Summary
Burada, standart immünohistokimyasal lekelenme ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme kalitesini artırmak için beyin dokularının CLARITY yöntemini tam montajlı retinalara uyarlamak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Başlangıçta Deisseroth laboratuvarı tarafından geliştirilen doku hidrojel delipidasyon yöntemi (CLARITY), kalın beyin örneklerinin immünostainasyonu ve görüntülenmesi için değiştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bu ileri teknoloji henüz tam montajlı retinalar için kullanılmamıştır. Retina kısmen şeffaf olmasına rağmen, yaklaşık 200 μm kalınlığı (farelerde) hala antikorların derin dokuya nüfuzunu sınırlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyonunu azaltır. Burada, protein kaybını en aza indirmek ve doku hasarını önlemek için akrilamid monomer ile polimerleştirerek nanoporöz bir hidrojel oluşturmak ve daha sonra sodyum dodecyl sülfatta temizlemek için tüm mount fare retinaları için CLARITY yöntemini uyarladık. CLARITY ile işlenmiş retinalar, retina nöronları, glial hücreler ve sinaptik proteinler için antikorlarla immünostain edildi, kırılma indeksi eşleştirme çözeltisine monte edildi ve görüntülendi. Verilerimiz CLARITY'nin retina nöronları ve glial hücreler için standart immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme kalitesini tam montajlı hazırlıkta artırabileceğini göstermektedir. Örneğin, dopaminerjik amakrin hücrelerin ince akson benzeri ve dendritik yapılarının 3D çözünürlüğü CLARITY tarafından çok daha iyi hale getirildi. İşlenmemiş tam montajlı retinalarla karşılaştırıldığında CLARITY, postinaptik yoğunluk proteini 95 gibi sinaptik proteinler için immünostaining ortaya çıkarabilir. Sonuçlarımız, CLARITY'nin lipitlerin çıkarılmasından sonra retinayı daha optik olarak şeffaf hale getirdiğini ve retina nöronlarının ve proteinlerinin ince yapılarını koruduğunu ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının tüm montajlı preparat içinde yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için rutin olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Omurgalı retina, merkezi sinir sisteminin (CNS) belki de en erişilebilir kısmıdır ve beynin gelişimini, yapısını ve işlevini incelemek için mükemmel bir model görevi görür. Retinadaki beş nöron sınıfı, iki pleksiform katmanla ayrılmış üç nükleer katmanda dağıtılır. Dış nükleer tabaka (ONL), ışığı elektrik sinyallerine dönüştüren klasik fotoreceptörlerden (çubuklar ve koniler) oluşur. Elektrik sinyalleri, bipolar, yatay ve amakrin hücreler de dahil olmak üzere iç nükleer tabakadaki (INL) nöronlar tarafından işlenir ve daha sonra ganglion hücre tabakasındaki (GCL) retinal ganglion hücrelerine (RGC' ler) iletilir. RGC'ler retinanın çıkış nöronlarıdır, aksonlar görüntü oluşturan ve görüntü oluşturmayan görsel işleve katkıda bulunmak için beyne yansıtır. Ek olarak, üç tür glial hücre (Muller hücreleri, astroglia ve mikroglia) nöronlara besin sağlar ve nöronları hücre dışı ortamlarındaki zararlı değişikliklerden korur.
Amakrin hücrelerinin özel bir alt nüfus, CNS'de önemli bir nöromodülatör olan dopamin üretir ve serbest bırakır, ışık adaptasyonu sırasında retinal sinir devrelerini yeniden yapılandırır1,2. Dopaminerjik amakrin hücreler (DAC' ler) morfolojik profillerin benzersiz bir özelliğine sahiptir. Somataları proksimal INL'de bulunur ve dendritler iç pleksiform tabakanın (IPL) en distal kısmında ortaya çıkar. DAC'lerin akson benzeri süreçleri boyasız, ince ve uzun, seyrek dallıdır ve varikoziteleri taşır (dopamin salınım bölgeleri). AII amacrine hücrelerinin somata etrafındaki halka benzeri yapılar da dahil olmak üzere IPL'de dendritleri olan yoğun bir pleksus oluştururlar. Aksonlar ayrıca INL'den OPL'ye doğru ilerler ve retina3boyunca santrifüj bir yol oluşturur. DAC süreçlerinin, bipolar hücreler ve özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücreleri (ipRGC'ler)4,5,6dahil olmak üzere presynaptik nöronlardan glutamat salınımı yanıt olarak reseptörleri ifade ettiğini gösterdik. Bununla birlikte, glutamat reseptörlerinin aksonlar, dendritler veya her ikisi de dikey retina bölümlerinde kesildiğinden ve birbirinden ayırt edilemediğinden ifade edip etmediği belirsizdir5,6. DAC'lerin üç boyutlu dallanmalarını ve hücre altı bölmelerde glutamat reseptörlerinin varlığını ortaya çıkarmak için tüm montajlı retinalarda immünostaining yapılması gerekir. Retina nispeten şeffaf olmasına rağmen, bir farenin tam montajlı retina kalınlığı yaklaşık 200 μm'dir, bu da antikorların derin dokuya nüfuz etmesini sınırlar ve doku ışığı saçılım nedeniyle yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyonunu azaltır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son zamanlarda kalın beyin bölümleri için geliştirilen immünostaining uyumlu doku hidrojel delipidasyon yöntemini (CLARITY) tüm montajlı fare retinalarına uyarladık7.
