Summary
在这里，我们提出了一个协议，以调整整个安装视网膜脑组织的CLARITY方法，以提高标准免疫化学染色和视网膜神经元及其细胞下结构的高分辨率成像的质量。
Abstract
组织水凝胶脱皮法（CLARITY），最初由戴塞罗斯实验室开发，已被修改并广泛用于免疫染色和成像厚脑样本。然而，这种先进的技术尚未用于全山视网膜。虽然视网膜是部分透明的，但其厚度约为200微米（小鼠），仍然限制抗体渗透到深层组织，并降低高分辨率成像的光渗透。在这里，我们采用了CLARITY方法，用丙烯酰胺单体聚合，形成纳米多孔水凝胶，然后用硫酸钠清除它们，以尽量减少蛋白质损失，避免组织损伤。CLARITY处理的视网膜被视网膜神经元、胶质细胞和突触蛋白的抗体所感染，安装在折射指数匹配溶液中，并成像。我们的数据表明，CLARITY可以提高全安装制备中视网膜神经元和胶质细胞的标准免疫化学染色和成像的质量。例如，CLARITY 大大提高了多巴胺胺类阿米林细胞精细轴突状和树突状结构的 3D 分辨率。与非加工全山视网膜相比，CLARITY 可以揭示突触蛋白（如后突触密度蛋白 95）的免疫染色。我们的结果表明，在去除脂质后，CLARITY 使视网膜更加透明，并保留了视网膜神经元及其蛋白质的精细结构，这些结构可用于在全安装制备中获取视网膜神经元及其子细胞结构的高分辨率成像。
Introduction
脊椎动物直膜也许是中枢神经系统（CNS）中最容易接近的部分，是研究大脑发育、结构和功能的极好模型。网状膜中的五类神经元分布在三个核层中，由两个丛状层隔开。外核层（ONL）由将光转换成电信号的经典光感受器（棒和圆锥体）组成。电信号由内核层 （INL） 中的神经元处理，包括双极、水平和阿马林细胞，然后传输到结节细胞层 （GCL） 中的视网膜结节细胞 （RGCs）。RGC 是视网膜的输出神经元，轴突投射到大脑中，有助于图像形成和非图像形成的视觉功能。此外，三种类型的胶质细胞（穆勒细胞、天文胶质和微胶质）为神经元提供营养，并保护神经元免受细胞外环境的有害变化。
一种特殊的亚种群的阿马克莱细胞产生和释放多巴胺，在CNS中的重要神经调节器，重新配置视网膜神经回路在光适应1，2。多巴胺胺性腺素细胞 （DACs） 具有形态特征的独特特征。他们的索玛塔位于近侧的 INL 中，树突在内丛状层 （IPL） 的最荒凉部分进行撞击。DAC 的Axon 样过程是未细化、薄而长、枝条稀疏且具有差异（多巴胺释放的部位）。它们与 IPL 中的树突形成密集的丛状物，包括围绕 AII amacrine 细胞的索马塔周围的环状结构。轴突也穿过 INL 向 OPL 运行，形成一条穿过视网膜3的离心通道。我们已经证明，DAC处理表达受体，以回应谷氨酸释放从前突性神经元，包括双极细胞和内在感光视网膜结节细胞（ipRGCs）4，5，6。然而，目前还不清楚谷氨酸受体是否表达在轴突上，树突上，或两者，因为它们被切断在垂直视网膜部分，不能区分彼此5，6。需要在整个安装视网膜中进行免疫染色，以揭示 DAC 的三维分支和亚细胞隔间中谷氨酸受体的存在。虽然视网膜相对透明，但小鼠全坐骑视网膜的厚度约为 200 μm，这限制了抗体渗透到深层组织，并减少了组织光散射导致的高分辨率成像光渗透。为了克服这些限制，我们调整了免疫染色相容组织水凝胶脱脂方法（CLARITY）最近开发的厚脑部分到全安装小鼠视网膜7。
