Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para adaptar el método de la CLARIDAD de los tejidos cerebrales para las retinas del entero-montaje para mejorar la calidad de la coloración immunohistochemical estándar y de la proyección de imagen de alta resolución de neuronas retinianas y de sus estructuras subcelulares.

Resumen

El método de delipidación de hidrogel tisular (CLARITY), desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth, ha sido modificado y ampliamente utilizado para la inmunotensación y la obtención de imágenes de muestras cerebrales gruesas. Sin embargo, esta tecnología avanzada aún no se ha utilizado para retinas de montaje completo. Aunque la retina es parcialmente transparente, su grosor de aproximadamente 200 μm (en ratones) todavía limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como la reducción de la penetración de la luz para imágenes de alta resolución. Aquí, adaptamos el método CLARITY para retinas de ratón de montaje completo polimerizándolas con un monómero de acrilamida para formar un hidrogel nanoporoso y luego despejandolas en sulfato de dodecil sódico para minimizar la pérdida de proteínas y evitar daños tisulares. las retinas CLARIDAD-procesadas immunostained con los anticuerpos para las neuronas retinianas, las células glial, y las proteínas sinápticas, montadas en una solución que emparejaba del índice de refracción, e imagendas. Nuestros datos demuestran que la CLARIDAD puede mejorar la calidad de la coloración e proyección de imagen immunohistochemical estándar para las neuronas retinianas y las células glial en la preparación del entero-montaje. Por ejemplo, la resolución 3D de las estructuras ariíticas y axones finos de las células dopaminérgicas de amacrina fueron mejoradas mucho por CLARITY. En comparación con las retinas de montaje completo no procesadas, CLARITY puede revelar inmunotensión de proteínas sinápticas como la proteína de densidad postsináptica 95. Nuestros resultados muestran que la CLARIDAD hace la retina más ópticamente transparente después de la eliminación de lípidos y preserva las estructuras finas de las neuronas de la retina y sus proteínas, que se pueden utilizar rutinariamente para la obtención de imágenes de alta resolución de las neuronas de la retina y sus estructuras subcelulares en la preparación de montaje completo.

Introducción

La retina de los vertebrados es quizás la parte más accesible del sistema nervioso central (SNC), y sirve como un excelente modelo para estudiar el desarrollo, la estructura y la función del cerebro. Cinco clases de neuronas en la retina se distribuyen en tres capas nucleares separadas por dos capas plexiformes. La capa nuclear externa (ONL) consiste en fotorreceptores clásicos (varillas y conos) que convierten la luz en señales eléctricas. Las señales eléctricas son procesadas por las neuronas en la capa nuclear interna (INL), incluyendo las células bipolares, horizontales y amacrinas, y luego transmitidas a las células ganglionares de la retina (CRG) en la capa de c....

Protocolo

El cuidado del ratón y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para animales de laboratorio y fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Oakland (protocolo no. 18071).

Nota: Los nombres de las soluciones y sus composiciones se enumeran en la tabla 1.

1. Preparación de tejidos

1. Eutanasiar el ratón con una sobredosis de CO_2,seguida de dislocación cervical.
2. Enuclear los ojos con fórceps curvos y transferirlos a una pequeña placa....

Resultados

Las retinas procesadas clarity modificadas son tejido ópticamente transparente.
Para formular un método de limpieza de tejido que es compatible con aplicaciones inmunohistoquímicas en la retina, mientras que proporciona una delipidación adecuada y la retención de la integridad estructural de las proteínas celulares, se adaptó el método de claro de tejido CLARITY para todo el monte de las retinas de ratón. Pudimos simplificar el protocolo y modificarlo para retinas de montaje completo (ver Protocolo). .......

Discusión

Modificación del protocolo CLARITY para las retinas de montaje completo.
Hemos simplificado el protocolo CLARITY para lograr una polimerización adecuada sin necesidad de una cámara de evacuación o desecación al vacío, como se utiliza en la mayoría de los estudios previos^7,9,11. El proceso de polimerización es inhibido por el oxígeno, requiriendo que la muestra sea aislada del aire durante la etapa de polimeri.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Paraformaldehído al 16%	Microscopía electrónica Sciences	15710	Fijador
Acrilamida	Fisher Biotech	BP170	Monómero de hidrogel
Axio Imager.Z2	Zeiss		Microscopio de fluorescencia
BSA	Fisher Scientific	BP1600	Agente bloqueador
Eclipse Ti	Nikon Instruments		Confocal de barrido microscopio
KCl	VWR	BDH0258	Componente tampón
KH2PO4	Sigma	P5655	Componente tampón
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Componente tampón
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Componente tampón
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Componente tampón
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Conservante bacteriostático
NDS	Aurion	900.122	Agente bloqueante
NIS Elements AR	Nikon		Software
de análisis de imágenes SDS	BioRad	1610301	Agente de deslipidación
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Componente tampón
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactante
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactante
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Iniciador térmico