Summary
Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.
Abstract
O método de delipidação de hidrogel de tecido (CLARITY), originalmente desenvolvido pelo laboratório Deisseroth, foi modificado e amplamente utilizado para imunossuagem e imagem de amostras cerebrais espessas. No entanto, esta tecnologia avançada ainda não foi usada para retinas de montagem inteira. Embora a retina seja parcialmente transparente, sua espessura de aproximadamente 200 μm (em camundongos) ainda limita a penetração de anticorpos no tecido profundo, bem como reduz a penetração de luz para imagens de alta resolução. Aqui, adaptamos o método CLARITY para retinas de camundongos de montagem inteira polimerizando-as com um monômero de acrilamida para formar um hidrogel nanoporoso e, em seguida, limpá-los em sulfato de dodecilo de sódio para minimizar a perda de proteína e evitar danos teciduais. As retinas processadas pela CLARIDADE foram imunossuídas com anticorpos para neurônios da retina, células gliais e proteínas sinápticas, montadas em uma solução de correspondência de índices refrativos e imagens. Nossos dados demonstram que a CLARITY pode melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens para neurônios da retina e células gliais em preparação de todo o suporte. Por exemplo, a resolução 3D de estruturas axônicas finas e dendríticas de células amacrinas dopaminérgicas foram muito melhoradas pela CLARITY. Em comparação com retinas de montagem integral não processadas, a CLARITY pode revelar imunossuagem para proteínas sinápticas, como a proteína de densidade pós-sináptica 95. Nossos resultados mostram que a CLARITY torna a retina mais opticamente transparente após a remoção de lipídios e preserva estruturas finas de neurônios da retina e suas proteínas, que podem ser rotineiramente usadas para obter imagens de alta resolução de neurônios da retina e suas estruturas subcelulares em preparação de todo o suporte.
Introduction
A retina vertebrada é talvez a parte mais acessível do sistema nervoso central (SNC), e serve como um excelente modelo para estudar o desenvolvimento, estrutura e função do cérebro. Cinco classes de neurônios na retina são distribuídos em três camadas nucleares separadas por duas camadas plexiformes. A camada nuclear externa (ONL) consiste em fotorreceptores clássicos (hastes e cones) que convertem luz em sinais elétricos. Os sinais elétricos são processados por neurônios na camada nuclear interna (INL), incluindo células bipolares, horizontais e amacrinas, e depois transmitidos para células gânglios da retina (RGCs) na camada celular de gânglio (GCL). Os RGCs são os neurônios de saída da retina, com os axônios projetando para o cérebro contribuir para a formação de imagens e função visual não-formadora de imagens. Além disso, três tipos de células gliais (células Muller, astroglia e microglia) fornecem nutrientes aos neurônios e protegem os neurônios de alterações nocivas em seu ambiente extracelular.
Uma subpopulação especializada de células amacrinas produz e libera dopamina, um importante neuromodulador no CNS, reconfigurando circuitos neurais da retina durante a adaptação da luz1,2. As células amacrinas dopaminérgicas (DACs) têm uma característica única de perfis morfológicos. Sua somata está localizada no INL proximal com dendritos ramificantes na parte mais distal da camada plexiforme interna (IPL). Os processos semelhantes ao Axon de DACs são nãoomiados, finos e longos, pouco ramificados e têm varizes (os locais de liberação de dopamina). Eles formam um plexo denso com dendritos no IPL, incluindo estruturas semelhantes a anel ao redor da somata de células amacrinas AII. Os axônios também atravessam o INL em direção ao OPL, formando uma via centrífuga através da retina3. Demonstramos que o DAC processa receptores expressos em resposta à liberação de glutamato de neurônios pré-sinápticos, incluindo células bipolares e células de gânglios intrinsecamente fotosensíveis da retina (ipRGCs)4,5,6. No entanto, não está claro se os receptores de glutamato expressam nos axônios, dendritos ou ambos, uma vez que são cortados em seções verticais de retina e não podem ser distinguidos uns dos outros5,6. A imunostaining precisa ser realizada em retinas de montagem inteira para revelar ramificações tridimensionais de DACs e a presença de receptores de glutamato em compartimentos subcelulares. Embora a retina seja relativamente transparente, a espessura de uma retina de montagem inteira de um rato é de aproximadamente 200 μm, o que limita a penetração de anticorpos no tecido profundo, bem como reduz a penetração de luz para imagens de alta resolução devido à dispersão da luz tecidual. Para superar essas limitações, adaptamos o método de delipidação de hidrogel de tecido compatível com imunosstaining (CLARITY) desenvolvido recentemente para seções cerebrais grossas para retinas de camundongos de montagem inteira7.
O método CLARITY foi originalmente desenvolvido pelo laboratório Deisseroth para imunossuagem e imagem de amostras cerebrais espessas7. Ele usa um detergente forte, sulfato de dodecila de sódio (SDS) e eletroforese para remover os componentes lipídicos (que causam dispersão de luz tecidual), deixando as proteínas e ácidos nucleicos no lugar. Os lipídios removidos são substituídos por um andaime transparente composto por monômeros de hidrogel, como acrilamida, para suportar a estrutura proteica restante. O tecido limpo pode ser rotulado através de imunohistoquímica e imageado com profundidade de penetração de luz substancialmente aumentada através do tecido (até vários milímetros abaixo da superfície do tecido). Desde então, o método CLARITY tem sido otimizado e simplificado por diversos grupos de pesquisa8,9,10. Um protocolo clarity modificado usa uma técnica de compensação passiva para evitar os possíveis danos teciduais produzidos pela eletroforese para limpar todo o cérebro e outros órgãos intactos11. No entanto, este método ainda não foi aplicado a retinas de montagem inteira. Aqui, adaptamos a técnica de CLARIDADE passiva para retinas de montagem integral para torná-las mais transparentes para a imunohistoquímica e a imagem. Descobrimos que a maioria das proteínas da retina testadas foram preservadas durante esse processo para imunohistoquímica. Usando a solução de correspondência de índices refrativos, fomos capazes de imaginar neurônios de retina através da espessura de aproximadamente 200 μm do ONL para o GCL em retinas de montagem inteira.
