Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.
Abstract
Die Gewebehydrogel-Delipidationsmethode (CLARITY), die ursprünglich vom Deisseroth-Labor entwickelt wurde, wurde modifiziert und häufig für die Immunfärbung und Bildgebung dicker Gehirnproben verwendet. Diese fortschrittliche Technologie wurde jedoch noch nicht für ganz montierte Netzhäute verwendet. Obwohl die Netzhaut teilweise transparent ist, begrenzt ihre Dicke von etwa 200 μm (bei Mäusen) immer noch das Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe und reduziert die Lichtdurchdringung für hochauflösende Bildgebung. Hier haben wir die CLARITY-Methode für ganz montierte Maus-Netzhäute angepasst, indem wir sie mit einem Acrylamidmonomer zu einem nanoporösen Hydrogel polymerisiert und dann in Natriumdodecylsulfat räten, um den Proteinverlust zu minimieren und Gewebeschäden zu vermeiden. CLARITY-verarbeitete Netzhäute wurden mit Antikörpern für Netzhautneuronen, Gliazellen und synaptische Proteine immungefärbt, in einer Brechungsindex-Matching-Lösung montiert und abgebildet. Unsere Daten zeigen, dass CLARITY die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und Bildgebung für Netzhautneuronen und Gliazellen in der Ganzkörperpräparation verbessern kann. So wurde beispielsweise die 3D-Auflösung feiner axonartiger und dendritischer Strukturen dopaminerger Amakrinzellen durch CLARITY deutlich verbessert. Im Vergleich zu nicht verarbeiteten Ganzkörper-Netzhäuten kann CLARITY eine Immunfärbung für synaptische Proteine wie postsynaptisches Dichteprotein 95 aufdecken. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CLARITY die Netzhaut nach der Entfernung von Lipiden optisch transparenter macht und feine Strukturen von Netzhautneuronen und deren Proteinen bewahrt, die routinemäßig zur hochauflösenden Abbildung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen in der Ganzlagervorbereitung verwendet werden können.
Introduction
Die Netzhaut von Wirbeltieren ist vielleicht der zugänglichste Teil des zentralen Nervensystems (ZNS) und dient als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Entwicklung, Struktur und Funktion des Gehirns. Fünf Klassen von Neuronen in der Netzhaut sind in drei Kernschichten verteilt, die durch zwei plexiforme Schichten getrennt sind. Die äußere Kernschicht (ONL) besteht aus klassischen Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen), die Licht in elektrische Signale umwandeln. Elektrische Signale werden von Neuronen in der inneren Kernschicht (INL), einschließlich bipolarer, horizontaler und amakriner Zellen, verarbeitet und dann an retinale Ganglienzellen (RGCs) in der Ganglienzellschicht (GCL) übertragen. RGCs sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut, wobei die Axone auf das Gehirn projizieren, um zur bildbildenden und nicht bildbildenden visuellen Funktion beizutragen. Darüber hinaus versorgen drei Arten von Gliazellen (Müllerzellen, Astroglia und Mikroglia) Neuronen mit Nährstoffen und schützen Neuronen vor schädlichen Veränderungen in ihrer extrazellulären Umgebung.
Eine spezialisierte Subpopulation von amakrinen Zellen produziert und setzt Dopamin frei, einen wichtigen Neuromodulator im ZNS, der die neuronalen Schaltkreise der Netzhaut während der Lichtanpassung neu konfiguriert1,2. Dopaminerge Amakrinzellen (DACs) haben eine einzigartige Eigenschaft morphologischer Profile. Ihre Somata befinden sich im proximalen INL mit Dendriten, die sich im distalsten Teil der inneren plexiformen Schicht (IPL) verzweigen. Axonähnliche Prozesse von DACs sind unmyeliniert, dünn und lang, spärlich verzweigt und tragen Krampfadern (die Stellen der Dopaminfreisetzung). Sie bilden einen dichten Plexus mit Dendriten im IPL, einschließlich ringförmiger Strukturen um die Somata von AII-Amakrinzellen. Die Axone verlaufen auch durch das INL in Richtung OPL und bilden einen Zentrifugalweg über die Netzhaut3. Wir haben gezeigt, dass DAC-Prozesse Rezeptoren als Reaktion auf die Freisetzung von Glutamat aus präsynaptischen Neuronen, einschließlich bipolarer Zellen und intrinsisch lichtempfindlicher retinaler Ganglienzellen (ipRGCs)exprimieren 4,5,6. Es ist jedoch unklar, ob Glutamatrezeptoren auf die Axone, Dendriten oder beides exprimieren, da sie in vertikalen Netzhautabschnitten abgeschnitten sind und nicht voneinander unterschieden werden können5,6. Die Immunfärbung muss in ganzgedeckten Netzhäuten durchgeführt werden, um eine dreidimensionale Verzweigung von DACs und das Vorhandensein von Glutamatrezeptoren auf subzellulären Kompartimenten aufzudecken. Obwohl die Netzhaut relativ transparent ist, beträgt die Dicke einer Maus-Netzhaut etwa 200 μm, was das Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe begrenzt und die Lichtdurchdringung für hochauflösende Bildgebung aufgrund der Gewebelichtstreuung reduziert. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir die immunstaining-kompatible Gewebehydrogel-Delipidationsmethode (CLARITY) angepasst, die kürzlich für dicke Hirnschnitte entwickelt wurde, um die Netzhaut der Maus ganz zu montieren7.