CLARITY方法最初是由戴塞罗斯实验室开发的，用于免疫和成像厚脑样本7。它使用强洗涤剂、硫酸钠 （SDS） 和电磷酸盐去除脂质成分（导致组织光散射），使蛋白质和核酸就位。去除的脂质被一个透明的脚手架所取代，该脚手架由丙烯酰胺等水凝胶单体组成，以支持剩余的蛋白质结构。清除的组织可以通过免疫化学进行标记，并通过组织（组织表面以下几毫米）显著增加光渗透深度进行成像。此后，由8、9、10几个研究小组对CLARITY方法进行了优化和简化。修改后的CLARITY协议使用被动清除技术，以避免电泳可能产生的组织损伤，用于清除全脑和其他完整的器官11。然而，这种方法尚未应用于全山视网膜。在这里，我们为全山视网膜采用了被动的CLARITY技术，使其在免疫化学和成像方面更加透明。我们发现，在免疫造血过程中，大多数被测试的视网膜蛋白都保存下来。使用折射指数匹配解决方案，我们能够在全山视网膜中从 ONL 到 GCL 的大约 200μm 厚度上对视网膜神经元进行成像。
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Protocol
老鼠护理和所有实验程序都是根据国家卫生研究院关于实验室动物的指南进行的，并得到了奥克兰大学动物护理和使用机构委员会的批准（第18071号议定书）。
注：解决方案的名称及其组成列在 表1中。
1. 组织准备
- 用过量的二氧化碳对小鼠进行安乐死，然后是颈椎脱位。
- 用弯曲的钳子使眼睛受洗，并将其转移到带有0.1 M PBS（表1）的小培养皿中。在解剖显微镜下，用针头在角膜-硬膜交界处戳一个小洞。转移到4%的甲醛（PFA）1小时。
- 将眼睛移回带有 PBS 的菜。在解剖显微镜下，使用解剖剪刀在角膜-硬膜交界处一路切割。取出角膜和镜片。切开视神经底部，用钳子小心地剥去硬膜，以隔离视网膜。
- 在视网膜周围均匀地进行四个小切口，并使用浸入 PBS 的细尖刷将其平整（GCL 侧向下），形成三叶草状形状，从硝基纤维素滤纸上切开一个小方块，以稳定视网膜。
- 使用钳子转移网膜，以保持硝基纤维素纸的一角（不接触安装的网膜），并将其放置在48井板与4%PFA 1小时。
- 将滤纸和网膜转移到带 PBS 的井中，然后洗涤（每次 3 次，每次 5 分钟）。
- 转移到A4P0（表1），并在4°C的温和搅拌下在一夜之间孵化。
- 派佩特植物油进入井中，完全覆盖A4P0溶液。在40°C的水浴中孵育3小时，无摇晃。
- 在 PBS 中清洗（每次 3 次 5 分钟），确保所有油均被冲洗掉。如有必要，请使用管道在最后一次冲洗之前小心地从油井顶部取出剩余的油。
- 在 40 °C 的 10% SDS 中孵化两天，轻轻摇晃。在第二天用新的解决方案替换 SDS。
- 将滤纸和视网膜与 Triton-X-100 （PBST， 表 1）一起转移到 PBS 中，然后洗涤（每次 5 倍，每张 1.5 小时）。
- 在PBST中储存4°C，含0.01%的钠（NaN3），或直接移动到免疫染色。
2. 免疫染色和折射指数匹配
- 用PBST中的细尖刷轻轻剥落，从滤纸中取出网膜。
- 在阻塞溶液（表 1）中稀释的主要抗体 （表 2）中孵化 2 天，在 40 °C 下轻轻摇晃。
- 在PBST中清洗（5倍，每个1.5小时）。
- 在 40 °C 的阻塞溶液中用适当的二次抗体（表 3）稀释 2 天，轻轻摇晃，并通过剩余过程免受光线的照射。
- 在 0.02 M 磷酸盐缓冲区中清洗 （5 倍，每个 1.5 小时）（见表 1）。
- 在基于沙比妥的折射指数匹配解决方案 （sRIMS，参见 表 1）中孵化，在 40 °C 过夜，轻轻摇晃。
3. 安装
- 勾勒出 18 mm x 18 mm x 1.5 mm 玻璃盖片，并带有细尖永久标记，以标记玻璃显微镜幻灯片背面的方形边界。
- 翻转滑梯，使用注射器在滑梯正面用细细的硅胶油脂线追踪边界，在一个角落留下一个小缝隙，以便多余的安装溶液逸出。
- 将网膜转移到边界区域的中心，并安排用细尖刷，使其平躺在照片受体侧对玻璃滑梯。
