CLARITY組織クリアリング法による全マウントレティナの免疫染色
Summary
ここでは、脳組織のCLARITY法を全マウントレチナに適応させ、標準的な免疫組織化学染色およびレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングの品質を向上させるプロトコルを提示する。
Abstract
もともと、Deisseroth研究室で開発された組織ヒドロゲル脱脂法(CLARITY)は、厚い脳試料の免疫染色およびイメージングに改変され、広く使用されている。しかし、この高度な技術はまだ全マウントのレティナには使用されていません。レティナは部分的に透明ですが、その厚さは約200μm(マウス)であり、依然として抗体の深部組織への浸透を制限し、高解像度イメージングのための光の浸透を減少させる。ここでは、アクリルアミドモノマーで重合してナノ多孔質ヒドロゲルを形成し、タンパク質の損失を最小限に抑え、組織の損傷を避けるためにドデシル硫酸ナトリウムでクリアすることで、マウス全実装のレチナにCLARITY法を適合させました。CLARITY処理されたレチナを、レチナルニューロン、グリア細胞、シナプスタンパク質に対する抗体で免疫染色し、屈折率整合溶液に搭載し、画像化した。我々のデータは、CLARITYが全型実装におけるレチナルニューロンおよびグリア細胞の標準的な免疫物質化学的染色およびイメージングの品質を向上させることができることを示している。例えば、ドーパミン作動性アマリン細胞の微細軸索様および樹状構造の3D分解能は、CLARITYによって大幅に改善された。非処理型全型型レチナと比較して、CLARITYは、ポストナプティック密度タンパク質95などのシナプスタンパク質の免疫染色を明らかにすることができる。我々の結果は、CLARITYが脂質の除去後にレチナをより光学的に透明にし、レチナルニューロンとそのタンパク質の微細な構造を保存することを示し、これは全型実装中のレチナルニューロンとその細胞下構造の高解像度イメージングを得るために日常的に使用することができる。
Introduction
脊椎動物の残りは、おそらく中枢神経系(CNS)の最もアクセスしやすい部分であり、脳の発達、構造、機能を研究するための優れたモデルとして機能します。レチナ内の5つのクラスのニューロンは、2つのプレキシフォーム層で分離された3つの核層に分布する。外核層(ONL)は、光を電気信号に変換する古典的な感光体(ロッドとコーン)で構成されています。電気信号は、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞を含む内部核層(INL)のニューロンによって処理され、次いで神経節細胞層(GCL)の神経節細胞(RCL)に伝達される。RGCは、画像形成および非画像形成視覚機能に寄与するために脳に突出する軸索を有する、レティナの出力ニューロンである。さらに、3種類のグリア細胞(ミュラー細胞、アストログリア、ミクログリア)は、ニューロンに栄養素を提供し、細胞外環境の有害な変化からニューロンを保護します。
アマセリン細胞の特殊な亜集団の1つは、CNSにおける重要な神経調節薬であるドーパミンを産生および放出し、光の適応中に神経回路を再構成する1,2。ドーパミン作動性アマリン細胞(DAC)は、形態学的プロファイルのユニークな特徴を有する。彼らのソマトンは近位INLにあり、内膜層(IPL)の最も遠位部分にデンドライトが出る。DACの軸索のようなプロセスは、非髄膜、薄くて長く、まばらに分岐し、静脈瘤(ドーパミン放出の部位)です。それらはAIIアマトリン細胞のソマトンの周りのリングのような構造を含むIPLのデンドライトを有する密な神経叢を形成する。軸索はまた、OPLに向かってINLを通って走り、レティナ3を横切る遠心経路を形成する。我々は、DACプロセスが、双極性細胞および本質的に感光性神経節細胞(ipRGCs)4、5、6を含むシナプス前ニューロンからのグルタミン酸放出に応答して受容体を発現することを実証した。しかし、グルタミン酸受容体が軸索、樹状突起、あるいはその両方に発現するかどうかは、垂直の筋切片で切断され、互いに区別できないため5,6である。免疫染色は、DCの3次元分岐と細胞内区画上のグルタミン酸受容体の存在を明らかにするために、全型型のレチナで行う必要があります。レティナは比較的透明ですが、マウス全型型のレティナの厚さは約200μmで、深部組織への抗体の浸透を制限し、組織光散乱による高解像度イメージングのための光の浸透を低減します。これらの制限を克服するために、我々は、マウスのレチナを全マウントするに厚い脳切片のために最近開発された免疫染色適合組織ヒドロゲル脱脂質化法(CLARITY)を適応させました。
クラリティ法は、もともと、太い脳試料7の免疫染色およびイメージングのためにDeisseroth研究所によって開発されました。強力な洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、電気泳動を使用して脂質成分(組織光散乱を引き起こす)を除去し、タンパク質と核酸を所定の位置に残します。除去された脂質は、残りのタンパク質構造を支持するためにアクリルアミドなどのヒドロゲルモノマーで構成された透明な足場に置き換えられる。クリアされた組織は、免疫組織化学を介して標識することができ、組織を通して実質的に増加した光の浸透深さ(組織表面の下数ミリメートルまで)で画像化することができます。それ以来、CLARITY法は、いくつかの研究グループ8、9、10によって最適化され、簡素化されています。修飾されたCLARITYプロトコルは、受動的なクリア技術を使用して、全脳および他の無傷の器官11をクリアするための電気泳動によって生じる可能性のある組織損傷を回避する。しかし、この方法はまだ全マウントのレティナには適用されていません。ここでは、全身マウントレチナの受動的なCLARITY技術を応用し、免疫組織化学やイメージングに対して透明性を高めました。我々は、試験されたレチンタンパク質の大部分が免疫細胞化学のこのプロセス中に保存されたことを発見した。屈折率マッチングソリューションを用いて、ONLからGCLまでの約200μmの厚さにわたって、全型型のレティナでレチン性ニューロンを画像化することができました。
Protocol
Representative Results
Discussion
全マウントのレティナのためのCLARITYプロトコルの変更。
我々は、ほとんどの以前の研究7、9、11で使用されているように、真空排気または乾燥室を必要とせずに適切な重合を達成するためにCLARITYプロトコルを簡素化しました。重合プロセスは酸素によって阻害され、プロトコルの重合工程中に試料を空気か…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bing、ネイサン・スピックス、ハオ・リュウの技術サポートに感謝します。この研究は、国立衛生補助金協会EY022640(D.-Q.Z.)とオークランド大学プロボスト学部学生研究賞(E.J.A.)によって支援されました。
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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