Summary
Aquí presentamos un protocolo para adaptar el método de la CLARIDAD de los tejidos cerebrales para las retinas del entero-montaje para mejorar la calidad de la coloración immunohistochemical estándar y de la proyección de imagen de alta resolución de neuronas retinianas y de sus estructuras subcelulares.
Abstract
El método de delipidación de hidrogel tisular (CLARITY), desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth, ha sido modificado y ampliamente utilizado para la inmunotensación y la obtención de imágenes de muestras cerebrales gruesas. Sin embargo, esta tecnología avanzada aún no se ha utilizado para retinas de montaje completo. Aunque la retina es parcialmente transparente, su grosor de aproximadamente 200 μm (en ratones) todavía limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como la reducción de la penetración de la luz para imágenes de alta resolución. Aquí, adaptamos el método CLARITY para retinas de ratón de montaje completo polimerizándolas con un monómero de acrilamida para formar un hidrogel nanoporoso y luego despejandolas en sulfato de dodecil sódico para minimizar la pérdida de proteínas y evitar daños tisulares. las retinas CLARIDAD-procesadas immunostained con los anticuerpos para las neuronas retinianas, las células glial, y las proteínas sinápticas, montadas en una solución que emparejaba del índice de refracción, e imagendas. Nuestros datos demuestran que la CLARIDAD puede mejorar la calidad de la coloración e proyección de imagen immunohistochemical estándar para las neuronas retinianas y las células glial en la preparación del entero-montaje. Por ejemplo, la resolución 3D de las estructuras ariíticas y axones finos de las células dopaminérgicas de amacrina fueron mejoradas mucho por CLARITY. En comparación con las retinas de montaje completo no procesadas, CLARITY puede revelar inmunotensión de proteínas sinápticas como la proteína de densidad postsináptica 95. Nuestros resultados muestran que la CLARIDAD hace la retina más ópticamente transparente después de la eliminación de lípidos y preserva las estructuras finas de las neuronas de la retina y sus proteínas, que se pueden utilizar rutinariamente para la obtención de imágenes de alta resolución de las neuronas de la retina y sus estructuras subcelulares en la preparación de montaje completo.
Introduction
La retina de los vertebrados es quizás la parte más accesible del sistema nervioso central (SNC), y sirve como un excelente modelo para estudiar el desarrollo, la estructura y la función del cerebro. Cinco clases de neuronas en la retina se distribuyen en tres capas nucleares separadas por dos capas plexiformes. La capa nuclear externa (ONL) consiste en fotorreceptores clásicos (varillas y conos) que convierten la luz en señales eléctricas. Las señales eléctricas son procesadas por las neuronas en la capa nuclear interna (INL), incluyendo las células bipolares, horizontales y amacrinas, y luego transmitidas a las células ganglionares de la retina (CRG) en la capa de células ganglionares (GCL). Los CRG son las neuronas de salida de la retina, con los axones que se proyectan hacia el cerebro para contribuir a la función visual formadora y no formadora de imágenes. Además, tres tipos de células gliales (células de Muller, astroglia y microglía) proporcionan nutrientes a las neuronas y protegen a las neuronas de los cambios dañinos en su entorno extracelular.
Una subpoblación especializada de células amacrinas produce y libera dopamina, un importante neuromodulador en el SNC, reconfigurando los circuitos neuronales de la retina durante la adaptación a la luz1,2. Las células dopaminérgicas del amacrine (DAC) tienen una característica única de perfiles morfológicos. Sus somatas se localizan en el INL proximal con dendritas que se ramifican en la parte más distal de la capa plexiforme interna (IPL). Axón-como los procesos de DAC son unmyelinated, delgado y largo, escasamente ramificado, y varicosidades del oso (los sitios del lanzamiento de la dopamina). Forman un plexo denso con dendritas en el IPL, incluyendo estructuras en forma de anillo alrededor de la somata de las células amacrinas AII. Los axones también corren a través del INL hacia el OPL, formando una vía centrífuga a través de la retina3. Hemos demostrado que dac procesa receptores expresos en respuesta a la liberación de glutamato de las neuronas presinápticas, incluyendo las células bipolares y las células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs)4,5,6. Sin embargo, no está claro si los receptores de glutamato se expresan en los axones, dendritas o ambos, ya que están cortados en secciones verticales de la retina y no se pueden distinguir entre sí5,6. Immunostaining necesita ser realizado en retinas de montaje completo para revelar la ramificación tridimensional de DAC y la presencia de receptores del glutamato en compartimientos subcelulares. Aunque la retina es relativamente transparente, el grosor de una retina de montaje completo de ratón es de aproximadamente 200 μm, lo que limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como reduce la penetración de la luz para imágenes de alta resolución debido a la dispersión de la luz del tejido. Para superar estas limitaciones, adaptamos el método de delipidación de hidrogel tisular compatible con inmunosuficiente (CLARITY) desarrollado recientemente para secciones cerebrales gruesas a retinas de ratón de montaje completo7.