- Pipette 大约 60μL 的 SRIMS，以便它覆盖扁平的网状网膜，并延伸到外壳的一角，注意网状网膜保持平整和到位。
- 将盖片从角落与 SRIMS 一起涂抹，慢慢降低，直到它触及四面的油脂，避免形成气泡。
- 将一叠 3 个盖片放在安装的网膜的每一侧作为垫片。使用另一张幻灯片的长边向下按下盖子，使坐骑是平的，均匀的。
- 在成像前，将幻灯片平放到 4 °C。
4. 成像
- 传统荧光显微镜或共聚焦显微镜（材料表）上的图像样本。首先将幻灯片放在显微镜舞台上并定位样品。
注意：如果使用倒置的客观显微镜，请将幻灯片倒置在舞台上，首先确保滑梯的暴露区域远离所有硅胶油脂和安装溶液。 - 要获取共同标记样品的 z 堆叠图像，请首先单独关注每个通道中的信号，并分别设置荧光或共焦显微镜的曝光时间或扫描速度。
- 通过手动将焦距设置在所需范围的顶部和底部，或者设置中点，然后指定中点周围的范围，为 z 栈设置范围。
- 根据需要调整步幅大小或切片数量。
- 捕获图像并保存原始文件，并导出它作为 TIFF 文件或其他所需的格式。
5. 图像分析
- 使用所选图像分析软件（材料表）调整每个通道的亮度和对比度，直到在单个图像和 z-stack 的三维渲染中实现最佳清晰度。
注意：如果选定的步幅足够小，也可以执行 3D 下放以增强信号。
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Representative Results
经过修改的CLARE处理视网膜是光学透明组织。
为了制定一种与视网膜免疫生化应用相容的组织清除方法，同时提供足够的去皮化和保持细胞蛋白的结构完整性，我们采用了CLARITY组织清除方法，以全安装小鼠视网膜。我们能够简化协议并修改它为全安装视网膜（见协议）。在完成组织杂交、清除和折射索引匹配后，与非加工控制视网膜（图 1B）相比，使用此修改的 CLARITY 协议处理的视网膜在整个视网膜厚度（图1A）中显示出几乎完全的光学透明度。这一结果表明，对CLEARCLE协议的修改提供了充分清除的全安装网膜组织。
改进了经过修改的 CLARITY 处理视网膜中神经元的 3D 成像。
为了评估这种改良的CLARITY方法提供的免疫化学染色的质量和实用性，我们用各种主要抗体（表2）染色了CLARITY处理视网膜。这些抗体标记了网状网膜中的每种主要细胞类型：锥形光感受器、杆双极细胞、阿麦格林细胞、RGCs 和胶质细胞，以及针对亚细胞突触蛋白的抗体。除细胞活性标记磷-S6（pS6）外，所有测试的抗体都证明与CLARITY兼容。典型的例子用图2来说明。我们对锥形凝血素、酪氨酸羟基酶 （TH） 和具有多拼接 （RBPMS） 的 RNA 结合蛋白进行了三重标记。我们从 ONL 到 GCL 拍摄了一系列z堆栈共焦显微镜图像.个别图像显示，在 ONL（图 2A）、INL（图 2B）中标有 TH 标签的 DAC 和在 GCL （图2C）中标记 RBPMS 标记的 RGC 中的逮捕素锥体。叠加图像揭示了这些神经元在整个视网膜厚度的相对位置（图2D）。这些结果表明，CLARITY可以提高许多标准免疫化学染色的质量，并清楚地揭示整个安装制剂中视网膜整个厚度的神经元的3D结构。
改性CLARITY可提高视网膜神经元和突触蛋白精细过程的3D分辨率。
我们进一步分析了CLARIT处理的全安装视网膜（图3A，B）中的TH染色，并将其与从标准全安装制备（图3C，D）获得的成像进行比较。对焦图像显示，在CLEAL处理的直膜（图3A）中，与标准的直膜（图3C）相比，DAC的树突和轴突状过程暴露得更加清晰。特别是，与标准视网膜相比，DAC 的轴状过程在 CLARITY 视网膜中表现出更完整的环状结构（见图 3A中的插入）（见图 3C中的插入物）。值得注意的是，使用荧光显微镜（图3B）拍摄的CLARITY网状网状结构与使用共焦（图3A）观察到的结构几乎相同。此外，类似轴龙的过程也向外视网膜运行，在 X-Z 定向图像（图 4A）中观察到。这些数据表明，即使使用传统的荧光显微镜，仍可用于识别全山视网膜中类似轴龙的 DAC 过程。