Die CLARITY-Methode wurde ursprünglich vom Deisseroth-Labor zur Immunfärbung und Bildgebung dicker Hirnproben entwickelt7. Es verwendet ein starkes Reinigungsmittel, Natriumdodecylsulfat (SDS) und Elektrophorese, um die Lipidkomponenten (die Gewebelichtstreuung verursachen) zu entfernen und die Proteine und Nukleinsäuren an Ort und Stelle zu lassen. Die entfernten Lipide werden durch ein transparentes Gerüst aus Hydrogelmonomeren wie Acrylamid ersetzt, um die verbleibende Proteinstruktur zu unterstützen. Das gereinigte Gewebe kann immunhistochemisch markiert und mit deutlich erhöhter Lichteindringtiefe durch das Gewebe (bis zu mehreren Millimeter unter der Gewebeoberfläche) abgebildet werden. Seitdem wurde die CLARITY-Methode von mehreren Forschungsgruppen 8 ,9,10optimiert und vereinfacht. Ein modifiziertes CLARITY-Protokoll verwendet eine passive Clearing-Technik, um die möglichen Gewebeschäden zu vermeiden, die durch Elektrophorese zur Beseitigung des gesamten Gehirns und anderer intakter Organe verursacht werden11. Diese Methode wurde jedoch noch nicht auf ganz montierte Netzhäute angewendet. Hier haben wir die passive CLARITY-Technik für Ganzkörper-Netzhäute angepasst, um sie für die Immunhistochemie und Bildgebung transparenter zu machen. Wir fanden heraus, dass ein Großteil der getesteten Netzhautproteine während dieses Prozesses für die Immunhistochemie erhalten blieb. Mit der Brechungsindex-Matching-Lösung konnten wir Netzhautneuronen über die etwa 200 μm Dicke von der ONL bis zur GCL in ganz montierten Netzhäuten abbilden.
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Protocol
Die Mauspflege und alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health für Labortiere durchgeführt und von den Institutional Animal Care and Use Committees der Oakland University genehmigt (Protokoll Nr. 18071).
HINWEIS: Die Namen der Lösungen und ihre Zusammensetzungen sind in Tabelle 1aufgeführt.
1. Gewebevorbereitung
- Euthanisieren Sie die Maus mit einer Überdosis CO2, gefolgt von zervikaler Dislokation.
- Die Augen mit einer gekrümmten Zette verschließen und in eine kleine Petrischale mit 0,1 M PBS überführen (Tabelle 1). Unter einem Seziermikroskop mit einer Nadel ein kleines Loch entlang der Hornhaut-Sklera-Verbindung stechen. 1 Stunde lang auf 4% Paraformaldehyd (PFA) übertragen.
- Übertragen Sie das Auge zurück auf eine Schüssel mit PBS. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine Dissektionsschere, um den ganzen Weg um die Hornhaut-Sklera-Verbindung zu schneiden. Hornhaut und Linse entfernen. Schneiden Sie an der Basis des Sehnervs und schälen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Zette ab, um die Netzhaut zu isolieren.
- Machen Sie vier kleine Schnitte gleichmäßig um die Netzhaut und verwenden Sie eine feine Spitzenbürste, die in PBS getaucht ist, um sie flach (GCL-Seite nach unten) in einer kleeartigen Form auf einen kleinen quadratischen Schnitt aus Nitrocellulose-Filterpapier zu legen, um die Netzhaut zu stabilisieren.
- Übertragen Sie die Netzhaut mit einer Zette, um die Ecke des Nitrocellulosepapiers zu halten (ohne die montierte Netzhaut zu berühren) und legen Sie sie für 1 Stunde in eine 48-Well-Platte mit 4% PFA.
- Filterpapier und Netzhaut mit PBS in einen Brunnen geben und waschen (3x für je 5 min).
- Auf A4P0 (Tabelle 1) umstellen und über Nacht bei 4 °C unter sanftem Rühren inkubieren.
- Pipette Pflanzenöl in den Brunnen, um die A4P0-Lösung vollständig abzudecken. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 40 °C für 3 Stunden ohne Schütteln.
- Waschen Sie (3x für jeweils 5 min) in PBS und stellen Sie sicher, dass das gesamte Öl abgespült wurde. Verwenden Sie bei Bedarf ein Pipett, um das verbleibende Öl vor dem letzten Spülen vorsichtig von der Oberseite des Bohrplatzes zu entfernen.