CLARITY yöntemi başlangıçta Kalın beyin örneklerinin immünostaining ve görüntüleme için Deisseroth laboratuvarı tarafından geliştirilmiştir7. Lipid bileşenlerini (doku ışığının saçılmasına neden olan) çıkarmak için proteinleri ve nükleik asitleri yerinde bırakarak güçlü bir deterjan, sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve elektroforezi kullanır. Çıkarılan lipitler, kalan protein yapısını desteklemek için akrilamid gibi hidrojel monomerlerden oluşan şeffaf bir iskele ile değiştirilir. Temizlenen doku immünhistokimya ile etiketlenebilir ve doku boyunca önemli ölçüde artan ışık penetrasyon derinliği ile görüntülenebilir (doku yüzeyinin birkaç milimetre altına kadar). O zamandan beri CLARITY yöntemi birkaç araştırma grubu8, 9,10tarafından optimize edilmiş ve basitleştirilmiştir. Değiştirilmiş bir CLARITY protokolü, tüm beyni ve diğer sağlam organları temizlemek için elektroforez tarafından üretilen olası doku hasarını önlemek için pasif bir temizleme tekniği kullanır11. Ancak bu yöntem henüz tam mount retinalara uygulanmamıştır. Burada, pasif CLARITY tekniğini tüm mount retinalar için immünhistokinoloji ve görüntüleme için daha şeffaf hale getirmek için uyarladık. İmmünohistokinoloji için test edilen retina proteinlerinin çoğunluğunun bu süreçte korunduğunu tespit ettik. Kırma indeksi eşleştirme solüsyonını kullanarak, retina nöronlarını ONL'den GCL'ye kadar yaklaşık 200 μm kalınlığında tüm montajlı retinalarda görüntüleyebildik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare bakımı ve tüm deneysel prosedürler laboratuvar hayvanları için Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine göre yürütüldü ve Oakland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı (protokol no. 18071).
NOT: Çözümlerin adları ve kompozisyonları Tablo 1'de listelenmiştir.
1. Doku hazırlama
- Fareyi aşırı dozda CO2ile ötenazi , ardından servikal çıkık.
- Gözleri kavisli tokmaklarla enükle edin ve 0,1 M PBS(Tablo 1)ile küçük bir petri kabına aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, kornea-sklera kavşağı boyunca küçük bir deliği bir iğne ile dürtün. 1 saat boyunca % 4 paraformaldehite (PFA) aktarın.
- Gözü PBS'li bir tabağa geri aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, kornea-sklera kavşağının etrafını kesmek için diseksiyon makası kullanın. Korneayı ve lensi çıkarın. Optik sinirin tabanında kesin ve retinayı izole etmek için sklerayı dikkatlice ön ayaklarla soyun.
- Retinanın etrafında eşit olarak dört küçük kesim yapın ve retinayı stabilize etmek için nitroselüloz filtre kağıdından küçük bir kare kesim üzerinde yonca benzeri bir şekle düz (GCL tarafı aşağı) koymak için PBS'ye batırılmış ince bir uç fırçası kullanın.
- Nitroselüloz kağıdının köşesini tutmak için forseps kullanarak retinayı aktarın (monte retinaya dokunmadan) ve 1 saat boyunca% 4 PFA'ya sahip 48 kuyulu bir plakaya yerleştirin.
- Filtre kağıdını ve retinayı PBS ile bir kuyuya aktarın ve yıkayın (her biri 5 dakika için 3x).
- A4P0'ye (Tablo 1) aktarın ve hafif ajitasyonla 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- Pipet bitkisel yağı, A4P0 çözeltisini tamamen örtmek için kuyuya. 40 °C'de bir su banyosunda 3 saat boyunca titreme olmadan kuluçkaya yatır.
- PBS'de yıkayın (her biri 5 dakika için 3x), tüm yağın durulanmış olduğundan emin olun. Gerekirse, kalan yağı son durulamadan önce kuyunun üstünden dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.