El método CLARITY fue desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth para inmunosupertenimiento e imágenes de muestras cerebrales gruesas7. Utiliza un detergente fuerte, sulfato de dodecil sódico (SDS) y electroforesis para eliminar los componentes lipídicos (que causan la dispersión de la luz del tejido), dejando las proteínas y los ácidos nucleicos en su lugar. Los lípidos eliminados se reemplazan con un andamio transparente compuesto de monómeros de hidrogel como la acrilamida para apoyar la estructura proteica restante. El tejido despejado se puede etiquetar a través de inmunohistoquímica y tomar imágenes con una profundidad de penetración de luz sustancialmente mayor a través del tejido (hasta varios milímetros por debajo de la superficie del tejido). Desde entonces, el método CLARITY ha sido optimizado y simplificado por varios grupos de investigación8,9,10. Un protocolo CLARITY modificado utiliza una técnica pasiva de limpieza para evitar el posible daño tisular producido por la electroforesis para limpiar todo el cerebro y otros órganos intactos11. Sin embargo, este método todavía no se ha aplicado a las retinas de montaje completo. Aquí, adaptamos la técnica pasiva de la CLARIDAD para las retinas del entero-montaje para hacerlas más transparentes para immunohistochemistry y la proyección de imagen. Encontramos que preservaron a una mayoría de las proteínas retinianas probadas durante este proceso para immunohistochemistry. Utilizando la solución de coincidencia de índice de refracción, pudimos obtener imágenes de neuronas de la retina a través de los aproximadamente 200 μm de espesor de la ONL a la GCL en retinas de montaje completo.
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Protocol
El cuidado del ratón y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para animales de laboratorio y fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Oakland (protocolo no. 18071).
Nota: Los nombres de las soluciones y sus composiciones se enumeran en la tabla 1.
1. Preparación de tejidos
- Eutanasiar el ratón con una sobredosis de CO2,seguida de dislocación cervical.
- Enuclear los ojos con fórceps curvos y transferirlos a una pequeña placa de Petri con 0,1 M PBS (Tabla 1). Bajo un microscopio de disección, haga un pequeño agujero a lo largo de la unión córnea-esclerótica con una aguja. Transferencia al paraformadehído al 4% (PFA) durante 1 hora.
- Transferir el ojo de nuevo a un plato con PBS. Bajo un microscopio de disección, use tijeras de disección para cortar todo el camino alrededor de la unión córnea-esclerótica. Retire la córnea y el cristalino. Corte en la base del nervio óptico y desprenda cuidadosamente la esclerótica con las autopsas para aislar la retina.
- Haga cuatro pequeños cortes uniformemente alrededor de la retina y use un cepillo de punta fina sumergido en PBS para ponerlo plano (lado GCL hacia abajo) en forma de trébol en un pequeño corte cuadrado de papel de filtro de nitrocelulosa para estabilizar la retina.
- Transfiera la retina usando fórceps para sostener la esquina del papel de nitrocelulosa (sin tocar la retina montada) y colóquela en una placa de 48 pocillos con 4% de PFA durante 1 hora.
- Transfiera el papel de filtro y la retina a un pozo con PBS y lave (3x durante 5 min cada uno).