- Inkubieren Sie in 10% SDS bei 40 °C für zwei Tage unter sanftem Schütteln. Ersetzen Sie SDS am zweiten Tag durch eine frische Lösung.
- Filterpapier und Netzhaut mit Triton-X-100 (PBST, Tabelle 1)auf PBS übertragen und waschen (5x für je 1,5 h).
- Bei 4 °C in PBST mit 0,01% Natriumazid(NaN3) lagernoder direkt zur Immunfärbung übergehen.
2. Immunfärbung und Brechungsindex-Matching
- Entfernen Sie die Netzhaut vom Filterpapier, indem Sie sie vorsichtig mit einem feinen Spitzenpinsel in PBST abziehen.
- Inkubieren Sie die Netzhaut in primärem Antikörper (Tabelle 2) verdünnt in Blocklösung (Tabelle 1) für 2 Tage bei 40 °C unter sanftem Schütteln.
- Waschen (5x, je 1,5 h) in PBST.
- Mit den entsprechenden sekundären Antikörpern (Tabelle 3) in Blockierungslösung verdünnt für 2 Tage bei 40 °C unter sanftem Schütteln inkubieren und während des restlichen Verfahrens vor Licht schützen.
- Waschen (5x, je 1,5 h) in 0,02 M Phosphatpuffer (siehe Tabelle 1).
- Inkubieren Sie in Sorbit-basierter Refractive Index Matching Solution (sRIMS, siehe Tabelle 1)bei 40 °C über Nacht unter sanftem Schütteln.
3. Montage
- Umreißen Sie einen 18 mm x 18 mm x 1,5 mm großen Glasdeckel mit einem feinen Permanentmarker, um eine quadratische Grenze auf der Rückseite eines Glasmikroskopobjektträgers zu markieren.
- Drehen Sie den Schieber um und verwenden Sie eine Spritze, um die Grenze mit einer dünnen Linie silikonfett auf der Vorderseite des Schlittens zu verfolgen, wobei ein kleiner Spalt in einer Ecke für überschüssige Montagelösung bleibt.
- Die Netzhaut in die Mitte des begrenzten Bereichs übertragen und mit einem Feinspitzenpinsel so anordnen, dass sie flach mit der Photorezeptorseite gegen den Glasträger liegt.
- Pipette ca. 60 μL sRIMS, so dass es die abgeflachte Netzhaut bedeckt und sich bis zu einer Ecke des Gehäuses erstreckt, wobei darauf geachtet wird, dass die Netzhaut flach und an Ort und Stelle bleibt.
- Tragen Sie den Abdeckverschluss ab der Ecke mit dem sRIMS auf und senken Sie ihn langsam ab, bis er das Fett auf allen Seiten berührt, wodurch die Bildung von Luftblasen vermieden wird.
- Platzieren Sie einen Stapel von 3 Abdecklippen auf jeder Seite der montierten Netzhaut als Abstandhalter. Verwenden Sie die lange Kante eines anderen Schlittens, um den Abdeckrutsch nach unten zu drücken, so dass die Halterung flach und gleichmäßig ist.
- Dias flach bei 4 °C bis zur Bildgebung aufbewahren.
4. Bildgebung
- Bildproben entweder auf einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop (Materialverzeichnis). Beginnen Sie, indem Sie den Objektträger auf den Mikroskopstand legen und die Probe lokalisieren.
HINWEIS: Wenn ein invertiertes Objektivmikroskop verwendet wird, legen Sie den Objektträger kopfüber auf die Bühne und stellen Sie zunächst sicher, dass die exponierten Bereiche des Objektträgers frei von Silikonfett und Montagelösung sind. - Um z-gestapelte Bilder von co-markierten Proben zu erhalten, konzentrieren Sie sich zunächst auf das Signal in jedem Kanal einzeln und stellen Sie die Belichtungszeit bzw. Scangeschwindigkeit für Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope ein.
- Legen Sie den Bereich für den Z-Stapel fest, indem Sie entweder die Fokusebene oben und unten im gewünschten Bereich manuell einstellen oder indem Sie den Mittelpunkt festlegen und dann einen Bereich um den Mittelpunkt angeben.
- Passen Sie die Schrittgröße oder die Anzahl der Slices wie gewünscht an.
- Erfassen Sie das Bild und speichern Sie die Originaldatei sowie exportieren Sie sie als TIFF-Datei oder ein anderes gewünschtes Format.
5. Bildanalyse
- Verwenden Sie die Bildanalysesoftware Ihrer Wahl (Table of Materials), um die Helligkeit und den Kontrast in jedem Kanal anzupassen, bis sowohl in den Einzelbildern als auch im 3-dimensionalen Rendering des Z-Stacks eine optimale Klarheit erreicht ist.