- Hafifçe sallanarak iki gün boyunca 40 °C'de% 10 SDS'de kuluçkaya yatırın. SDS'i ikinci gün yeni bir çözelti ile değiştirin.
- Filtre kağıdını ve retinayı Triton-X-100 (PBST, Tablo 1) ve yıkama (her biri 1,5saat için 5x) ile PBS'ye aktarın.
- PBST'de %0,01 sodyum azit (NaN3)ile 4 °C'de saklayın veya doğrudan immün yetinmeye geçin.
2. İmmünostaining ve kırılma indeksi eşleştirme
- Retinayı PBST'de ince bir uç fırçasıyla hafifçe soyarak filtre kağıdından çıkarın.
- Retinayı birincil antikorda(Tablo 2)bloke çözeltisinde seyreltilmiş (Tablo 1) 40 ° C'de 2 gün boyunca hafifçe sallanarak kuluçkaya yatırın.
- PBST'de yıkayın (her biri 5x, 1,5 saat).
- 40 °C'de 2 gün boyunca blokaj çözeltisinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlarla(Tablo 3)hafifçe sallanarak kuluçkaya yatırın ve prosedürün geri kalanı boyunca ışıktan koruyun.
- 0,02 M fosfat tamponunda yıkayın (her biri 5x, 1,5 saat) (bkz. Tablo 1).
- Sorbitol bazlı Kırılma İndeksi Eşleştirme Çözümünde (sRIMS, bkz. Tablo 1)gece boyunca 40 °C'de hafif titreme ile kuluçkaya yatırın.
3. Montaj
- Cam mikroskop kaydırağının arkasında kare bir sınırı işaretlemek için ince uçlu kalıcı bir işaretleyici ile 18 mm x 18 mm x 1,5 mm cam kapakçık anahattı.
- Kaydırağı ters çevirin ve slaydın önünde ince bir silikon gres çizgisiyle sınırı izlemek için bir şırınna kullanın, fazla montaj çözümünün kaçması için bir köşede küçük bir boşluk bırakın.
- Retinayı sınırlanan alanın ortasına aktarın ve cam kaydırağın karşısında fotoreceptör tarafıyla düz olacak şekilde ince uçlu bir fırça ile düzenleyin.
- Pipet yaklaşık 60 μL sRIMS, böylece düzleştirilmiş retinayı kaplar ve retinanın düz ve yerinde kalmasına dikkat ederek muhafazanın bir köşesine uzanır.
- Köşeden başlayarak sRIMS ile kapak kapağını uygulayın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek her taraftaki grese dokunana kadar yavaşça indirin.
- Monte retinanın her iki tarafına aralayıcı olarak 3 kapaklı bir yığın yerleştirin. Başka bir slaydın uzun kenarını kullanarak kapak altlıklarına bastırın, böylece montaj düz ve eşit olacaktır.
- Görüntülemeye kadar slaytları 4 °C'de düz bir şekilde saklayın.
4. Görüntüleme
- Geleneksel floresan mikroskop veya konfokal mikroskop(Malzeme Tablosu)üzerinde görüntü örnekleri. Slaydı mikroskop aşamasına yerleştirerek ve numuneyi bularak başlayın.
NOT: Ters nesnel mikroskop kullanılıyorsa, önce slaydın açık alanlarının tüm silikon gres ve montaj çözeltisinden arındırılmasını sağlayarak, slaytı sahne alanına baş aşağı yerleştirin. - Birlikte etiketlenmiş örneklerin z yığılmış görüntülerini elde etmek için, önce her kanaldaki sinyale ayrı ayrı odaklanın ve floresan veya konfokal mikroskoplar için pozlama süresini veya tarama hızını ayarlayın.
- Odak düzlemini istediğiniz aralığın üst ve alt kısmına el ile ayarlayarak veya orta noktayı ayarlayıp orta noktanın etrafında bir aralık belirterek z yığınının aralığını ayarlayın.
- Adım boyutunu veya dilim sayısını istediğiniz gibi ayarlayın.
- Görüntüyü yakalayın ve orijinal dosyayı kaydedin ve bir TIFF dosyası veya başka bir istenen biçim olarak dışa aktarın.
5. Görüntü analizi
- Hem tek görüntülerde hem de z yığınının 3 boyutlu işlenmesinde optimum netlik elde edilene kadar her kanaldaki parlaklığı ve kontrastı ayarlamak için tercih edilen görüntü analizi yazılımını(Malzeme Tablosu)kullanın.
NOT: Seçilen adım boyutu yeterince küçükse, sinyali geliştirmek için 3D dekonvolüasyon da yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modifiye CLARITY işlenmiş retinalar optik olarak şeffaf dokudur.