- Transferir a A4P0 (Tabla 1) e incubar durante la noche a 4 °C con agitación suave.
- Pipetee el aceite vegetal en el pozo para cubrir completamente la solución A4P0. Incubar en un baño de agua a 40 °C durante 3 horas sin agitar.
- Lave (3x durante 5 minutos cada uno) en PBS, asegurándose de que todo el aceite se haya enjuagado. Si es necesario, use una pipeta para retirar cuidadosamente el aceite restante de la parte superior del pozo antes del último enjuague.
- Incubar en SDS al 10% a 40 °C durante dos días con temblores suaves. Reemplace SDS con una solución nueva el segundo día.
- Transferir el papel de filtro y la retina a PBS con Triton-X-100 (PBST, Tabla 1)y lavar (5x para 1,5 h cada uno).
- Conservar a 4 °C en PBST con azida de sodio al 0,01% (NaN3)o pasar directamente a inmunotensoración.
2. Inmunosutención y correspondencia del índice de refracción
- Retire la retina del papel de filtro desprendiéndolo suavemente con un cepillo de punta fina en PBST.
- Incubar la retina en anticuerpo primario(Tabla 2)diluido en solución bloqueador(Tabla 1)durante 2 días a 40 °C con un suave temblor.
- Lavar (5x, 1,5 h cada uno) en PBST.
- Incubar con los anticuerpos secundarios apropiados(Tabla 3)diluido en solución de bloqueo durante 2 días a 40 °C con agitación suave y proteger de la luz durante el resto del procedimiento.
- Lavar (5x, 1,5 h cada uno) en tampón de fosfato de 0,02 M (ver Tabla 1).
- Incubar en solución de correspondencia de índice de refracción a base de sorbitol (sRIMS, ver Tabla 1)a 40 °C durante la noche con agitación suave.
3. Montaje
- Delinee una cubierta de vidrio de 18 mm x 18 mm x 1,5 mm con un marcador permanente de punta fina para marcar un límite cuadrado en la parte posterior de un portaobjetos de microscopio de vidrio.
- Voltee la diapositiva y use una jeringa para trazar el límite con una delgada línea de grasa de silicona en la parte frontal de la diapositiva, dejando un pequeño espacio en una esquina para que escape el exceso de solución de montaje.
- Transfiera la retina al centro del área acotada y arregle con un cepillo de punta fina para que quede plano con el lado del fotorreceptor contra el portaobjetos de vidrio.
- Pipetee aproximadamente 60 μL de sRIMS para que cubra la retina aplanada y se extienda hasta una esquina del recinto, cuidando que la retina se mantenga plana y en su lugar.
- Aplique el cubrebocas a partir de la esquina con el sRIMS y baje lentamente hasta que toque la grasa por todos los lados, evitando la formación de burbujas de aire.
- Coloque una pila de 3 cubrebocas a cada lado de la retina montada como espaciador. Utilice el borde largo de otra diapositiva para presionar hacia abajo la cubierta para que el montaje sea plano y uniforme.
- Guarde los portaobjetos planos a 4 °C hasta la toma de imágenes.
4. Imágenes
- Muestras de imagen en un microscopio de fluorescencia convencional o en un microscopio confocal(Tabla de materiales). Comience colocando el portaobjetos en la etapa del microscopio y localizando la muestra.
NOTA: Si se está utilizando un microscopio objetivo invertido, coloque la corredera boca abajo en el escenario, primero asegurándose de que las áreas expuestas de la diapositiva estén despejadas de toda la grasa de silicona y la solución de montaje. - Para obtener imágenes apiladas en z de muestras co-etiquetadas, primero concéntrese en la señal en cada canal individualmente y establezca el tiempo de exposición o la velocidad de escaneo, para microscopios de fluorescencia o confocales, respectivamente.
- Establezca el rango para la pila z estableciendo manualmente el plano focal en la parte superior e inferior del rango deseado, o estableciendo el punto medio y luego especificando un rango alrededor del punto medio.
- Ajuste el tamaño del paso o el número de sectores como desee.
- Capturar la imagen y guardar el archivo original, así como exportarlo como un archivo TIFF u otro formato deseado.