HINWEIS: Wenn die gewählte Schrittgröße ausreichend klein ist, kann auch eine 3D-Dekonvolution durchgeführt werden, um das Signal zu verbessern.
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Representative Results
Modifizierte CLARITY-verarbeitete Netzhäute sind optisch transparentes Gewebe.
Um eine Gewebereinigungsmethode zu formulieren, die mit immunhistochemischen Anwendungen in der Netzhaut kompatibel ist und gleichzeitig eine ausreichende Entspeiung bietet und die strukturelle Integrität der zellulären Proteine beibehält, haben wir die CLARITY-Gewebereinigungsmethode an die Netzhaut von Mäusen angepasst. Wir konnten das Protokoll vereinfachen und für ganz montierte Netzhäute modifizieren (siehe Protokoll). Nach Abschluss der Gewebehybridisierung, der Klärung und des Brechungsindexabgleichs zeigten netzhautverarbeitete Netzhäute, die mit diesem modifizierten CLARITY-Protokoll verarbeitet wurden, eine nahezu vollständige optische Transparenz über die dicke der Netzhaut (Abbildung 1A) im Vergleich zu nicht verarbeiteten Kontroll-Netzhäuten (Abbildung 1B). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass diese Modifikation des CLARITY-Protokolls ausreichend gereinigtes Netzhautgewebe auf ganzer Montierung liefert.
Verbesserte 3D-Bildgebung von Neuronen in modifizierten CLARITY-verarbeiteten Netzhäuten.
Um die Qualität und Praktikabilität der immunhistochemischen Färbung durch diese modifizierte CLARITY-Methode zu bewerten, haben wir CLARITY verarbeitete Netzhäute mit verschiedenen primären Antikörpern gefärbt (Tabelle 2). Diese Antikörper markieren jeden wichtigen Zelltyp in der Netzhaut: Zapfenphotorezeptoren, bipolare Stäbchenzellen, amakrine Zellen, RGCs und Gliazellen sowie Antikörper gegen subzelluläre synaptische Proteine. Mit Ausnahme des Zellaktivitätsmarkers phospho-S6 (pS6) erwiesen sich alle getesteten Antikörper als kompatibel mit CLARITY. Typische Beispiele sind in Abbildung 2dargestellt. Wir führten eine dreifache Markierung mit Antikörpern gegen Zapfenarregin, Tyrosinhydroxylase (TH) und RNA-bindendes Protein mit Multiple Splicing (RBPMS) durch. Wir haben eineReihe von konfokalen z-Stack-Mikroskopiebildern vom ONL zum GCL gemacht. Einzelbilder zeigten die Arrestin-markierten Zapfen in der ONL (Abbildung 2A), TH-markierte DACs im INL (Abbildung 2B) und RBPMS-markierte RGCs in der GCL (Abbildung 2C). Ein Overlay-Bild zeigte die relative Position dieser Neuronen über die gesamte Dicke der Netzhaut (Abbildung 2D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CLARITY die Qualität vieler immunhistochemischer Standardfärbungen verbessern und die 3D-Struktur von Neuronen über die gesamte Dicke der Netzhaut in Ganzkörperpräparaten deutlich aufdecken kann.
Modified CLARITY bietet eine verbesserte 3D-Auflösung feiner Prozesse von Netzhautneuronen und synaptischen Proteinen.
Wir analysierten die TH-Färbung in CLARITY-verarbeiteten Ganzhaut netzhaut (Abbildungen 3A, B) und verglichen sie mit der Bildgebung aus der Standard-Ganzmontagevorbereitung (Abbildungen 3C, D). Konfokale Bilder zeigen, dass Dendriten und axonartige Prozesse von DACs in einer CLARITY-verarbeiteten Netzhaut (Abbildung 3A) viel deutlicher aufgedeckt wurden als in einer Standard-Netzhaut (Abbildung 3C). Insbesondere axonartige Prozesse von DACs wiesen in einer CLARITY-Netzhaut (siehe ein Insert in Abbildung 3A)vollständigere ringartige Strukturen auf als in einer Standard-Netzhaut (siehe Insert in Abbildung 3C). Bemerkenswerterweise waren ringförmige Strukturen einer CLARITY-Netzhaut, die mittels Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 3B) aufgenommen wurden, fast identisch mit denen, die mit konfokalen beobachtet wurden (Abbildung 3A). Darüber hinaus liefen axonartige Prozesse auch in Richtung der äußeren Netzhaut, was in X-Z-orientierten Bildern beobachtet wurde (Abbildung 4A). Diese Daten deuten darauf hin, dass CLARITY verwendet werden kann, um axonähnliche Prozesse von DACs in ganz mount Netzhäuten auch mit konventioneller Fluoreszenzmikroskopie zu identifizieren.