Yeterli delipidasyon sağlarken ve hücresel proteinlerin yapısal bütünlüğünü korurken retinadaki immünohistokimyasal uygulamalarla uyumlu bir doku temizleme yöntemi formüle etmek için CLARITY doku temizleme yöntemini tüm montajlı fare retinalarına uyarladık. Protokolü basitleştirebildik ve tam montajlı retinalar için modifiye edebildik (bkz. Protokol). Doku hibridizasyonu, temizleme ve kırılma indeksi eşleştirmesini tamamladıktan sonra, bu değiştirilmiş CLARITY protokolü ile işlenen retinalar, işlenmemiş kontrol retinalarına kıyasla retinanın kalınlığı boyunca neredeyse eksiksiz optik saydamlık göstermiştir(Şekil 1B). Bu sonuç, CLARITY protokolünün bu şekilde değiştirilmesinin yeterince temizlenmiş tüm montaj retina dokusu sağladığını gösterir.
Modifiye CLARITY işlenmiş retinalarda nöronların 3D görüntülemesi geliştirildi.
Bu değiştirilmiş CLARITY yöntemi ile sağlanan immünohistokimyasal boyamanın kalitesini ve pratikliğini değerlendirmek için CLARITY işlenmiş retinaları çeşitli birincil antikorlarla lekeledik(Tablo 2). Bu antikorlar retinadaki her ana hücre tipini işaretler: koni fotoreceptörleri, çubuk bipolar hücreler, amakrin hücreleri, RGC'ler ve glial hücrelerin yanı sıra hücre altı sinaptik proteinlere karşı antikorlar. Hücre aktivitesi belirteci fosfo-S6 (pS6) hariç, test edilen tüm antikorların CLARITY ile uyumlu olduğu kanıtlanmıştır. Tipik örnekler Şekil 2'de gösterilmiştir. Koni arrestin, tirozin hidroksilaz (TH) ve Çoklu Birleştirmeli RNA Bağlayıcı Protein (RBPMS) karşı antikorlarla üçlü etiketleme yaptık. ONL'den GCL'ye bir dizi z-yığın konfokal mikroskopi görüntüsü aldık. Tek tek görüntülerde ONL'de(Şekil 2A),INL'de TH etiketli TH etiketli NIK'lerde (Şekil 2B) ve GCL'de RBPMS işaretli RGC'lerde(Şekil 2C)arrestin etiketli koniler gösterildi. Bir kaplama görüntüsü, retinanın tüm kalınlığı boyunca bu nöronların göreceli konumunu ortaya koydu (Şekil 2D). Bu sonuçlar, CLARITY'nin birçok standart immünohistokimyasal lekelemenin kalitesini artırabileceğini ve tüm montaj preparatlarında retinanın tüm kalınlığı boyunca nöronların 3D yapısını açıkça ortaya olabileceğini göstermektedir.
Modifiye CLARITY, retinal nöronların ve sinaptik proteinlerin ince süreçlerinin 3D çözünürlüğünü geliştirir.
Clarity işlenmiş tam montajlı retinalarda TH lekelemesini daha da analiz ettik (Şekil 3A,B) ve standart tam montaj hazırlığından elde edilen görüntüleme ile karşılaştırdık ( Şekil3C,D). Konfokal görüntüler, DAC'lerin dendritlerinin ve akson benzeri süreçlerinin CLARITY işlenmiş retinada (Şekil 3A) standart bir retinaya göre çok daha net bir şekilde ortaya kondığını göstermektedir (Şekil 3C). Özellikle, DAC'lerin akson benzeri süreçleri, clarity retinasında standart bir retinaya göre daha eksiksiz halka benzeri yapılar sergilemiştir (Şekil 3A'dakibir kesici uçta bakınız). Özellikle, floresan mikroskopi kullanılarak alınan clarity retinanın halka benzeri yapıları (Şekil 3B) konfokal kullanılarak gözlenenlerle neredeyse aynıydı (Şekil 3A). Ek olarak, akson benzeri işlemler de X-Z odaklı görüntülerde gözlenen dış retinaya doğru koştu (Şekil 4A). Bu veriler, CLARITY'nin geleneksel floresan mikroskopisi kullanılsa bile, tüm montajlı retinalardaki DAC'lerin akson benzeri süreçlerini tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir.