5. Análisis de imágenes
- Utilice el software de análisis de imágenes de elección(Tabla de materiales)para ajustar el brillo y el contraste en cada canal hasta que se logre una claridad óptima tanto en las imágenes individuales como en la representación en 3 dimensiones de la pila z.
NOTA: Si el tamaño de paso seleccionado es lo suficientemente pequeño, también se puede realizar la deconvolución 3D para mejorar la señal.
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Representative Results
Las retinas procesadas clarity modificadas son tejido ópticamente transparente.
Para formular un método de limpieza de tejido que es compatible con aplicaciones inmunohistoquímicas en la retina, mientras que proporciona una delipidación adecuada y la retención de la integridad estructural de las proteínas celulares, se adaptó el método de claro de tejido CLARITY para todo el monte de las retinas de ratón. Pudimos simplificar el protocolo y modificarlo para retinas de montaje completo (ver Protocolo). Después de completar la hibridación tisular, el despeje y la correspondencia del índice de refracción, las retinas procesadas con este protocolo CLARITY modificado mostraron una transparencia óptica casi completa en todo el grosor de la retina(Figura 1A)en comparación con las retinas de control no procesadas(Figura 1B). Este resultado indica que esta modificación del protocolo de la CLARIDAD proporciona el tejido suficientemente despejado de la retina del entero-montaje.
Proyección de imagen 3D mejorada de neuronas en retinas procesadas CLARIDAD modificada.
Para evaluar la calidad y practicidad de la tinción inmunohistoquímica proporcionada por este método CLARITY modificado, se tiñeron las retinas procesadas CLARITY con varios anticuerpos primarios(Tabla 2). Estos anticuerpos marcan cada tipo de célula principal en la retina: fotorreceptores de cono, células bipolares de varilla, células amacrinas, RGCs y células gliales, así como anticuerpos contra proteínas sinápticas subcelulares. A excepción del marcador de actividad celular fosfo-S6 (pS6), todos los anticuerpos probados demostraron ser compatibles con CLARITY. Los ejemplos típicos se ilustran en la figura 2. Realizamos el etiquetado triple con los anticuerpos contra el arrestin del cono, la hidroxilasa de la tirosina (TH), y la proteína ARN-obligatoria con el empalme múltiple (RBPMS). Tomamos una serie de z-apilar imágenes de microscopía confocal de la ONL a la GCL. Las imágenes individuales mostraron la arrestina de conos etiquetados en la ONL(Figura 2A),los DAC marcados con TH en la INL(Figura 2B)y los RGCs marcados con RBPMS en el GCL(Figura 2C). Una imagen superpuesta reveló la ubicación relativa de estas neuronas a lo largo de todo el grosor de la retina(Figura 2D). Estos resultados sugieren que la CLARIDAD puede mejorar la calidad de muchas coloraciones immunohistochemical estándar y revelar claramente la estructura 3D de neuronas a través del grueso entero de la retina en preparaciones del entero-montaje.
La CLARIDAD modificada proporciona una resolución 3D mejorada de los procesos finos de las neuronas de la retina y las proteínas sinápticas.
Analizamos además la tinción de TH en retinas de montaje completo procesadas por CLARITY(Figuras 3A,B)y la comparamos con las imágenes obtenidas de la preparación estándar de montaje completo(Figuras 3C,D). Las imágenes confocales muestran que las dendritas y los procesos similares a axones de los DAC se revelaron mucho más claramente en una retina procesada por CLARITY(Figura 3A)que en una retina estándar(Figura 3C). En particular, los procesos similares a los axones de los DAC exhibieron estructuras más completas en forma de anillo en una retina CLARITY (ver un inserto en la Figura 3A)que en una retina estándar (ver un inserto en la Figura 3C). Cabe destacar que las estructuras en forma de anillo de una retina CLARITY tomadas mediante microscopía de fluorescencia(Figura 3B)fueron casi idénticas a las observadas mediante confocal(Figura 3A). Además, los procesos similares a los axones también corrieron hacia la retina externa, que se observó en imágenes orientadas a X-Z (Figura 4A). Estos datos sugieren que la CLARIDAD se pueda utilizar para identificar axón-como procesos de DAC en retinas del entero-montaje incluso con el uso de la microscopia convencional de la fluorescencia.