Als die AMPA-Rezeptor-Untereinheit GluA2 und das postsynaptische Dichteprotein 95 (PSD-95) in Standard-Ganzhaut untersucht wurden, wurde keine von ihnen nachgewiesen, wahrscheinlich aufgrund des schlechten Eindringens von Antikörpern gegen diese synaptischen Proteine in die tiefe Netzhaut. Um festzustellen, ob CLARITY-verarbeitete Netzhäute es diesen Antikörpern ermöglichen, synaptische Proteine zu immunisieren, haben wir TH mit der Untereinheit GluA2 und PSD-95 dreifach markiert. Die Immunfärbung gegen GluA2 und PSD-95 zeigte eine ausgeprägte Punktkta, die einzelne GluA2-haltige AMPA-Rezeptoren (Abbildung 4B) bzw. mutmaßliche postsynaptische Stellen (Abbildung 4C) aufdeckte. Ein Overlay-Bild zeigte einige Punkte, die auf DAC-Prozessen sichtbar waren (Abbildung 4D). Wir haben einen Punkt der mutmaßlichen Kolokalisierung mit allen drei Flecken abgebildet und in 3D-Ansichten dargestellt (Abbildung 5). Aus allen drei Ansichten kolokalisierte TH deutlich mit GluA2 und PSD-95 (Abbildung 5 A-C). Diese 3D-perspektivischen Ergebnisse von Netzhäuten bestätigen unsere früheren Berichte über die synaptische Expression von GluA2-haltigen AMPA-Rezeptoren auf DAC-Prozessen in vertikalen Netzhautscheiben5,6.
Abbildung 1. CLARITY liefert optisch transparentes Gewebe. Die Netzhaut der Ganzen Maus wurde mit der modifizierten CLARITY-Methode (siehe Protokoll) verarbeitet und die gesamte Netzhaut mit einem Dissektionsmikroskop abgebildet, das auf einem 0,67 cm großen quadratischen Raster überlagert wurde, um den Maßstab zu zeigen. A: CLARITY-verarbeitete Netzhaut mit ganzen Strängen, mit Gitterlinien, die durch das transparente Gewebe deutlich sichtbar sind. Pfeile zeigen die Platzierung der Netzhaut. B: Nicht CLARITY-verarbeitete Kontrollnetzhaut, die für 1 h in PFA fixiert und in PBS inkubiert wird. Gitterlinien werden durch die relative Opazität des Gewebes verdeckt. Maßstabsleiste: ca. 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Verbesserte 3D-Bildgebung von Neuronen über die Dicke der Netzhaut in CLARITY-verarbeiteten Netzhäuten. Whole-Mount CLARITY Netzhäute wurden mit Antikörpern gegen Zapfenarrest, TH und RBPMS immungefärbt. Das Bild stellt ein 3D-Volumen-Rendering eines z-gestapelten konfokalen Bildes dar, das in einer X-Z-Ausrichtung angezeigt wird. A: Zapfenphotorezeptoren (Pfeil), die mit Kegelarrest (blau) gekennzeichnet sind. Ein leichter Fleck ist in der inneren Netzhaut (Pfeilspitzen) sichtbar, wahrscheinlich aufgrund von Hintergrundflecken. B: DAC-Soma und Dendriten (Pfeil) mit TH (rot) gekennzeichnet. Pfeilspitzen zeigen retinale Blutgefäße in der inneren Netzhaut an, die durch die Multi-Label-Immunfärbung sichtbar sind. C: RGC-Somata (Pfeil) mit RBPMS (grün) gekennzeichnet. Pfeilspitzen zeigen retinale Blutgefäße an, die aufgrund von Autofluoreszenz und unspezifischer Färbung von Blutgefäßen sichtbar sind. D: Zusammengeführtes Bild der dreifach markierten Färbung, das die relative Platzierung dieser Neuronen über die Dicke der Netzhaut zeigt, mit Zapfenphotorezeptoren in der äußeren Kernschicht, DACs in der inneren Kernschicht und RGCs in der Ganglienzellschicht. Die Skala der Volumenansicht ist in Schritten von 20 μm markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. CLARITY zeigt feine Strukturen der DAC-Morphologie. Die TH-Immunfärbung wurde in CLARITY-verarbeiteten (A und B) und Standard -C und D) Netzhäuten durchgeführt. Z-gestapelte Bilder wurden mit konfokaler (A und C) und Fluoreszenzmikroskopie (B und D) aufgenommen. Ein Insert aus einer einzigen optischen Ebene in jedem Bild hebt ringförmige Strukturen hervor, die vermutlich durch axonartige Prozesse gebildet werden. Pfeilspitzen zeigen DAC-Somata an, und viele ringförmige Strukturen sind sichtbar (Beispiele sind durch Pfeile gekennzeichnet) im dichten Plexus von Dendriten und axonähnlichen Prozessen, die in CLARITY-verarbeiteten Netzhäuten (A und B) aufgedeckt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Modified CLARITY bietet eine verbesserte 3D-Auflösung feiner dendritischer Strukturen und synaptischer Proteine. Die dreifache Immunfärbung wurde in CLARITY-verarbeiteten Ganzkörper-Netzhäuten mit Antikörpern gegen TH, GluA2 und PSD-95 durchgeführt. Ein Volumen-Rendering wurde aus z-gestapelten konfokalen Abbildungen rekonstruiert und in einer abgewinkelten X-Z-Ausrichtung dargestellt. A: TH-markierte DAC-Somata (Pfeilspitzen) in der inneren