AMPA-reseptör alt birim GluA2 ve postinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95) standart tam montajlı retinalarda incelendiğinde, muhtemelen bu sinaptik proteinlere karşı antikorların derin retinaya zayıf penetrasyonu nedeniyle ikisi de tespit edilmedi. CLARITY ile işlenmiş retinaların immünostain sinaptik proteinlere karşı bu antikorlara izin verip vermediğini belirlemek için TH'yi GluA2 ve PSD-95 alt birimleriyle üç kez etiketledik. GluA2 ve PSD-95'e karşı immünostainasyon, sırasıyla GluA2 içeren ampa reseptörlerini (Şekil 4B) ve putatif postynaptik bölgeleri (Şekil 4C) ortaya çıkaran belirgin bir nokta gösterdi. Bir kaplama görüntüsü DAC işlemlerinde belirgin olan bazı noktalama işaretlerini gösterdi (Şekil 4D). Her üç leke ile de putatif kolokalizasyon noktasını görüntüledik ve 3D görünümlerde sunduk (Şekil 5). Her üç görünümden de, TH hem GluA2 hem de PSD-95 (Şekil 5 A-C)ile açıkça kolokalize edildi. Tüm montajlı retinalardan elde edilen bu 3D perspektif sonuçları, GluA2 içeren AMPA reseptörlerinin dikey retina dilimlerinde DAC proseslerinde sinaptik ifade raporlarımızı doğrular5,6.
Şekil 1. CLARITY optik olarak şeffaf doku sağlar. Tüm montajlı fare retinaları değiştirilmiş CLARITY yöntemi (bkz. Protokol) ve diseksiyon mikroskobu ile görüntülenen tüm retina ile işlendi, ölçeği göstermek için 0.67 cm kare ızgara üzerine yerleştirildi. A: CLARITY işlenmiş tüm montaj retina, şeffaf doku olsa da ızgara çizgileri açıkça görülebilir. Oklar retinanın yerleşimini tanımlamaz. B: NETlik işlemeli olmayan kontrol retinası, PFA'da 1 saat sabitlenir ve PBS'de inkübe edilir. Izgara çizgileri dokunun göreceli opaklığı ile gizlenmektedir. Ölçek çubuğu: yaklaşık 2 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. CLARITY ile işlenmiş retinalarda retina kalınlığı boyunca nöronların 3D görüntülemesi geliştirildi. Tüm mount CLARITY retinalar koni arrestin, TH ve RBPMS'ye karşı antikorlarla immünostain edildi. Görüntü, X-Z yönlendirmesinde görüntülenen z yığılmış bir konfokal görüntünün 3D birim işlemesini temsil eder. A: Koni fotoreceptörleri (ok) koni arrestin (mavi) ile etiketlenmiştir. İç retinada (ok uçları) büyük olasılıkla arka plan lekesi nedeniyle hafif bir benek görülebilir. B: TH (kırmızı) ile etiketlenmiş DAC soma ve dendritler (ok). Ok uçları, çok etiketli immünostaining nedeniyle görülebilen iç retinadaki retina kan damarlarını gösterir. C: RBPMS (yeşil) ile etiketlenmiş RGC somata (ok). Ok uçları, otofluoresans ve kan damarlarının spesifik olmayan lekelenmeleri nedeniyle görülebilen retinal kan damarlarını gösterir. D: Üçlü etiketli boyamanın birleştirilmiş görüntüsü, bu nöronların retina kalınlığı boyunca göreceli yerleşimini, dış nükleer katmanda bulunan koni fotoreceptörleri, iç nükleer katmandaki DAC'ler ve ganglion hücre tabakasındaki RGC'ler ile ortaya çıkarır. Birim görünümünün ölçeği 20 μm'lik artışlarla işaretlenmiştir.
Şekil 3. CLARITY, DAC morfolojisinin ince yapılarını ortaya koymaktadır. TH immünostaining CLARITY işlenmiş (A ve B) ve standart (C ve D) retinalarda yapıldı. Z istiflenmiş görüntüler konfokal (A ve C) ve floresan mikroskopisi (B ve D) kullanılarak çekildi. Her görüntüdeki tek bir optik düzlemden gelen bir kesici uç, muhtemelen akson benzeri işlemlerden oluşan halka benzeri yapıları vurgular. Ok uçları DAC somata'yı gösterir ve CLARITY işlenmiş retinalarda(A ve B)ortaya çıkan dendritlerin ve akson benzeri işlemlerin yoğun pleksusunda birçok halka benzeri yapı görülebilir (örnekler oklarla gösterilir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Modifiye CLARITY, ince dendritik yapıların ve sinaptik proteinlerin gelişmiş 3D çözünürlüğünü sağlar. TH, GluA2 ve PSD-95'e karşı antikorlarla CLARITY ile işlenmiş tam mount retinalarda üçlü immünostaining yapıldı. Birim işleme z-yığılmış konfokal görüntülemeden yeniden inşa edildi ve açılı bir X-Z yönünde sunuldu. A: İç nükleer tabakada TH etiketli DAC somata (ok uçları) ve distal iç pleksiform tabakada (kırmızı) tabakalaşma işlemleri (sarı oklar). Beyaz oklar dış retinaya doğru uzanan santrifüj işlemlerini gösterir. B: GluA2 içeren AMPA reseptörlerinin iç pleksiform tabaka (yeşil) boyunca yoğun dakik ifadesi. Ok, retina kan damarından gelen otofluoresansı gösterir. C: Puncta, PSD-95 tarafından iç pleksiform katmanda (mavi) etiketlenmiş post-sinaptik siteleri ortaya çıkarır. Oklar, PSD-95'e karşı fare monoklonal antikoru kullanımı nedeniyle belirgin olan kan damarlarını gösterir. D: GluA2 ve PSD-95 ifadesiyle TH etiketli DAC işlemlerinin çakışmasını gösteren kaplama görüntüsü. Birim görünümünün ölçeği 20 μm'lik artışlarla işaretlenmiştir.