当AMPA受体亚单位GluA2和后突触密度蛋白95（PSD-95）在标准全山视网膜中检查时，两者都没有被发现，可能是由于抗体对这些突触蛋白渗透到深视网膜中。为了确定CLARITY处理的视网膜是否允许这些抗体免疫性突触蛋白，我们用亚单位GluA2和PSD-95对TH进行了三重标记。对GluA2和PSD-95的免疫学显示，分别显示单独的含有GluA2的AMPA受体（图4B）和假定后抗菌位点（图4C）。叠加图像显示 DAC 进程 （图 4D）上的一些标点符号明显。我们用所有三个污渍对假定共定位点进行了成像，并将其呈现在 3D 视图中（图 5）。从所有三种观点，TH 与 GluA2 和 PSD-95（图 5 A-C）明确共存。这些3D视角的结果来自全安装视网膜验证我们以前的报告，即在垂直视网膜切片5，6的DAC过程中，含GluA2的AMPA受体的突触表达。
图1。CLARITY 提供光学透明组织。 全安装鼠标视网膜使用修改后的 CLARITY 方法（参见协议）进行处理，整个视网膜使用解剖显微镜成像，覆盖在 0.67 厘米的方格上以显示比例。 答： 清晰处理的全安装视网膜，网格线通过透明组织清晰可见。箭头描绘直膜的位置。 B： 非清晰处理控制性网状管，在 PFA 中固定 1 小时，并在 PBS 中孵育。网格线被组织的相对不透明性所掩盖。比例栏：约2毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。改进了在 CLARITY 处理视网膜中视网膜厚度的神经元的三维成像。 全山的CLARITY视网膜被免疫，并带有针对锥体逮捕素、TH和RBPMS的抗体。图像表示在 X-Z 方向中查看的 z 堆叠共焦图像的 3D 卷渲染。 答： 锥色光感受器（箭头），由锥体逮捕（蓝色）标记。内视网膜（箭头）中可见轻微斑点，可能是由于背景染色。 B： DAC索马和树突（箭头）由TH标记（红色）。箭头指示内视网膜中的视网膜血管，由于多标签免疫染色而可见。 C： RBPMS（绿色）标记的RGC索马塔（箭头）。箭头表示由于血管的自流和非特异性染色而可见视网膜血管。 D： 三层标记染色的合并图像，揭示了这些神经元在视网膜厚度的相对位置，锥形光感受器位于外核层，DAC位于内部核层，RGC位于结核细胞层。卷视图的缩放以 20μm 的增量标记。 请单击此处查看此图的更大版本。
图3。清晰揭示了DAC形态的精细结构。 TH免疫染色是在CLARITY处理（A 和 B）和标准（C 和 D）视网膜中进行的。Z 堆叠图像使用共焦（A 和 C）和荧光显微镜（B 和 D）拍摄。从每个图像中单个光学平面插入突出显示可能由轴突式过程形成的环状结构。箭头指示 DAC 索马塔，许多环状结构可见（示例由箭头指示），在 CLARITY 处理视网膜（A 和 B）中显示的树突和轴突状过程的密集丛中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4。改性CLARITY可提高细树突状结构和突触蛋白的3D分辨率。 在CLARITY处理的全山视网膜中进行了三次免疫染色，抗体针对TH、GluA2和PSD-95。从 z 堆叠共焦成像中重建了卷渲染，并以角度 X-Z 方向呈现。 答： 内核层和过程（黄色箭头）在解剖内部丛状层（红色）分层的TH标记DAC索马塔（箭头）。白色箭头表示向外视网膜延伸的离心过程。 B： 在内丛状层（绿色）上，GluA2 含 AMPA 受体的密集穿刺表达。箭头表示视网膜血管的自流。 C： 蓬克塔揭示由PSD-95标记在内部丛状层（蓝色）的突触后站点。箭头表示血管，明显由于使用小鼠单克隆抗体对抗PSD-95。 D： 覆盖图像显示 TH 标记的 DAC 进程与 GluA2 和 PSD-95 的表达方式重叠。卷视图的缩放以 20μm 的增量标记。 请单击此处查看此图的更大版本。
