Summary
Здесь мы представляем протокол адаптации метода CLARITY тканей мозга для цельномонтных сетчаток для улучшения качества стандартного иммуногистохимического окрашивания и визуализации с высоким разрешением нейронов сетчатки и их субклеточных структур.
Abstract
Метод делипидации тканевого гидрогеля (CLARITY), первоначально разработанный лабораторией Дейссерота, был модифицирован и широко используется для иммуноокрашения и визуализации толстых образцов мозга. Однако эта передовая технология еще не использовалась для цельномонтных сетчаток. Хотя сетчатка частично прозрачна, ее толщина примерно 200 мкм (у мышей) по-прежнему ограничивает проникновение антител в глубокие ткани, а также уменьшает проникновение света для визуализации с высоким разрешением. Здесь мы адаптировали метод CLARITY для цельномонтовых сетчаток мышей, полимеризовав их акриламидным мономером с образованием нанопористого гидрогеля, а затем очистив их в додецилсульфате натрия, чтобы свести к минимуму потерю белка и избежать повреждения тканей. Обработанные CLARITY сетчатки были иммуноокражены антителами к нейронам сетчатки, глиальным клеткам и синаптическим белкам, установлены в растворе, соответствующем индексу преломления, и визуалированы. Наши данные показывают, что CLARITY может улучшить качество стандартного иммуногистохимического окрашивания и визуализации нейронов сетчатки и глиальных клеток при подготовке к целому по креплению. Например, 3D-разрешение тонких аксоноподобных и дендритных структур дофаминергических амакриновых клеток было значительно улучшено CLARITY. По сравнению с необработанными цельномонтными сетчатками, CLARITY может выявить иммуноокрашивание синаптических белков, таких как белок постсинаптической плотности 95. Наши результаты показывают, что CLARITY делает сетчатку более оптически прозрачной после удаления липидов и сохраняет тонкие структуры нейронов сетчатки и их белков, которые могут обычно использоваться для получения визуализации нейронов сетчатки и их субклеточных структур с высоким разрешением при подготовке к целому монтажу.
Introduction
Сетчатка позвоночных является, пожалуй, наиболее доступной частью центральной нервной системы (ЦНС), и она служит отличной моделью для изучения развития, структуры и функции мозга. Пять классов нейронов в сетчатке распределены в трех ядерных слоях, разделенных двумя плексиформными слоями. Внешний ядерный слой (ONL) состоит из классических фоторецепторов (стержней и колбочка), которые преобразуют свет в электрические сигналы. Электрические сигналы обрабатываются нейронами во внутреннем ядерном слое (INL), включая биполярные, горизонтальные и амакриновые клетки, а затем передаются в ганглиоцитные клетки сетчатки (RGCs) в ганглиевом клеточном слое (GCL). RGC являются выходными нейронами сетчатки, при этом аксоны проецируются на мозг, чтобы способствовать формированию изображения и не-образующей визуальные функции. Кроме того, три типа глиальных клеток (клетки Мюллера, астроглия и микроглия) обеспечивают нейроны питательными веществами и защищают нейроны от вредных изменений в их внеклеточной среде.
Одна специализированная субпопуляция амакриновых клеток продуцирует и высвобождает дофамин, важный нейромодулятор в ЦНС, реконфигурируемый нейронные цепи сетчатки во время световой адаптации1,2. Дофаминергические амакриновые клетки (ЦАП) обладают уникальной особенностью морфологических профилей. Их соматы расположены в проксимальном INL с дендритами, разветвляющимися в самой дистальной части внутреннего плексиформного слоя (IPL). Аксоноподобные процессы ЦАП немиелиновые, тонкие и длинные, редко разветвленные и несут варикозное расширение вен (места высвобождения дофамина). Они образуют плотное сплетение с дендритами в IPL, включая кольцеподобные структуры вокруг соматов амакриновых клеток AII. Аксоны также проходят через INL к OPL, образуя центробежный путь через сетчатку3. Мы продемонстрировали, что процессы DAC экспрессируют рецепторы в ответ на высвобождение глутамата из пресинаптических нейронов, включая биполярные клетки и внутренне светочувствительные ганглиозные клетки сетчатки (ipRGCs)4,5,6. Однако неясно, экспрессируются ли глутаматные рецепторы на аксонах, дендритах или на обоих, поскольку они отрезаны в вертикальных срезах сетчатки и не могут быть отличимы друг от друга5,6. Иммуноокрашивание необходимо проводить в цельномонтных сетчатках, чтобы выявить трехмерное разветвление ЦАП и наличие глутаматных рецепторов на субклеточных компартментах. Хотя сетчатка относительно прозрачна, толщина сетчатки с целым креплением мыши составляет примерно 200 мкм, что ограничивает проникновение антител в глубокие ткани, а также уменьшает проникновение света для визуализации с высоким разрешением из-за рассеяния света в тканях. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы адаптировали иммуноокрашающий совместимый метод делипидации тканевых гидрогелей (CLARITY), разработанный недавно для толстых участков мозга, к цельной сетчатке мыши7.