Şekil 5. DAC'lerde GluA2 içeren AMPA reseptörlerinin sinaptik ekspresy ekspresyörü. Şekil 4'te gösterilen TH, GluA2 ve PSD-95'in putatif üçlü kolokalizasyon noktası seçildi ve 3D olarak incelendi. A1, X-Z yönlendirmesinde (A5) bir DAC işleminin (kırmızı) bir bölümünü temsil eder. A2 ve A3, aynı yönde sırasıyla tek bir GluA2 noktalama işareti (yeşil) ve PSD-95 noktalama işareti (mavi) gösterir. Birleştirilmiş görüntü (A4), TH, GluA2 ve PSD-95'in (ok) üçlü kolokalizasyonunu gösterir. B1-B4, Y-Z yönlendirmesinde (B5) aynı kolokalizasyon noktasını (ok) gösterir. C1-C4, X-Y düzleminde (C5) aynı noktanın (ok) kolokalizasyonunu gösterir. Üçlü kolokalizasyon her yönelimde açıkça görülmektedir. Ölçek çubuğu: 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| çözüm | kompozisyon | Notlar |
| 0,1 M PBS | 137 mM NaCl | pH'ı 7,4'e ayarla |
| 26,8 mM KCl | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | %4 akrilamid | Buz, aliquot üzerinde hazırlanın ve -20 ºC'de saklayın |
| 0,25% VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | %0,1 (v/v) Triton-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Engelleme çözümü | %2 NDS veya %1 BSA | |
| 0.01% Nan3 | ||
| PBST | ||
| 0.1 M Fosfat tamponu | 11,93 g Na2HPO4/litre | pH'ı 7,5'e ayarla |
| 15,34 g NaH2PO4/litre | ||
| ddH2O | ||
| sRIMS | %70 sorbitol | NaOH ile pH'ı 7,5'e ayarlayın |
| 0.1% ara-20 | ||
| 0.01% Nan3 | ||
| 0,02 M fosfat tamponu | ||
Tablo 1. Çözümlerin bileşimi.
| antikor | IHC | ev sahibi | Seyreltme | katalog # | tedarikçi | Ab kayıt defteri kimliği | hedef |
| Maviye duyarlı opsin | +3 | Keçi poliklonal | 1:1000 | SC-14363 | Santa Cruz Biyoteknolojisi | AB_2158332 | S-koni |
| Koni arrestin | +2 | Tavşan poliklonal | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | koni |
| Protein kinaz C alfa (PKC-α) | +3 | Tavşan poliklonal | 1:1000 | SC-208 | Santa Cruz Biyoteknolojisi | AB_2168668 | Çubuk bipolar hücre |
| Glial fibril asidik protein (GFAP) | +3 | Keçi poliklonal | 1:500 | SC-6170 | Santa Cruz Biyoteknolojisi | AB_641021 | Astrosit |
| Tirozin hidroksilaz (TH) | +3 | Koyun poliklonal | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Dopaminerjik amakrin hücre |
| Tirozin hidroksilaz (TH) | +2 | Tavşan poliklonal | 1:500 | OPA1-04050 | ThermoFisher | AB_325653 | Dopaminerjik amakrin hücre |
| Kolin asetiltransfenaz (ChAT) | +1 | Keçi poliklonal | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Yıldız patlaması amacrine hücresi |
| Çoklu birleştirmeli RNA bağlayıcı protein (RBPMS) | +1 | Gine domuzu poliklonal | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Retina ganglion hücresi |
| Glua2 | +3 | Tavşan poliklonal | 1:500 | AB1768-I | EMD Millipore | AB_2247874 | Ca2+geçirimsiz AMPA reseptör |
| Glua2 | +2 | Fare monoklonal | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Ca2+geçirimsiz AMPA reseptör |
| Postynaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95) | +3 | Fare monoklonal | 1:1000 | 75-028 | NöroMab | AB_2877189 | Sinaptik siteler |
| Fosfo-S6 (pS6) | 0 | Tavşan poliklonal | 1:500 | 44-923G | ThermoFisher | AB_2533798 | Hücre etkinliği işaretçisi |
Tablo 2. Test edilen primer antikorların özeti. IHC göstergesi: +3 = tutarlı, son derece spesifik boyama; +2 = sürekli olarak iyi boyama, minimum arka plan; +1 = iyi boyama, biraz arka plan; 0 = CLARITY ile uyumsuz.