Kernschicht und Prozesse (gelbe Pfeile), die sich in der distalen inneren plexiformen Schicht (rot) schichten. Weiße Pfeile zeigen zentrifugale Prozesse an, die sich in Richtung der äußeren Netzhaut erstrecken. B: Dichte punktuelle Expression von GluA2-haltigen AMPA-Rezeptoren über die innere plexiforme Schicht (grün). Arrow zeigt Autofluoreszenz aus einem retinalen Blutgefäß an. C: Puncta zeigt postsynaptische Stellen, die mit PSD-95 in der inneren plexiformen Schicht (blau) markiert sind. Pfeile zeigen Blutgefäße an, die aufgrund der Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der Maus gegen PSD-95 sichtbar sind. D: Overlay-Bild, das die Überlappung der TH-gekennzeichneten DAC-Prozesse mit der Expression von GluA2 und PSD-95 zeigt. Die Skala der Volumenansicht ist in Schritten von 20 μm markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Synaptische Expression von GluA2-haltigen AMPA-Rezeptoren auf DACs. Ein in Abbildung 4 gezeigter Punkt der mutmaßlichen Dreifachen Kolokalisierung von TH, GluA2 und PSD-95 wurde ausgewählt und in 3D untersucht. A1 stellt ein Segment eines DAC-Prozesses (rot) in der X-Z-Ausrichtung (A5) dar. A2 und A3 zeigen ein einzelnes GluA2-Punctum (grün) bzw. PSD-95-Punctum (blau) in der gleichen Ausrichtung. Das zusammengeführte Bild (A4) zeigt die dreifache Kolokalisation von TH, GluA2 und PSD-95 (Pfeil). B1-B4 zeigen den gleichen Kolokalisationspunkt (Pfeil) in einer Y-Z-Ausrichtung (B5). C1-C4 zeigen die Kolokalisierung desselben Punktes (Pfeil) in der X-Y-Ebene (C5). Die dreifache Kolokalisierung ist in jeder Ausrichtung deutlich erkennbar. Maßstabsleiste: 2 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung | Zusammensetzung | Notizen |
| 0,1 M PBS | 137 mM NaCl | pH-Wert auf 7,4 einstellen |
| 26,8 mM KCl | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% Acrylamid | Auf Eis vorbereiten, aliquot und bei -20 ºC lagern |
| 0,25% VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | 0,1% (v/v) Triton-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Blockierungslösung | 2% NDS oder 1% BSA | |
| 0,01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| 0,1 M Phosphatpuffer | 11,93 g Na2HPO4/Liter | pH-Wert auf 7,5 einstellen |
| 15,34 g NaH2PO4/Liter | ||
| ddH2O | ||
| sRIMS | 70% Sorbit | Passen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,5 an |
| 0,1% Tween-20 | ||
| 0,01% NaN3 | ||
| 0,02 M Phosphatpuffer | ||
Tabelle 1. Zusammensetzung der Lösungen.
| Antikörper | IHC | Gastgeber | Verdünnung | Katalog # | Lieferant | Ab Registrierungs-ID | Ziel |
| Blauempfindliches Opsin | +3 | Ziege polyklonal | 1:1000 | SC-14363 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_2158332 | S-Kegel |
| Kegel arrestin | +2 | Kaninchen polyklonal | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | Kegel |
| Proteinkinase C alpha (PKC-α) | +3 | Kaninchen polyklonal | 1:1000 | SC-208 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_2168668 | Bipolare Stabzelle |
| Gliafibrilläres saures Protein (GFAP) | +3 | Ziege polyklonal | 1:500 | SC-6170 | Santa Cruz Biotechnologie | AB_641021 | Astrozyt |
| Tyrosinhydroxylase (TH) | +3 | Schaf polyklonal | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Dopaminerge Amakrinzelle |
| Tyrosinhydroxylase (TH) | +2 | Kaninchen polyklonal | 1:500 | OPA1-04050 | ThermoFisher | AB_325653 | Dopaminerge Amakrinzelle |
| Cholinacetyltransferase (ChAT) | +1 | Ziege polyklonal | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Starburst Amakrinzelle |
| RNA-bindendes Protein mit Multiple Splicing (RBPMS) | +1 | Meerschweinchen polyklonal | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Ganglienzelle der Netzhaut |
| GluA2 | +3 | Kaninchen polyklonal | 1:500 | AB1768-I | EMD Millipore | AB_2247874 | Ca2+-undurchlässiger AMPA-Rezeptor |
| GluA2 | +2 | Maus monoklonal | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Ca2+-undurchlässiger AMPA-Rezeptor |
| Postsynaptisches Dichteprotein 95 (PSD-95) | +3 | Maus monoklonal | 1:1000 | 75-028 | NeuroMab | AB_2877189 | Synaptische Seiten |
| Phospho-S6 (pS6) | 0 | Kaninchen polyklonal | 1:500 | 44-923G | ThermoFisher | AB_2533798 | Zellaktivitätsmarker |
Tabelle 2. Zusammenfassung der getesteten primären Antikörper. IHC-Legende: +3 = konsistente, hochspezifische Färbung; +2 = konstant gute Färbung, minimaler Hintergrund; +1 = gute Färbung, etwas Hintergrund; 0 = inkompatibel mit CLARITY.