Метод CLARITY был первоначально разработан лабораторией Дейссерота для иммуноокрашения и визуализации толстых образцов мозга7. Он использует сильное моющее средство, додецилсульфат натрия (SDS) и электрофорез для удаления липидных компонентов (которые вызывают рассеяние света в тканях), оставляя белки и нуклеиновые кислоты на месте. Удаленные липиды заменяются прозрачным каркасом, состоящим из гидрогелевых мономеров, таких как акриламид, для поддержки оставшейся белковой структуры. Очищенная ткань может быть помечена с помощью иммуногистохимии и визуалирована с существенно увеличенной глубиной проникновения света через ткань (до нескольких миллиметров ниже поверхности ткани). С тех пор метод CLARITY был оптимизирован и упрощен несколькими исследовательскими группами8,9,10. Модифицированный протокол CLARITY использует пассивную технику очистки, чтобы избежать возможного повреждения тканей, вызванного электрофорезом для очистки всего мозга и других неповрежденных органов11. Однако этот метод еще не применялся к цельномонтным сетчаткам. Здесь мы адаптировали пассивную технику CLARITY для цельномонтных сетчаток, чтобы сделать их более прозрачными для иммуногистохимии и визуализации. Мы обнаружили, что большинство протестированных белков сетчатки были сохранены во время этого процесса иммуногистохимии. Используя решение для сопоставления показателей преломления, мы смогли получить изображение нейронов сетчатки толщиной около 200 мкм от ONL до GCL в цельных сетчатках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за мышами и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения для лабораторных животных и были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию в Оклендском университете (протокол No 18071).
ПРИМЕЧАНИЕ: Названия растворов и их составы приведены в таблице 1.
1. Тканевая подготовка
- Усыпить мышь при передозировкеСО2с последующим вывихом шейки матки.
- Энуклеазируют глаза изогнутыми щипцами и переносят их в небольшую чашку Петри с 0,1 М PBS(таблица 1). Под рассеченным микроскопом проткните иглой небольшое отверстие вдоль соединения роговицы-склеры. Перевести до 4% параформальдегида (ПФА) в течение 1 ч.
- Перенесите глаз обратно к блюду с PBS. Под микроскопом для рассечения используйте ножницы для рассечения, чтобы разрезать весь путь вокруг соединения роговицы и склеры. Удалите роговицу и хрусталик. Обрежьте у основания зрительного нерва и аккуратно отклейте склеру щипцами, чтобы изолировать сетчатку.
- Сделайте четыре небольших разреза равномерно вокруг сетчатки и используйте тонкую кисть, смоченную в PBS, чтобы положить ее плоской (GCL стороной вниз) в клеверной форме на небольшом квадратном срезе из нитроцеллюлозной фильтровальной бумаги для стабилизации сетчатки.
- Перенесите сетчатку с помощью щипцов, чтобы удерживать угол нитроцеллюлозной бумаги (не касаясь установленной сетчатки) и поместите ее в 48-ю колодезную пластину с 4% PFA в течение 1 часа.
- Переложите фильтровальную бумагу и сетчатку в колодец с PBS и промыть (по 3 раза по 5 минут каждый).
- Переложить на А4П0(табл. 1)и инкубировать в течение ночи при 4°С с мягким перемешиванием.
- Пипетка растительного масла в скважину полностью покрывает раствор А4П0. Инкубировать на водяной бане при 40 °C в течение 3 часов без встряхивания.