Cuando la subunidad GluA2 del AMPA-receptor y la proteína postsináptica 95 de la densidad (PSD-95) fueron examinadas en retinas estándar del entero-montaje, ningunos de ellos fueron detectados, probablemente debido a la penetración pobre de anticuerpos contra estas proteínas sinápticas en la retina profunda. Para determinar si las retinas procesadas por CLARITY permiten que estos anticuerpos inmuten proteínas sinápticas, triplicamos el TH etiquetado con la subunidad GluA2 y PSD-95. Immunostaining contra GluA2 y PSD-95 mostró distintos puncta revelando receptores ampa que contienen GluA2 individuales(Figura 4B)y sitios postsinápticos putativos(Figura 4C),respectivamente. Una imagen de superposición mostró algunos signos aparentes en los procesos DAC (Figura 4D). Se imaginó un punto de colocalización putativa con las tres manchas y se presentó en vistas 3D (Figura 5). Desde las tres vistas, TH colocalized claramente con GluA2 y PSD-95 (Figura 5 A-C). Estos resultados de la perspectiva 3D de las retinas de montaje completo validan nuestros informes anteriores de la expresión sináptica de los receptores AMPA que contienen GluA2 en procesos DAC en rebanadas retinianas verticales5,6.
Figura 1. CLARITY proporciona tejido ópticamente transparente. Las retinas de ratón de montaje completo se procesaron con el método CLARITY modificado (ver Protocolo) y toda la retina se fotoizó con un microscopio de disección, superpuesta en una cuadrícula cuadrada de 0,67 cm para mostrar la escala. A: Retina de montaje completo procesada por CLARITY, con líneas de cuadrícula claramente visibles a través del tejido transparente. Las flechas delinean la colocación de la retina. B: Retina de control no procesada por CLARITY, fijada en PFA durante 1 h e incubada en PBS. Las líneas de cuadrícula se oscurecen por la opacidad relativa del tejido. Barra de escala: aproximadamente 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Mejora de las imágenes 3D de las neuronas a través del grosor de la retina en las retinas procesadas por CLARITY. Las retinas de la CLARIDAD del Entero-montaje immunostained con los anticuerpos contra arrestin del cono, el TH, y RBPMS. Image representa una representación de volumen 3D de una imagen confocal apilada en z, vista en una orientación X-Z. A: Fotorreceptores de cono (flecha) etiquetados por arrestin de cono (azul). Una ligera mancha es visible en la retina interna (puntas de flecha), probablemente debido a la tinción de fondo. B: Dac soma y dendritas (flecha) etiquetados por TH (rojo). Las puntas de flecha indican vasos sanguíneos retinianos en la retina interna, visibles debido a la inmunotensación multietiqueta. C: RGC somata (flecha) etiquetado por RBPMS (verde). Las puntas de flecha indican vasos sanguíneos de la retina visibles debido a la autofluorescencia y la tinción inespecífico de los vasos sanguíneos. D: Imagen combinada de la tinción triple etiquetada, revelando la colocación relativa de estas neuronas a través del grosor de la retina, con fotorreceptores de cono ubicados en la capa nuclear externa, DAC en la capa nuclear interna y RGCs en la capa de células ganglionares. La escala de la vista de volumen se marca en incrementos de 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. CLARITY revela estructuras finas de morfología DAC. El TH immunostaining fue realizado en retinas CLARIDAD-procesadas(A y B)y estándar(C y D). las imágenes Z-apiladas fueron tomadas usando la microscopia confocal(A y C)y de la fluorescencia(B y D). Un inserto de un solo plano óptico en cada imagen resalta estructuras en forma de anillo presumiblemente formadas por procesos similares a axones. Las puntas de flecha indican somata DAC, y muchas estructuras en forma de anillo son visibles (los ejemplos son indicados por flechas) en el denso plexo de las dendritas y los procesos similares a los axones revelados en las retinas procesadas por CLARITY(A y B). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4. La CLARIDAD modificada proporciona una resolución 3D mejorada de estructuras dendríticas finas y proteínas sinápticas. El immunostaining triple fue realizado en retinas CLARIDAD-procesadas del entero-montaje con los anticuerpos contra TH, GluA2, y PSD-95. Una representación del volumen fue reconstruida de proyección de imagen confocal z-apilada y presentada en una orientación angulada de X-Z. A: Somata DAC etiquetada con TH (puntas de flecha) en la capa nuclear interna y procesos (flechas amarillas) estratificando en la capa plexiforme interna distal (rojo). Las flechas blancas indican procesos centrífugos que se extienden hacia la retina externa. B: Expresión punteada densa de los receptores AMPA que contienen GluA2 a través de la capa plexiforme interna (verde). Arrow indica autofluorescencia de un vaso sanguíneo de la retina. C: Puncta revelando sitios post-sinápticos etiquetados por PSD-95 en la capa plexiforme interna (azul). Las flechas indican vasos sanguíneos, aparentes debido al uso de un anticuerpo monoclonal de ratón contra PSD-95. D: Imagen superpuesta que demuestra la superposición de los procesos DAC etiquetados como TH con la expresión GluA2 y PSD-95. La escala de la vista de volumen se marca en incrementos de 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Expresión sináptica de receptores AMPA que contienen GluA2 en DAC. Se seleccionó e investigó un punto de colocalización triple putativa de TH, GluA2 y PSD-95 mostrado en la Figura 4 e investigado en 3D. A1 representa un segmento de un proceso DAC (rojo) en la orientación X-Z (A5). A2 y A3 muestran un solo punctum GluA2 (verde) y PSD-95 punctum (azul), respectivamente, en la misma orientación. La imagen combinada (A4) demuestra la colocalización triple de TH, GluA2 y PSD-95 (flecha). B1-B4 muestran el mismo punto de colocalización (flecha) en una orientación Y-Z (B5). C1-C4 muestra la colocalización del mismo punto (flecha) en el plano X-Y (C5). La colocalización triple es claramente evidente en cada orientación. Barra de escala: 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| solución | composición | Notas |
| 0,1 M PBS | NaCl de 137 mM | Ajustar el pH a 7,4 |
| KCl de 26,8 mM | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | Acrilamida al 4% | Preparar sobre hielo, alícuota, y conservar a -20 ºC |
| 0,25% VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | 0,1% (v/v) Tritón-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Solución de bloqueo | 2% NDS o 1% BSA | |
| 0,01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| 0,1 M Tampón de fosfato | 11,93 g Na2HPO4/litro | Ajustar el pH a 7.5 |
| 15,34 g NaH2PO4/litro | ||
| ddH2O | ||
| sRIMS | 70% sorbitol | Ajuste el pH a 7,5 con NaOH |
| 0,1% interpolación-20 | ||
| 0,01% NaN3 | ||
| Tampón de fosfato de 0,02 M | ||
Tabla 1. Composición de soluciones.
| anticuerpo | IHC | anfitrión | dilución | catálogo # | proveedor | Id. de registro ab | blanco |
| Opsina sensible al azul | +3 | Policlones de cabra | 1:1000 | SC-14363 | Biotecnología de Santa Cruz | AB_2158332 | S-cono |
| Arrestin del cono | +2 | Policlones de conejo | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | cono |
| Proteína quinasa C alfa (PKC-α) | +3 | Policlones de conejo | 1:1000 | SC-208 | Biotecnología de Santa Cruz | AB_2168668 | Célula bipolar de la barra |
| Proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) | +3 | Policlones de cabra | 1:500 | SC-6170 | Biotecnología de Santa Cruz | AB_641021 | astrocito |
| Tirosina hidroxilasa (TH) | +3 | Polyclonal de las ovejas | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Célula dopaminérgica de la amacrina |
| Tirosina hidroxilasa (TH) | +2 | Policlones de conejo | 1:500 | OPA1-04050 | ThermoFisher | AB_325653 | Célula dopaminérgica de la amacrina |
| Acetiltransferasa de la colina (ChAT) | +1 | Policlones de cabra | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Célula amacrina de Starburst |
| Proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS) | +1 | Conejillo de Indias policloncial | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Célula ganglionar retiniana |
| GluA2 | +3 | Policlones de conejo | 1:500 | AB1768-I | EMD Millipore | AB_2247874 | Receptor AMPA ca2+-impermeable |
| GluA2 | +2 | Ratón monoclonal | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Receptor AMPA ca2+-impermeable |
| Proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) | +3 | Ratón monoclonal | 1:1000 | 75-028 | NeuroMab | AB_2877189 | Sitios sinápticos |
| Fosfo-S6 (pS6) | 0 | Policlones de conejo | 1:500 | 44-923G | ThermoFisher | AB_2533798 | Marcador de actividad de celda |
Tabla 2. Resumen de anticuerpos primarios probados. Leyenda de IHC: +3 = tinción consistente y altamente específica; +2 = tinción consistentemente buena, fondo mínimo; +1 = buena tinción, algo de fondo; 0 = incompatible con CLARITY.