图5。在 DAC 上含有 GluA2 的 AMPA 受体的突触表达。 在 图 4 中显示的 TH、GluA2 和 PSD-95 的假定三重同位素化点以 3D 中选择并进行了调查。A1 表示 X-Z 方向 （A5） 中的 DAC 过程（红色）的一段。A2 和 A3 分别显示一个 GluA2 标点（绿色）和 PSD-95 点点（蓝色），方向相同。合并后的图像 （A4） 显示了 TH、GluA2 和 PSD-95（箭头）的三重共定位。B1-B4 在 Y-Z 方向 （B5） 中显示同一位置（箭头）。C1-C4 显示 X-Y 平面 （C5） 中同一点 （箭头） 的同一点 （箭头） 的同一位置化。三重同位素化在每个方向上都很明显。比例栏： 2μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
| 溶液 | 组成 | 笔记 |
| 0.1 M PBS | 137毫米纳克 | 将pH口调整为7.4 |
| 26.8百万千瓦时 | ||
| 10.1米纳2HPO4 | ||
| 17.6米KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% 丙烯酰胺 | 在冰上准备，在-20°C储存 |
| 0.25% VA-044 | ||
| 0.1 M PBS | ||
| 普普斯特 | 0.1% （v/v） 特里顿-X-100 | |
| 0.1 M PBS | ||
| 阻止解决方案 | 2% NDS 或 1% BSA | |
| 0.01% 纳恩3 | ||
| 普普斯特 | ||
| 0.1 M 磷酸盐缓冲区 | 11.93 g 纳2HPO4/升 | 将pH口调整为7.5 |
| 15.34 g 纳赫2PO4/升 | ||
| 德赫2O | ||
| 斯里姆斯 | 70% 索比妥 | 将pH调整为7.5与NAOH |
| 0.1% 补间-20 | ||
| 0.01% 纳恩3 | ||
| 0.02 M 磷酸盐缓冲区 | ||
表1。解决方案的组成。
| 抗体 | 伊赫克 | 主机 | 稀释 | 目录# | 供应商 | Ab 注册 ID | 目标 |
| 蓝色敏感蛋白 | +3 | 山羊多克隆 | 1:1000 | SC-14363 | 圣克鲁斯生物技术 | AB_2158332 | S 锥 |
| 锥逮捕 | +2 | 兔子多克隆 | 1:1000 | AB15282 | 埃姆德 · 米利波尔 | AB_1163387 | 球果 |
| 蛋白质激酶C阿尔法（PKC-α） | +3 | 兔子多克隆 | 1:1000 | SC-208 | 圣克鲁斯生物技术 | AB_2168668 | 罗德双极细胞 |
| 胶质纤维酸性蛋白质（GFAP） | +3 | 山羊多克隆 | 1:500 | SC-6170 | 圣克鲁斯生物技术 | AB_641021 | 星形细胞 |
| 酪氨酸羟基酶 （TH） | +3 | 绵羊多克隆 | 1:500 | AB1542 | 埃姆德 · 米利波尔 | AB_90755 | 多巴胺胺阿马克林细胞 |
| 酪氨酸羟基酶 （TH） | +2 | 兔子多克隆 | 1:500 | OPA1-04050 | 特莫菲舍尔 | AB_325653 | 多巴胺胺阿马克林细胞 |