- Мойте (3 раза по 5 минут каждый) в PBS, убедившись, что все масло смыто. При необходимости используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить оставшуюся нефть с верхней части скважины перед последним промывкой.
- Инкубировать в 10% SDS при 40 °C в течение двух дней с легким встряхиванием. Замените SDS свежим раствором на второй день.
- Перенесите фильтровальную бумагу и сетчатку на PBS с помощью Triton-X-100 (PBST, таблица 1)и промыть (по 5x по 1,5 ч).
- Хранить при 4 °C в ПБСТ с 0,01% азида натрия (NaN3)или перейти непосредственно к иммуноокрашиву.
2. Соответствие иммуноокрашивания и показателя преломления
- Извлеките сетчатку из фильтровальной бумаги, аккуратно отклеив ее тонкой щеткой в PBST.
- Инкубировать сетчатку в первичных антителах(таблица 2),разведенных в блокирующем растворе(таблица 1)в течение 2 дней при 40 °С с легким встряхиванием.
- Стирка (5x, 1,5 ч каждая) в PBST.
- Инкубировать с соответствующими вторичными антителами(табл. 3),разбавляя в блокирующем растворе в течение 2 дней при 40 °С с легким встряхиванием и защищая от света в течение оставшейся части процедуры.
- Промывка (5x, 1,5 ч каждая) в 0,02 М фосфатного буфера (см. Таблицу 1).
- Инкубировать в растворе для согласования показателей преломления на основе сорбита (sRIMS, см. таблицу 1)при 40 °C в течение ночи с легким встряхиванием.
3. Монтаж
- Очертите стеклянную крышку 18 мм x 18 мм x 1,5 мм с помощью постоянного маркера с тонким наконечником, чтобы отметить квадратную границу на задней части слайда стеклянного микроскопа.
- Переверните слайд и используйте шприц, чтобы проследить границу тонкой линией силиконовой смазки на передней части слайда, оставив небольшой зазор в одном углу для избыточного монтажного раствора.
- Перенесите сетчатку к центру ограниченной области и расположите кистью с тонким кончиком так, чтобы она ложилась плоской стороной фоторецептора на стеклянный слайд.
- Пипетка примерно 60 мкл sRIMS так, чтобы она покрывала уплощенной сетчатки и распространялась на один угол корпуса, заботясь о том, чтобы сетчатка оставалась плоской и на месте.
- Нанесите крышку, начиная с угла с помощью sRIMS, и медленно опустите ее, пока она не коснется смазки со всех сторон, избегая образования пузырьков воздуха.
- Поместите стопку из 3 обложек с каждой стороны смонтированной сетчатки в качестве прокладки. Используйте длинный край другого слайда, чтобы нажать на крышку, чтобы крепление было плоским и ровным.
- Храните слайды при 4 °C до тех пор, пока не будете выявить изображения.
4. Визуализация
- Изображения образцов на обычном флуоресцентном микроскопе или конфокальном микроскопе(Таблица материалов). Начните с размещения слайда на ступень микроскопа и найдите образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется перевернутый объективный микроскоп, поместите затвор вверх ногами на сцену, сначала убедившись, что открытые области слайда очищены от всей силиконовой смазки и монтажного раствора. - Чтобы получить z-стекированные изображения совместно меченых образцов, сначала сосредоточьтесь на сигнале в каждом канале индивидуально и установите время экспозиции или скорость сканирования для флуоресцентных или конфокальных микроскопов, соответственно.
- Установите диапазон для z-стека, либо вручную установив фокальную плоскость в верхней и нижней части требуемого диапазона, либо установив среднюю точку, а затем указав диапазон вокруг средней точки.
- Отрегулируйте размер шага или количество фрагментов по желанию.
- Захватите изображение и сохраните исходный файл, а также экспортируйте его в виде файла TIFF или другого желаемого формата.
5. Анализ изображений
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений по выбору(Таблица материалов)для регулировки яркости и контрастности в каждом канале до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная четкость как в отдельных изображениях, так и в 3-мерном рендеринге z-стека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбранный размер шага достаточно мал, 3D-деконволюция также может быть выполнена для усиления сигнала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модифицированные сетчатки, обработанные CLARITY, представляют собой оптически прозрачную ткань.