| anfitrión | Especies objetivo | conjugar | dilución | proveedor |
| burro | Anti-ovejas | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-ovejas | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-conejo | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-conejo | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| cabra | Anti-conejo | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-ratón | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-ratón | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-cabra | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-cabra | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| cabra | Conejillo anti-conejillo de Indias | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
Tabla 3. Resumen de anticuerpos secundarios ensayados.
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Discussion
Modificación del protocolo CLARITY para las retinas de montaje completo.
Hemos simplificado el protocolo CLARITY para lograr una polimerización adecuada sin necesidad de una cámara de evacuación o desecación al vacío, como se utiliza en la mayoría de los estudios previos7,9,11. El proceso de polimerización es inhibido por el oxígeno, requiriendo que la muestra sea aislada del aire durante la etapa de polimerización del protocolo. Sin embargo, en lugar de desgasificar con nitrógeno, encontramos que cubrir la muestra con aceite aisló suficientemente la muestra como para permitir la polimerización sin afectar negativamente al resto del protocolo después de un enjuague exhaustivo, como se documentópreviamente 12. Además, simplificamos el protocolo con un método de limpieza pasiva para limitar el riesgo de pardeamiento tisular y daño a la estructura tisular asociada con el aclaramiento electroforético11. El claro pasivo se acelera por agitación suave y temperatura elevada, lo que permite el despeje completo del tejido en solo dos días. Durante este período de tiempo, se logra una delipidación suficiente para dar lugar a tejido ópticamente transparente al tiempo que se minimiza la pérdida de proteínas y otras biomoléculas integrales a la estructura celular y la tinción inmunohistoquímica.
CLARITY conserva las proteínas de las neuronas de la retina y las células gliales en preparaciones de montaje completo.
Nuestros resultados muestran que casi todos los anticuerpos probados funcionan en retinas procesadas CLARITY. Estos anticuerpos marcan fotorreceptores, células bipolares, células amacrinas, CRG y células gliales. Aunque no pudimos probar los anticuerpos para los subtipos de cada clase de neuronas retinianas, nuestros resultados implican que las retinas procesadas CLARIDAD se pueden utilizar para la mayoría de marcadores celulares en la retina. Aunque la mayoría de los anticuerpos que probamos también pueden immunostain neuronas retinianas en retinas procesadas no-CLARIDAD, encontramos que la CLARIDAD permitió la penetración adecuada del anticuerpo en el tejido profundo de la retina, proporcionando buena especificidad de la coloración en la capa media de la retina. Además, encontramos que CLARITY mejoró la penetración de la luz en todo el grosor de la retina, reduciendo la dispersión de la luz y permitiendo imágenes de alta resolución incluso a través de las capas más profundas. Estos factores contribuyen a una mejora en la coloración y la proyección de imagen en las retinas de montaje entero CLARITY-procesadas comparadas al conjunto-montaje estándar no-CLARIDAD IHC13. El fondo reducido y las representaciones mejoradas de imágenes y volumen en 3D permiten una investigación completa de las estructuras celulares en todas las capas a través del grosor de la retina.