| Gastgeber | Zielarten | konjugieren | Verdünnung | Lieferant |
| Esel | Anti-Schafe | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| Esel | Anti-Schafe | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| Esel | Anti-Kaninchen | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| Esel | Anti-Kaninchen | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| Ziege | Anti-Kaninchen | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| Esel | Anti-Maus | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| Esel | Anti-Maus | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| Esel | Anti-Ziege | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| Esel | Anti-Ziege | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| Ziege | Anti-Meerschweinchen | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
Tabelle 3. Zusammenfassung der getesteten sekundären Antikörper.
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Discussion
Modifikation des CLARITY-Protokolls für Ganzhaut.
Wir haben das CLARITY-Protokoll vereinfacht, um eine angemessene Polymerisation zu erreichen, ohne dass eine Vakuumevakuierungs- oder Austrocknungskammer erforderlich ist, wie es in den meisten früheren Studien verwendet wird7,9,11. Der Polymerisationsprozess wird durch Sauerstoff gehemmt, so dass die Probe während des Polymerisationsschritts des Protokolls aus der Luft isoliert werden muss. Anstatt jedoch mit Stickstoff zu entgasen, stellten wir fest, dass die Abdeckung der Probe mit Öl die Probe ausreichend isolierte, um eine Polymerisation zu ermöglichen, ohne den Rest des Protokolls nach einer gründlichen Spülung zu beeinträchtigen, wie zuvor dokumentiert12. Wir haben das Protokoll mit einer passiven Clearing-Methode weiter vereinfacht, um das Risiko einer Gewebebräunung und einer Schädigung der Gewebestruktur im Zusammenhang mit der elektrophoretischen Clearing zu begrenzen11. Die passive Reinigung wird durch sanftes Rühren und erhöhte Temperatur beschleunigt, so dass eine vollständige Gewebereinigung in nur zwei Tagen ermöglicht wird. Während dieses Zeitraums wird eine ausreichende Delipidierung erreicht, um zu optisch transparentem Gewebe zu führen und gleichzeitig den Verlust von Proteinen und anderen Biomolekülen zu minimieren, die für die Zellstruktur und die immunhistochemische Färbung von wesentlicher Wesentlicher sind.
CLARITY konserviert Proteine von Netzhautneuronen und Gliazellen in Ganzkörperpräparaten.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass fast alle getesteten Antikörper in CLARITY verarbeiteten Netzhäuten wirken. Diese Antikörper markieren Photorezeptoren, bipolare Zellen, amakrine Zellen, RGCs und Gliazellen. Obwohl wir nicht in der Lage waren, Antikörper auf Subtypen jeder Klasse von Netzhautneuronen zu testen, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass CLARITY-verarbeitete Netzhäute für die Mehrheit der zellulären Marker in der Netzhaut verwendet werden können. Obwohl die meisten Antikörper, die wir getestet haben, auch Netzhautneuronen in nicht VON CLARITY verarbeiteten Netzhäuten immunanstäuben können, fanden wir heraus, dass CLARITY ein ausreichendes Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe der Netzhaut ermöglichte, was eine gute Spezifität der Färbung in der mittleren Schicht der Netzhaut ermöglichte. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass CLARITY die Lichtdurchdringung in der gesamten Dicke der Netzhaut verbesserte, die Lichtstreuung reduzierte und eine hochauflösende Bildgebung selbst durch die tiefsten Schichten ermöglichte. Diese Faktoren tragen zu einer Verbesserung sowohl der Färbung als auch der Bildgebung in der CLARITY-verarbeiteten Ganz-Mount-Netzhaut im Vergleich zu Nicht-CLARITY-Standard-Whole-Mount-IHC13bei. Der reduzierte Hintergrund und die verbesserte 3D-Bildgebung und Volumenrenderings ermöglichen eine vollständige Untersuchung der Zellstrukturen über alle Schichten über die Dicke der Netzhaut hinweg.