Чтобы сформулировать метод очистки тканей, совместимый с иммуногистохимическими приложениями в сетчатке, обеспечивая при этом адекватную делипидацию и сохраняя структурную целостность клеточных белков, мы адаптировали метод очистки тканей CLARITY к сетчатке мыши. Мы смогли упростить протокол и модифицировать его для сетчатки с целым креплением (см. Протокол). После завершения гибридизации тканей, очистки и согласования показателей преломления сетчатка, обработанная этим модифицированным протоколом CLARITY, показала почти полную оптическую прозрачность по всей толщине сетчатки(Рисунок 1A)по сравнению с необработанными контрольными сетчатками(Рисунок 1B). Этот результат указывает на то, что данная модификация протокола CLARITY обеспечивает достаточно очищенную ткань сетчатки целиком.
Улучшенная 3D-визуализация нейронов в модифицированных обработанных CLARITY сетчатках.
Чтобы оценить качество и практичность иммуногистохимического окрашивания, обеспечиваемого этим модифицированным методом CLARITY, мы окрашивали обработанные CLARITY сетчатки различными первичными антителами(таблица 2). Эти антитела отмечают каждый основной тип клеток в сетчатке: конусные фоторецепторы, палочковые биполярные клетки, амакриновые клетки, RGC и глиальные клетки, а также антитела против субклеточных синаптических белков. За исключением маркера клеточной активности фосфо-S6 (pS6), все протестированные антитела оказались совместимыми с CLARITY. Типичные примеры проиллюстрированы на рисунке 2. Мы выполнили тройную маркировку антителами против конусного ареста, тирозингидрилазы (TH) и РНК-связывающего белка с множественным сплайсингом (RBPMS). Мы взяли серию z-стековых конфокальных микроскопических изображений из ONL в GCL. Отдельные изображения показали конусы, помеченные арестином в ONL(рисунок 2A),ЦАП с маркировкой TH в INL(рисунок 2B)и RGC с маркировкой RBPMS в GCL(рисунок 2C). Наложенное изображение выявило относительное расположение этих нейронов по всей толщине сетчатки(рисунок 2D). Эти результаты свидетельствуют о том, что CLARITY может улучшить качество многих стандартных иммуногистохимических окрашиваний и четко выявить 3D-структуру нейронов по всей толщине сетчатки в цельномонтных препаратах.
Модифицированная CLARITY обеспечивает улучшенное 3D-разрешение тонких процессов нейронов сетчатки и синаптических белков.
Далее мы проанализировали окрашивание TH в обработанных CLARITY цельномонтных сетчатках(рис. 3A,B)и сравнили его с визуализацией, полученной при стандартной подготовке цельногомонтажа (рисунки 3C,D). Конфокальные изображения показывают, что дендриты и аксоноподобные процессы ЦАП были выявлены гораздо более четко в обработанной CLARITY сетчатке(рисунок 3A),чем в стандартной сетчатке(рисунок 3C). В частности, аксоноподобные процессы ЦАП демонстрировали более полные кольцеобразные структуры в сетчатке CLARITY (см. вставку на рисунке 3A),чем в стандартной сетчатке (см. вставку на рисунке 3C). Примечательно, что кольцеобразные структуры сетчатки CLARITY, взятые с помощью флуоресцентной микроскопии(рисунок 3B),были почти идентичны тем, которые наблюдались с помощью конфокального(рисунок 3A). Кроме того, аксоноподобные процессы также проходили в направлении внешней сетчатки, что наблюдалось на X-Z-ориентированных изображениях(рисунок 4A). Эти данные свидетельствуют о том, что CLARITY может быть использован для идентификации аксоноподобных процессов ЦАП в цельномонтных сетчатках даже с использованием обычной флуоресцентной микроскопии.