CLARITY revela procesos finos y estructura sináptica de DAC en retinas de montaje completo.
Nuestros resultados demuestran que las estructuras en forma de anillo y los procesos centrífugos de dacs se revelan en claridad-procesado mejor que en no-CLARIDAD todo-monte retinas. Particularmente, immunostaining con el tejido CLARIDAD-procesado permite la buena resolución de estas estructuras finas incluso con microscopia estándar de la fluorescencia sin la necesidad de la proyección de imagen confocal. Dada la importancia de los DAC en la función visual, la preparación clarity se puede utilizar para investigar las estructuras de los DAC en retinas normales y los cambios morfológicos en condiciones enfermas.
Sobre immunostaining para PSD-95 y GluA2 con el tejido estándar del wholemount, observamos poco a ningún etiquetado de estas estructuras subcelulares en las capas profundas de la retina, indicando la penetración pobre del anticuerpo. La aplicación del protocolo CLARITY permite una tinción distinta de estas proteínas en las capas retinianas internas, lo que indica una mejor penetración de anticuerpos en el tejido profundo. Nuestros resultados muestran que CLARITY permite la detección de proteínas sinápticas en procesos DAC en retinas de montaje completo, lo que normalmente se observa en preparaciones de rodajas verticales6. Dado que los procesos similares a los axones no se pueden distinguir de las dendritas en rebanadas verticales, las retinas de montaje completo CLARITY brindan la oportunidad de determinar si las entradas sinápticas a los DAC de otras neuronas como las células bipolares y las ipRGCs ocurren en dendritas, procesos similares a los axones o ambos5,6. Dado que los receptores AMPA y las proteínas PSD-95 están ampliamente distribuidos a lo largo de la IPL, la expresión de estas proteínas en los DAC estableció un excelente ejemplo para que las retinas CLARITY se utilicen para la identificación de proteínas sinápticas en otras neuronas de la retina.
Consideraciones, limitaciones, y usos futuros del protocolo de la CLARIDAD para las retinas del entero-montaje.
En primer lugar, los protocolos de polimerización y limpieza para retinas de montaje completo procesadas por CLARITY agregan varios días al proceso de preparación de tejidos. Sin embargo, el método todavía se hace altamente práctico por el hecho de que las retinas clarificadas se pueden almacenar en PBS azida-que contiene el sodio por hasta dos semanas con la degradación mínima del tejido. En segundo lugar, se observó cierta expansión del tejido a lo largo del proceso de limpieza como se documentó en aplicaciones anteriores de CLARITY7,11. Sin embargo, encontramos que la retina volvió a aproximadamente tamaño original sobre el equilibrio con la solución que emparejaba del índice de refracción. Los posibles cambios menores en el volumen tisular pueden no causar una distorsión significativa de la estructura celular o subcelular7,11. En tercer lugar, cuando se obtienen imágenes de muestras cerebrales más gruesas, el objetivo del microscopio a menudo se sumerge directamente en el medio de montaje para permitir la coincidencia completa del índice de refracción desde la lente del microscopio a través del tejido12. Con muestras más delgadas, como la retina, utilizamos cubrebocas para el montaje para hacer las muestras más planas y más uniformes para la obtención de imágenes. Los efectos de la refracción a través del cubrebocas aparecen ser mínimos en proyección de imagen. En cuarto lugar, algunas de nuestras imágenes muestran tinción de vasos sanguíneos inespecígena porque no perfundimos a todo el animal con perfusión intracardiaca (sugerida para evitar manchas inespecígenas) antes de enuclar los ojos. Por último, el protocolo actual adaptado para ratones se puede utilizar para retinas de otras especies. En particular, las retinas de animales grandes como perros, cerdos, caballos y primates son mucho más gruesas que las de los ratones. Este protocolo CLARITY podría hacer que las retinas de estos animales sean más transparentes ópticamente después de la eliminación de lípidos y preservar las estructuras finas de las neuronas de la retina y sus proteínas para la inmunotentención.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Bing Ye, Nathan Spix y Hao Liu por su soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Becas de Salud EY022640 (D.-Q.Z.) y oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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