| ev sahibi | Hedef türler | çekmek | Seyreltme | tedarikçi |
| eşek | Koyun karşıtı | Alexa Flor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| eşek | Koyun karşıtı | Alexa Flor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| eşek | Anti-tavşan | Alexa Flor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| eşek | Anti-tavşan | Alexa Flor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| keçi | Anti-tavşan | Alexa Flor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| eşek | Fare karşıtlığı | Alexa Flor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| eşek | Fare karşıtlığı | Alexa Flor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| eşek | Keçi karşıtı | Alexa Flor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| eşek | Keçi karşıtı | Alexa Flor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| keçi | Gine karşıtı domuz | Alexa Flor 488 | 1:500 | Invitrogen |
Tablo 3. Sekonder antikorların özeti test edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm montajlı retinalar için CLARITY protokolünün değiştirilmesi.
Daha önceki çalışmaların çoğunda kullanıldığı gibi vakum tahliyesi veya tahliye odasına ihtiyaç duymadan yeterli polimerizasyon elde etmek için CLARITY protokolünü basitleştirdik7,9,11. Polimerizasyon işlemi oksijen tarafından inhibe edilir ve protokolün polimerizasyon adımı sırasında numunenin havadan izole edilmesi gerekir. Bununla birlikte, azotla gaz çıkarmak yerine, numuneyi yağ ile örtmenin, daha önce belgelenmiş olduğu gibi, kapsamlı bir durulamadan sonra protokolün geri kalanını olumsuz etkilemeden polimerizasyona izin vermek için numuneyi yeterince izole ettiğini gördük12. Elektroforetik temizleme ile ilişkili doku kızaran ve doku yapısına zarar verme riskini sınırlamak için pasif bir temizleme yöntemi ile protokolü daha da basitleştirdik11. Pasif temizleme, nazik ajitasyon ve yüksek sıcaklık ile hızlanır ve sadece iki gün içinde tam doku temizlenmesine izin verir. Bu süre zarfında, hücresel yapı ve immünohistokimyasal lekelemenin ayrılmaz bir parçası olan proteinlerin ve diğer biyomoleküllerin kaybını en aza indirirken optik olarak şeffaf doku ile sonuçlanması için yeterli delipidasyon elde edilir.
CLARITY, retinal nöronların ve glial hücrelerin proteinlerini tam montaj preparatlarında korur.
Sonuçlarımız, test edilen antikorların neredeyse tamamının CLARITY işlenmiş retinalarda çalıştığını göstermektedir. Bu antikorlar fotoreceptörleri, bipolar hücreleri, amakrin hücreleri, RGC'leri ve glial hücreleri işaretler. Her retina nöron sınıfının alt tipleri için antikorları test edemesek de, sonuçlarımız CLARITY işlenmiş retinaların retinadaki hücresel belirteçlerin çoğu için kullanılabileceğini ima ediyor. Test ettiğimiz antikorların çoğu CLARITY olmayan işlenmiş retinalarda da immünostain retina nöronları yapabilse de, CLARITY'nin retinanın derin dokusuna yeterli antikor penetrasyonuna izin verdiğini ve retinanın orta tabakasında lekelenmenin iyi bir özgüllüğünü sağladığını gördük. Ek olarak, CLARITY'nin retinanın kalınlığı boyunca ışık penetrasyonunu iyileştirdiğini, ışık saçılmasını azalttığını ve en derin katmanlardan bile yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin verdiğini gördük. Bu faktörler, CLARITY tarafından işlenen tam montajlı retinalarda clarity standardı olmayan tam montajlı IHC13'ekıyasla hem boyama hem de görüntülemede iyileşmeye katkıda bulunur. Azaltılmış arka plan ve geliştirilmiş 3D görüntüleme ve hacim işlemeleri, retina kalınlığı boyunca tüm katmanlarda hücresel yapıların tam bir şekilde araştırılmasını sağlar.
CLARITY, tüm montajlı retinalarda DAC'lerin ince süreçlerini ve sinaptik yapısını ortaya koymaktadır.