Когда СУБЪЕДИНИЦА AMPA-рецептора GluA2 и белок постсинаптической плотности 95 (PSD-95) были исследованы в стандартных цельномонтных сетчатках, ни один из них не был обнаружен, вероятно, из-за плохого проникновения антител против этих синаптических белков в глубокую сетчатку. Чтобы определить, позволяют ли обработанные CLARITY сетчатки этим антителам иммуностимлять синаптические белки, мы трижды мечили TH с субъединицами GluA2 и PSD-95. Иммуноокрашивание в отношении GluA2 и PSD-95 показало отчетливую пункту, выявляющую отдельные GluA2-содержащие рецепторы AMPA(рисунок 4B)и мнимые постсинаптические участки(рисунок 4C),соответственно. Наложенное изображение показало некоторую пункту, видимую на процессах DAC(рисунок 4D). Мы изобразили точку предполагаемой колокализации со всеми тремя пятнами и представили ее в 3D-видах(рисунок 5). Из всех трех толокализованных представлений TH четко локализован как с GluA2, так и с PSD-95(рисунок 5 A-C). Эти 3D-перспективные результаты от цельномонтных сетчаток подтверждают наши предыдущие сообщения о синаптической экспрессии GluA2-содержащих AMPA рецепторов на процессах DAC в вертикальных срезах сетчатки5,6.
Рисунок 1. CLARITY обеспечивает оптически прозрачную ткань. Цельномонтные мышиные сетчатки были обработаны модифицированным методом CLARITY (см. Протокол), а вся сетчатка была изображена с помощью рассеченного микроскопа, наложенного на квадратную сетку 0,67 см, чтобы показать масштаб. О: Обработанная CLARITY цельная сетчатка, с линиями сетки, хорошо видимыми через прозрачную ткань. Стрелки очерчены расположение сетчатки. В: Не-CLARITY-обработанная контрольная сетчатка, фиксируемая в PFA в течение 1 ч и инкубированная в PBS. Линии сетки скрыты относительной непрозрачностью ткани. Шкала: приблизительно 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Улучшенная 3D-визуализация нейронов по всей толщине сетчатки в сетчатке, обработанной CLARITY. Цельномонтные сетчатки CLARITY были иммуноокражены антителами против конусного ареста, TH и RBPMS. Изображение представляет собой 3D-объемный рендеринг конфокального изображения с z-стеком, просматриваемого в ориентации X-Z. О: Конусные фоторецепторы (стрелка), помеченные конусным арестином (синий). Во внутренней части сетчатки (наконечники стрел), вероятно, видно небольшое пятнышко, вероятно, из-за фонового окрашивания. В: ЦАП сома и дендриты (стрелка) помечены TH (красным цветом). Наконечники стрел указывают на кровеносные сосуды сетчатки во внутренней сетчатке, видимые из-за мультиметичных иммуноокрашивающих веществ. С: RGC somata (стрелка) с маркировкой RBPMS (зеленый). Наконечники стрел указывают на кровеносные сосуды сетчатки, видимые из-за аутофлуоресценции и неспецифического окрашивания кровеносных сосудов. Г: Объединенное изображение тройного меченого окрашивания, выявляющее относительное размещение этих нейронов по всей толщине сетчатки, с конусными фоторецепторами, расположенными во внешнем ядерном слое, ЦАП во внутреннем ядерном слое и RGC в ганглиевом клеточном слое. Масштаб объемного вида отмечен с шагом 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. CLARITY выявляет тонкие структуры морфологии DAC. Иммуноокрашивание TH проводили в обработанных CLARITY(A и B)и стандартных(C и D)сетчатках. Z-стекированные изображения были сделаны с использованием конфокальной(A и C)и флуоресцентной микроскопии(B и D). Вставка из одной оптической плоскости на каждом изображении выделяет кольцеобразные структуры, предположительно образованные аксоноподобными процессами. Наконечники стрел указывают на Соматы DAC, и многие кольцеподобные структуры видны (примеры обозначены стрелками) в плотном сплетении дендритов и аксоноподобных процессах, выявленных в обработанных CLARITY сетчатках(A и B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Модифицированная CLARITY обеспечивает улучшенное 3D-разрешение тонких дендритных структур и синаптических белков. Тройное иммуноокрашивание проводили в обработанных CLARITY цельномонтных сетчатках с антителами против TH, GluA2 и PSD-95. Объемный рендеринг был реконструирован из конфокальной визуализации с z-стеком и представлен в угловой ориентации X-Z. О: TH-меченые DAC somata (наконечники стрел) во внутреннем ядерном слое и процессы (желтые