組織容積の潜在的な軽微な変化は、細胞または細胞内構造7、11の有意な歪みを引き起こさないかもしれない。第3に、より厚い脳試料を撮像する場合、顕微鏡目的は、しばしば、顕微鏡レンズから組織12を通して完全な屈折率が一致できるように、取り付け媒体に直接浸漬される。レチナなどの薄いサンプルでは、サンプルをより平坦にし、イメージングのためにより均一にするために取り付けるためのカバーリップを使用しました。カバースリップによる屈折の影響は、イメージングに対して最小限に見えます。第四に、私たちの画像の一部は、目を核球する前に心臓内灌流(非特異的な染色を避けるために使用することが示唆される)で動物全体を浸透させなかったため、非特異的血管染色を示しています。最後に、マウスに適合する現在のプロトコルは、他の種のレティナに使用することができる。特に、イヌ、ブタ、馬、霊長類などの大型動物のレチナは、マウスの動物よりもはるかに厚い。このCLARITYプロトコルは、脂質を除去した後、これらの動物のレチナをより光学的に透明にし、免疫染色のためにレチナルニューロンとそのタンパク質の微細な構造を維持する可能性があります。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
Bing、ネイサン・スピックス、ハオ・リュウの技術サポートに感謝します。この研究は、国立衛生補助金協会EY022640(D.-Q.Z.)とオークランド大学プロボスト学部学生研究賞(E.J.A.)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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