CLARITY zeigt feine Prozesse und synaptische Struktur von DACs in ganzgebauten Netzhäuten.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass ringförmige Strukturen und Zentrifugalprozesse von DACs in CLARITY-verarbeiteten Netzhäuten besser aufgedeckt werden als in Nicht-CLARITY-Ganzhautnetzen. Insbesondere die Immunfärbung mit CLARITY-verarbeitetem Gewebe ermöglicht eine gute Auflösung dieser feinen Strukturen auch bei Standard-Fluoreszenzmikroskopie ohne konfokale Bildgebung. Angesichts der Bedeutung von DACs für die visuelle Funktion kann das CLARITY-Präparat verwendet werden, um die Strukturen von DACs in normalen Netzhäuten und morphologische Veränderungen unter erkrankten Bedingungen zu untersuchen.
Bei der Immunfärbung von PSD-95 und GluA2 mit Standard-Vollkörpergewebe beobachteten wir wenig bis gar keine Markierung dieser subzellulären Strukturen in den tiefen Schichten der Netzhaut, was auf eine schlechte Antikörperpenetration hindeutet. Die Anwendung des CLARITY-Protokolls ermöglicht eine eindeutige Färbung dieser Proteine in den inneren Netzhautschichten, was auf eine verbesserte Antikörperpenetration in das tiefe Gewebe hinweist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CLARITY den Nachweis synaptischer Proteine auf DAC-Prozessen in ganzgebauten Netzhäuten ermöglicht, was normalerweise in vertikalen Scheibenpräparaten beobachtet wird6. Da axonähnliche Prozesse nicht von Dendriten in vertikalen Scheiben unterschieden werden können, bieten CLARITY-Netzhäute die Möglichkeit zu bestimmen, ob synaptische Eingaben in DACs von anderen Neuronen wie bipolaren Zellen und ipRGCs in Dendriten, axonähnlichen Prozessen oder beiden5,6auftreten. Da AMPA-Rezeptoren und PSD-95-Proteine im gesamten IPL weit verbreitet sind, ist die Expression dieser Proteine auf DACs ein hervorragendes Beispiel für CLARITY-Netzhäute zur Identifizierung synaptischer Proteine in anderen Netzhautneuronen.
Überlegungen, Einschränkungen und zukünftige Anwendungen des CLARITY-Protokolls für Netzhäute auf ganzer Montierung.
Erstens fügen die Polymerisations- und Clearingprotokolle für CLARITY-verarbeitete Ganzkörper-Netzhäute dem Gewebevorbereitungsprozess mehrere Tage hinzu. Sehr praktisch wird die Methode jedoch immer noch dadurch, dass geklärte Netzhäute in Natriumazid-haltigem PBS bis zu zwei Wochen mit minimalem Gewebeabbau gelagert werden können. Zweitens wurde während des gesamten Clearingprozesses eine gewisse Ausdehnung des Gewebes beobachtet, wie in früheren Anwendungen von CLARITY7,11dokumentiert. Wir fanden jedoch heraus, dass die Netzhaut beim Gleichgewicht mit der Brechungsindex-Matching-Lösung auf ungefähr die ursprüngliche Größe zurückkehrte. Die möglichen geringfügigen Veränderungen des Gewebevolumens dürfen keine signifikante Verzerrung der zellulären oder subzellulären Struktur verursachen7,11. Drittens wird bei der Abbildung dickerer Hirnproben das Mikroskopobjektiv oft direkt in das Montagemedium eingetaucht, um eine vollständige Brechungsindexanpassung von der Mikroskoplinse durch das Gewebe zu ermöglichen12. Bei dünneren Proben wie der Netzhaut haben wir Coverlips für die Montage verwendet, um die Proben flacher und gleichmäßiger für die Bildgebung zu machen. Die Auswirkungen der Brechung durch den Coverslip scheinen auf die Bildgebung minimal zu sein. Viertens zeigen einige unserer Bilder unspezifische Blutgefäßfärbungen, weil wir das ganze Tier nicht mit intrakardianer Perfusion durchsässt haben (vorgeschlagen, um unspezifische Färbungen zu vermeiden), bevor wir die Augen enukleieren. Schließlich kann das aktuelle Protokoll, das für Mäuse angepasst ist, für Netzhäute anderer Arten verwendet werden. Insbesondere netzhautartiger Großtiere wie Hunde, Schweine, Pferde und Primaten sind viel dicker als die von Mäusen. Dieses CLARITY-Protokoll könnte die Netzhaut dieser Tiere nach der Entfernung von Lipiden optisch transparenter machen und die feinen Strukturen der Netzhautneuronen und ihrer Proteine für die Immunfärbung erhalten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Bing Ye, Nathan Spix und Hao Liu für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) und den Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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