стрелки), стратифицирующиеся в дистальном внутреннем плексиформном слое (красный). Белыми стрелками обозначены центробежные процессы, распространяющиеся к наружной сетчатке. В: Плотная пунктатная экспрессия GluA2-содержащих AMPA рецепторов через внутренний плексиформный слой (зеленый). Стрелка указывает на аутофлуоресценцию из кровеносного сосуда сетчатки. С: Пункта, выявляющая постсинаптические участки, помеченные PSD-95 во внутреннем плексиформном слое (синий). Стрелки указывают на кровеносные сосуды, очевидные из-за использования мышиного моноклонального антитела против PSD-95. Г: Наложенное изображение, демонстрирующее перекрытие процессов ЦАП с меткой TH с выражением GluA2 и PSD-95. Масштаб объемного вида отмечен с шагом 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Синаптическая экспрессия GluA2-содержащих AMPA рецепторов на ЦАП. Точка предполагаемой тройной колокализации TH, GluA2 и PSD-95, показанная на рисунке 4, была выбрана и исследована в 3D. A1 представляет собой сегмент процесса ЦАП (красный) в ориентации X-Z (A5). A2 и A3 показывают один GluA2 punctum (зеленый) и PSD-95 punctum (синий), соответственно, в одной и той же ориентации. Объединенное изображение (A4) демонстрирует тройную колокализацию TH, GluA2 и PSD-95 (стрелка). B1-B4 показывают одну и ту же точку колокализации (стрелка) в ориентации Y-Z (B5). C1-C4 показывают колокализацию одной и той же точки (стрелки) в плоскости X-Y (C5). Тройная колокализация отчетливо проявляется в каждой ориентации. Шкала: 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| решение | состав | примечания |
| 0,1 М PBS | 137 мМ NaCl | Отрегулируйте pH до 7,4 |
| 26,8 мМ KCl | ||
| 10,1 мМ Na2HPO4 | ||
| 17,6 мМ KH2PO4 | ||
| А4П0 | 4% акриламид | Готовьте на льду, аликвоте и храните при -20 ºC |
| 0,25% ВА-044 | ||
| 0,1 М PBS | ||
| ПБСТ | 0,1% (об/об) Тритон-Х-100 | |
| 0,1 М PBS | ||
| Блокирующее решение | 2% НБД или 1% БСА | |
| 0.01% NaN3 | ||
| ПБСТ | ||
| 0,1 М фосфатный буфер | 11,93 г Na2HPO4/литр | Отрегулируйте pH до 7,5 |
| 15,34 г NaH2PO4/литр | ||
| ддН2О | ||
| сРИМС | 70% сорбита | Отрегулируйте pH до 7,5 с помощью NaOH |
| 0.1% анимация-20 | ||
| 0.01% NaN3 | ||
| 0,02 М фосфатный буфер | ||
Таблица 1. Состав растворов.
| антитело | МВЦ | хозяин | разбавление | каталог # | поставщик | Идентификатор реестра Ab | цель |
| Чувствительный к синему цвету опсин | +3 | Козий поликлональный | 1:1000 | SC-14363 | Биотехнология Санта-Крус | AB_2158332 | S-конус |
| Конусный арестин | +2 | Кролик поликлональный | 1:1000 | АБ15282 | ЭМД Миллипор | AB_1163387 | конус |
| Протеинкиназа С альфа (PKC-α) | +3 | Кролик поликлональный | 1:1000 | СК-208 | Биотехнология Санта-Крус | AB_2168668 | Стержневая биполярная клетка |
| Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) | +3 | Козий поликлональный | 1:500 | СК-6170 | Биотехнология Санта-Крус | AB_641021 | Астроцит |
| Тирозингидроксилаза (TH) | +3 | Овечий поликлональный | 1:500 | АБ1542 | ЭМД Миллипор | AB_90755 | Дофаминергическая амакриновая клетка |
| Тирозингидроксилаза (TH) | +2 | Кролик поликлональный | 1:500 | ОПА1-04050 | ТермоРыба | AB_325653 | Дофаминергическая амакриновая клетка |
| Холин ацетилтрансфераза (CHAT) | +1 | Козий поликлональный | 1:500 | АБ144П | ЭМД Миллипор | AB_2079751 | Звездопадная амакриновая клетка |
| РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом (RBPMS) | +1 | Морская свинка поликлональная | 1:2000 | АБН1376 | ЭМД Миллипор | AB_2687403 | Ганглиоцит сетчатки |
| ГлюА2 | +3 | Кролик поликлональный | 1:500 | АБ1768-I | ЭМД Миллипор | AB_2247874 | Ca2+-непроницаемый ampA-рецептор |
| ГлюА2 | +2 | Мышь моноклональная | 1:250 | МАБН1189 | ЭМД Миллипор | AB_2737079 | Ca2+-непроницаемый ampA-рецептор |
| Постсинаптическая плотность белка 95 (PSD-95) | +3 | Мышь моноклональная | 1:1000 | 75-028 | НейроМаб | AB_2877189 | Синаптические сайты |
| Фосфо-S6 (pS6) | 0 | Кролик поликлональный | 1:500 | 44-923Г | ТермоРыба | AB_2533798 | Маркер активности клеток |
Таблица 2. Резюме первичных протестированных антител. Условный вес IHC: +3 = последовательное, высокоспецифичное окрашивание; +2 = стабильно хорошее окрашивание, минимальный фон; +1 = хорошее окрашивание, немного фона; 0 = несовместимо с ЯСНОСТЬЮ.