| 胆碱乙酰转移酶 （CHAT） | +1 | 山羊多克隆 | 1:500 | AB144P | 埃姆德 · 米利波尔 | AB_2079751 | 星爆阿马格林细胞 |
| 具有多个拼接的RNA结合蛋白（RBPMS） | +1 | 几内亚猪多克隆 | 1:2000 | 荷兰银行1376 | 埃姆德 · 米利波尔 | AB_2687403 | 视网膜结膜细胞 |
| 格鲁阿2 | +3 | 兔子多克隆 | 1:500 | AB1768-I | 埃姆德 · 米利波尔 | AB_2247874 | Ca2+不可渗透的安帕受体 |
| 格鲁阿2 | +2 | 鼠标单克隆 | 1:250 | 马本1189 | 埃姆德 · 米利波尔 | AB_2737079 | Ca2+不可渗透的安帕受体 |
| 后突式密度蛋白 95 （PSD-95） | +3 | 鼠标单克隆 | 1:1000 | 75-028 | 神经马布 | AB_2877189 | 突触站点 |
| 磷-S6 （pS6） | 0 | 兔子多克隆 | 1:500 | 44-923G | 特莫菲舍尔 | AB_2533798 | 细胞活动标记 |
表2。 测试的主要抗体摘要。 IHC传说：+3=一致，高度特定的染色;+2=一贯良好的染色，最小的背景：+1=良好的染色，一些背景：0=与清晰度不兼容。
| 主机 | 目标物种 | 共轭 | 稀释 | 供应商 |
| 驴 | 反羊 | 亚历克萨·弗卢尔 568 | 1:500 | 英异基因 |
| 驴 | 反羊 | 亚历克萨·弗卢尔 594 | 1:500 | 英异基因 |
| 驴 | 反兔子 | 亚历克萨·弗卢尔 488 | 1:500 | 英异基因 |
| 驴 | 反兔子 | 亚历克萨·弗卢尔 594 | 1:500 | 英异基因 |
| 山羊 | 反兔子 | 亚历克萨·弗卢尔 647 | 1:500 | 英异基因 |
| 驴 | 反鼠标 | 亚历克萨·弗卢尔 488 | 1:500 | 英异基因 |
| 驴 | 反鼠标 | 亚历克萨·弗卢尔 647 | 1:500 | 英异基因 |
| 驴 | 反山羊 | 亚历克萨·弗卢尔 568 | 1:500 | 英异基因 |
| 驴 | 反山羊 | 亚历克萨·弗卢尔 594 | 1:500 | 英异基因 |
| 山羊 | 抗几内亚猪 | 亚历克萨·弗卢尔 488 | 1:500 | 英异基因 |
表3。二次抗体测试摘要。
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Discussion
修改全安装视网膜的清晰协议。
我们已经简化了CLARITY协议，以实现足够的聚合，而无需真空疏散或干燥室，如大多数以前的研究7，9，11所使用。聚合过程受到氧气的抑制，要求样品在协议的聚合步骤中从空气中分离。然而，我们发现，用油覆盖样品，而不是用氮气去气，从而充分隔离样品，使聚合在彻底冲洗后不会对协议的剩余部分产生不利影响，如先前记载的12。我们进一步简化协议与被动清除方法，以限制组织变黄的风险和损害组织结构与电泳清除11。被动清除通过温和的搅拌和升高的温度加速，允许在两天内完成组织清除。在此期间，实现了足够的去皮化，以产生光学透明组织，同时最大限度地减少细胞结构和免疫生化染色中不可或缺的蛋白质和其他生物分子的损失。
在全山制剂中，CLARITY 保留视网膜神经元和胶质细胞的蛋白质。