Sonuçlarımız, DAC'lerin halka benzeri yapılarının ve santrifüj süreçlerinin CLARITY-işlenmiş olarak CLARITY olmayan tam montajlı retinalara göre daha iyi ortaya olduğunu göstermektedir. Özellikle CLARITY işlenmiş doku ile immünostaining, konfokal görüntülemeye gerek kalmadan standart floresan mikroskopi ile bile bu ince yapıların iyi çözülmesini sağlar. DAC'lerin görsel işlevdeki önemi göz önüne alındığında, CLARITY hazırlığı, DAC'lerin normal retinalardaki yapılarını ve hastalıklı koşullarda morfolojik değişiklikleri araştırmak için kullanılabilir.
Standart kepekli doku ile PSD-95 ve GluA2 için immünostaining üzerine, retinanın derin katmanlarında bu hücre altı yapıların etiketlenmediğini çok az veya hiç gözlemlemedik, bu da zayıf antikor penetrasyonunu gösteriyordu. CLARITY protokolünün uygulanması, bu proteinlerin iç retina katmanlarında belirgin bir şekilde lekelenerek derin dokuya gelişmiş antikor penetrasyonunu gösterir. Sonuçlarımız, CLARITY'nin normalde dikey dilim preparatlarında gözlenen tam montajlı retinalarda DAC proseslerinde sinaptik proteinlerin tespit edilmesine izin verdiğini göstermektedir6. Axon benzeri işlemler dikey dilimlerdeki dendritlerden ayırt edilemediğinden, CLARITY tam montajlı retinalar, dendritlerde, akson benzeri işlemlerde veya her ikisinde de 5,6gibi diğer nöronlardan DAC'lere sinaptik girişlerinoluşupoluşmadığını belirlemek için bir fırsat sağlar. AMPA reseptörleri ve PSD-95 proteinleri IPL boyunca yaygın olarak dağıtıldığından, bu proteinlerin DAC'ler üzerindeki ifadesi, diğer retina nöronlarındaki sinaptik proteinlerin tanımlanmasında kullanılacak CLARITY retinaları için mükemmel bir örnek oluşturur.
Tüm montajlı retinalar için CLARITY protokolünün dikkat edilmesi gereken noktalar, sınırlamalar ve gelecekteki uygulamaları.
İlk olarak, CLARITY ile işlenmiş tam montajlı retinalar için polimerizasyon ve temizleme protokolleri doku hazırlama işlemine birkaç gün ekler. Bununla birlikte, netleştirilmiş retinaların sodyum azit içeren PBS'de en az doku bozulması ile iki haftaya kadar saklanabilmesi nedeniyle yöntem hala son derece pratik hale getirilir. İkinci olarak, CLARITY7,11'inönceki uygulamalarında belgelendiği gibi temizleme işlemi boyunca dokunun bir miktar genişlemesi gözlenmiştir. Bununla birlikte, retinanın kırma indeksi eşleştirme çözeltisi ile dengede yaklaşık orijinal boyuta geri döndüğünü gördük. Doku hacmindeki olası küçük değişiklikler hücresel veya hücre altı yapı7,11'deönemlibozulmalaraneden olmayabilir. Üçüncüsü, daha kalın beyin örneklerini görüntülerken, mikroskop hedefi genellikle mikroskop lensinden doku12aracılığıyla tam kırılma indeksi eşleşmesine izin vermek için doğrudan montaj ortamına daldırılır. Retina gibi daha ince örneklerle, örnekleri daha düz ve hatta görüntüleme için daha düz hale getirmek için montaj için kapaklar kullandık. Kapak kapağından kırılmanın görüntüleme üzerindeki etkileri minimum gibi görünmektedir. Dördüncüsü, bazı görüntülerimiz spesifik olmayan kan damarı lekelerini göstermektedir, çünkü gözleri emmeden önce tüm hayvanı intrakardiyak perfüzyonla (spesifik olmayan lekeleri önlemek için kullanılması önerilir) boğmadık. Son olarak, fareler için uyarlanmış mevcut protokol diğer türlerin retinaları için kullanılabilir. Özellikle, köpekler, domuzlar, atlar ve primatlar gibi büyük hayvanların retinaları farelerden çok daha kalındır. Bu CLARITY protokolü, lipitlerin çıkarılmasından sonra bu hayvanların retinalarını daha optik olarak şeffaf hale getirebilir ve retina nöronlarının ince yapılarını ve bağışıklık sistemi için proteinlerini koruyabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Teknik destek için Bing Ye, Nathan Spix ve Hao Liu'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeleri Enstitüsü EY022640 (D.-Q.Z.) ve Oakland Üniversitesi Provost Lisans Öğrenci Araştırma Ödülü (E.J.A.) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