| хозяин | Целевые виды | парный | разбавление | поставщик |
| осел | Анти-овцы | Алекса Флюор 568 | 1:500 | Инвитроген |
| осел | Анти-овцы | Алекса Флуор 594 | 1:500 | Инвитроген |
| осел | Анти-кролик | Алекса Флюор 488 | 1:500 | Инвитроген |
| осел | Анти-кролик | Алекса Флуор 594 | 1:500 | Инвитроген |
| коза | Анти-кролик | Алекса Флуор 647 | 1:500 | Инвитроген |
| осел | Анти-мышь | Алекса Флюор 488 | 1:500 | Инвитроген |
| осел | Анти-мышь | Алекса Флуор 647 | 1:500 | Инвитроген |
| осел | Анти-коза | Алекса Флюор 568 | 1:500 | Инвитроген |
| осел | Анти-коза | Алекса Флуор 594 | 1:500 | Инвитроген |
| коза | Анти-морская свинка | Алекса Флюор 488 | 1:500 | Инвитроген |
Таблица 3. Резюме протестированных вторичных антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модификация протокола CLARITY для цельномонтных сетчаток.
Мы упростили протокол CLARITY для достижения адекватной полимеризации без необходимости вакуумной вакуумной эвакуации или сухой камеры, как это используется в большинстве предыдущих исследований7,9,11. Процесс полимеризации ингибируется кислородом, требуя, чтобы образец был изолирован из воздуха на этапе полимеризации протокола. Однако вместо дегазации азотом мы обнаружили, что покрытие образца маслом достаточно изолировало образец, чтобы обеспечить полимеризацию без неблагоприятного воздействия на остальную часть протокола после тщательного промывки, как ранее документировано12. Мы дополнительно упростили протокол с помощью пассивного метода очистки, чтобы ограничить риск потемнения тканей и повреждения структуры ткани, связанной с электрофоретической очисткой11. Пассивная очистка ускоряется мягким перемешиванием и повышенной температурой, что позволяет полностью очистить ткани всего за два дня. В течение этого периода времени достигается достаточная делипидация, чтобы получить оптически прозрачную ткань при минимизации потери белков и других биомолекул, неотъемлемую часть клеточной структуры и иммуногистохимического окрашивания.
CLARITY сохраняет белки нейронов сетчатки и глиальных клеток в цельномонтных препаратах.
Наши результаты показывают, что почти все протестированные антитела работают в обработанных CLARITY сетчатках. Эти антитела помечают фоторецепторы, биполярные клетки, амакриновые клетки, RGC и глиальные клетки. Хотя мы не смогли протестировать антитела для подтипов каждого класса нейронов сетчатки, наши результаты подразумевают, что обработанные CLARITY сетчатки могут использоваться для большинства клеточных маркеров в сетчатке. Хотя большинство антител, которые мы тестировали, могут также иммунонапятствовать нейроны сетчатки в сетчатках, не обработанных CLARITY, мы обнаружили, что CLARITY позволяет адекватно проникать антителам в глубокую ткань сетчатки, обеспечивая хорошую специфичность окрашивания в среднем слое сетчатки. Кроме того, мы обнаружили, что CLARITY улучшает проникновение света по всей толщине сетчатки, уменьшая рассеяние света и позволяя получать изображения с высоким разрешением даже через самые глубокие слои. Эти факторы способствуют улучшению как окрашивания, так и визуализации в обработанных CLARITY сетчатках с целым креплением по сравнению со стандартным IHC13,не являюющимся СТАНДАРТОМ CLARITY. Уменьшенный фон и улучшенная 3D-визуализация и объемный рендеринг позволяют полностью имитно исследуть клеточные структуры во всех слоях по всей толщине сетчатки.