我们的结果表明，几乎所有的抗体测试工作在CLARITY处理视网膜。这些抗体标记光感受器、双极细胞、阿玛格林细胞、RGC 和胶质细胞。虽然我们无法测试每类视网膜神经元的亚型抗体，但我们的结果表明，CLARITY处理过的视网膜可用于视网膜中的大多数细胞标记物。虽然我们测试的大多数抗体也可以在非CLARITY处理视网膜中免疫视网膜神经元，但我们发现CLARITY允许足够的抗体渗透到视网膜的深层组织中，为视网膜中间层的污渍提供了良好的特异性。此外，我们发现，CLARITY 提高了视网膜厚度的光渗透率，减少了光散射，并允许高分辨率成像通过最深层。与非CLARITY标准全安装IHC13相比，这些因素有助于在CLARITY处理的全安装视网膜的染色和成像方面有所改进。减少的背景和改进的3D成像和体积渲染允许对视网膜厚度内所有层的细胞结构进行完整调查。
CLARITY 揭示了全坐骑视网膜中 DAC 的精细过程和突触结构。
我们的结果表明，DAC 的环状结构和离心过程在 CLARITY 处理中比在非 CLARITY 全安装视网膜中显示得更好。特别是，用CLARITY处理的组织进行免疫，即使使用标准荧光显微镜，也能够很好地解决这些精细结构，而无需共焦成像。鉴于 DAC 在视觉功能中的重要性，CLARITY 制备可用于调查 DAC 在正常视网膜中的结构以及疾病条件下的形态变化。
在用标准全山组织对PSD-95和GluA2进行免疫染色时，我们观察到视网膜深层中这些亚细胞结构几乎没有标记，表明抗体渗透不良。CLARITY 协议的应用允许在内视网膜层中对这些蛋白质进行明显的染色，表明抗体渗透到深层组织方面有所改善。我们的结果表明，CLARITY允许在全安装视网膜的DAT过程中检测突触蛋白，这通常观察到垂直切片制剂6。由于轴突状过程无法与垂直切片中的树突区区分开来，CLARITY 全安装视网膜提供了一个机会来确定来自其他神经元（如双极细胞和 ipRGCs）的突触输入是否发生在树突、轴突状过程中，还是同时发生在5、6中。由于 AMPA 受体和 PSD-95 蛋白质在整个 IPL 中广泛分布，这些蛋白质在 DAC 上的表达为用于识别其他视网膜神经元突触蛋白的 CLARITY 视网膜树立了一个很好的例子。
完整安装视网膜的 CLARITY 协议的考虑、限制和未来应用。
首先，CLARITY 处理的全安装视网膜的聚合和清除协议为组织准备过程增加了几天的时间。然而，这种方法仍然非常实用，因为澄清的视网膜可以储存在含酸钠的PBS中长达两周，而组织降解最少。第二，在清理过程中观察到组织有一些扩展，如CLARITY7，11以前的应用所记载的。然而，我们发现视网膜在与折射指数匹配溶液等价后恢复到大约原始大小。组织体积的潜在微小变化可能不会导致细胞或细胞下结构7，11的显著失真。第三，当成像较厚的大脑样本时，显微镜目标通常直接浸入安装介质中，以便通过组织12使显微镜镜头的折射指数完全匹配。对于更薄的样品，如网膜，我们使用盖片安装，使样品更平坦，甚至更成像。折射通过盖子滑对成像的影响似乎微乎其微。第四，我们的一些图像显示非特定的血管染色，因为我们没有香水整个动物与内脏灌注（建议用于避免非特定的染色）之前，诱导眼睛。最后，目前适合小鼠的协议可用于其他物种的视网膜。特别是，狗、猪、马和灵长类动物等大型动物的视网膜比老鼠厚得多。这种CLARITY协议可以使这些动物的视网膜在去除脂质后更加透明，并保留视网膜神经元及其蛋白质的精细结构，用于免疫染色。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢叶冰冰、内森·斯皮克斯和刘浩的技术支持。这项工作得到了国家健康补助金研究所EY022640（D.-Q.Z.）和奥克兰大学教务长本科生研究奖（E.J.A.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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