CLARITY выявляет тонкие процессы и синаптическую структуру ЦАП в цельномонтных сетчатках.
Наши результаты показывают, что кольцеподобные структуры и центробежные процессы ЦАП выявляются в CLARITY-обработанных лучше, чем в не-CLARITY цельномонтных сетчатках. В частности, иммуноокрашивание тканью, обработанной CLARITY, позволяет обеспечить хорошее разрешение этих тонких структур даже при стандартной флуоресцентной микроскопии без необходимости конфокальной визуализации. Учитывая важность ЦАП в зрительной функции, препарат CLARITY может быть использован для исследования структур ЦАП в нормальных сетчатках и морфологических изменений в больных условиях.
При иммуноокрашивающих PSD-95 и GluA2 стандартной цельной тканью мы практически не наблюдали маркировки этих субклеточных структур в глубоких слоях сетчатки, что указывает на плохое проникновение антител. Применение протокола CLARITY позволяет отчетливо окрашивать эти белки во внутренних слоях сетчатки, что указывает на улучшение проникновения антител в глубокие ткани. Наши результаты показывают, что CLARITY позволяет обнаруживать синаптические белки на процессах DAC в цельномонтных сетчатках, что обычно наблюдается в вертикальных срезовых препаратах6. Поскольку аксоноподобные процессы нельзя отличить от дендритов в вертикальных срезах, цельные сетчатки CLARITY дают возможность определить, происходят ли синаптические входы в ЦАП от других нейронов, таких как биполярные клетки и иприг, в дендритах, аксоноподобных процессах или в обоих5,6. Поскольку рецепторы AMPA и белки PSD-95 широко распространены по всему IPL, экспрессия этих белков на ЦАП является отличным примером для использования сетчатки CLARITY для идентификации синаптических белков в других нейронах сетчатки.
Соображения, ограничения и будущие применения протокола CLARITY для сетчатки с целым креплением.
Во-первых, протоколы полимеризации и очистки для обработанных CLARITY цельномонтных сетчаток добавляют несколько дней к процессу подготовки тканей. Тем не менее, метод по-прежнему очень практичен тем фактом, что осветленные сетчатки могут храниться в PBS, содержащих азид натрия, до двух недель с минимальной деградацией тканей. Во-вторых, некоторое расширение ткани наблюдалось на протяжении всего процесса очистки, как описано в предыдущих приложениях CLARITY7,11. Тем не менее, мы обнаружили, что сетчатка вернулась к примерно первоначальному размеру при уравновешивания с раствором, соответствующим индексу преломления. Потенциальные незначительные изменения объема тканей могут не вызывать значительных искажений клеточной или субклеточнойструктуры 7,11. В-третьих, при визуализации более толстых образцов мозга объектив микроскопа часто погружают непосредственно в монтажную муляжную муляж, чтобы обеспечить полное соответствие показателя преломления от линзы микроскопа через ткань12. С более тонкими образцами, такими как сетчатка, мы использовали чехлы для монтажа, чтобы сделать образцы более плоскими и более ровными для визуализации. Эффекты рефракции через покров, по-видимому, минимальны при визуализации. В-четвертых, некоторые из наших изображений показывают неспецифическое окрашивание кровеносных сосудов, потому что мы не перфузию всего животного интракардиальной перфузией (предлагается использовать, чтобы избежать неспецифического окрашивания) перед энуклеацией глаз. Наконец, текущий протокол, адаптированный для мышей, может быть использован для сетчатки других видов. В частности, сетчатки крупных животных, таких как собаки, свиньи, лошади и приматы, намного толще, чем у мышей. Этот протокол CLARITY может сделать сетчатку этих животных более оптически прозрачной после удаления липидов и сохранить тонкие структуры нейронов сетчатки и их белков для иммуноокрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Бин Е, Натана Спикса и Хао Лю за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Национальным институтом грантов здравоохранения EY022640 (D.-Q.Z.) и Оклендского университета Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