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Protocol
O cuidado com o rato e todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para animais de laboratório e foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oakland (protocolo nº 18071).
NOTA: Os nomes das soluções e suas composições estão listados na Tabela 1.
1. Preparação tecidual
- Eutanize o rato com uma overdose de CO2,seguido de luxação cervical.
- Enuclear os olhos com fórceps curvos e transferi-los para uma pequena placa de petri com 0,1 M PBS(Tabela 1). Sob um microscópio de dissecção, faça um pequeno buraco ao longo da junção córnea-esclera com uma agulha. Transfira para 4% de paraformaldeído (PFA) por 1 hora.
- Transfira o olho de volta para um prato com PBS. Sob um microscópio de dissecção, use uma tesoura de dissecção para cortar todo o caminho ao redor da junção córnea-esclera. Remova a córnea e a lente. Corte na base do nervo óptico e retire cuidadosamente a esclera com fórceps para isolar a retina.
- Faça quatro pequenos cortes uniformemente ao redor da retina e use uma fina escova de ponta mergulhada em PBS para colocá-lo plano (lado GCL para baixo) em uma forma de trevo em um pequeno corte quadrado de papel filtro de nitrocelulose para estabilizar a retina.
- Transfira a retina usando fórceps para segurar o canto do papel nitrocelulose (sem tocar na retina montada) e coloque-a em uma placa de 48 poços com 4% de PFA por 1 hora.
- Transfira o papel filtro e a retina para um poço com PBS e lave (3x por 5 min cada).
- Transfira para A4P0 (Tabela 1) e incuba durante a noite a 4 °C com agitação suave.
- Óleo vegetal pipeta no poço para cobrir completamente a solução A4P0. Incubar em um banho de água a 40 °C por 3 horas sem tremer.
- Lave (3x por 5 min cada) em PBS, certificando-se de que todo o óleo foi lavado. Se necessário, use uma tubulação para remover cuidadosamente o óleo restante da parte superior do poço antes da última lavagem.
- Incubar em 10% SDS a 40 °C por dois dias com agitação suave. Substitua o SDS por uma solução nova no segundo dia.
- Transfira o papel filtro e a retina para PBS com Triton-X-100 (PBST, Tabela 1) e lave (5x por 1,5 h cada).
- Armazene a 4 °C em PBST com azida de sódio de 0,01% (NaN3) ou mova-se diretamente para a imunostainagem.
2. Imunostaining e correspondência de índices refratários
- Remova a retina do papel do filtro descascando-a suavemente com uma escova de ponta fina no PBST.
- Incubar a retina em anticorpo primário(Tabela 2) diluído na solução de bloqueio(Tabela 1) por 2 dias a 40 °C com agitação suave.
- Lave (5x, 1,5 h cada) em PBST.
- Incubar com os anticorpos secundários apropriados(Tabela 3) diluídos em solução de bloqueio por 2 dias a 40 °C com agitação suave e proteger da luz durante o restante do procedimento.
- Lave (5x, 1,5 h cada) em tampão fosfato de 0,02 M (ver Tabela 1).
- Incubar em solução de correspondência de índice refrativo baseada em sorbitol (sRIMS, ver Tabela 1) a 40 °C durante a noite com agitação suave.
3. Montagem
- Delineie uma tampa de vidro de 18 mm x 18 mm x 1,5 mm com um marcador permanente de ponta fina para marcar um limite quadrado na parte de trás de um deslizamento de microscópio de vidro.
- Vire o slide e use uma seringa para traçar o limite com uma fina linha de graxa de silicone na parte frontal do slide, deixando uma pequena lacuna em um canto para a solução de montagem em excesso escapar.
- Transfira a retina para o centro da área delimitada e organize com uma escova de ponta fina para que ela fique plana com o lado fotorreceptor contra o escorregador de vidro.
- Pipeta aproximadamente 60 μL de sRIMS de modo que cubra a retina achatada e se estenda a um canto do gabinete, tomando cuidado para que a retina permaneça plana e no lugar.
- Aplique a mancha de cobertura a partir do canto com o sRIMS e abaixe-a lentamente até tocar a graxa em todos os lados, evitando a formação de bolhas de ar.
- Coloque uma pilha de 3 tampas em cada lado da retina montada como um espaçador. Use a borda longa de outro slide para pressionar o deslizamento para que a montagem fique plana e uniforme.
- Armazene os slides a 4 °C até a imagem.
4. Imagem
- Amostras de imagem em um microscópio de fluorescência convencional ou um microscópio confocal(Tabela de Materiais). Comece colocando o slide no estágio do microscópio e localizando a amostra.
NOTA: Se um microscópio objetivo invertido estiver sendo usado, coloque o slide de cabeça para baixo no palco, primeiro garantindo que as áreas expostas do slide estejam livres de toda a graxa de silicone e solução de montagem. - Para obter imagens empilhadas em z de amostras co-rotuladas, primeiro concentre-se no sinal em cada canal individualmente e defina o tempo de exposição ou velocidade de varredura, para fluorescência ou microscópios confocal, respectivamente.
- Defina o intervalo para a pilha z, definindo manualmente o plano focal na parte superior e inferior da faixa desejada, ou definindo o ponto médio e, em seguida, especificando um intervalo ao redor do ponto médio.
- Ajuste o tamanho da etapa ou o número de fatias conforme desejado.
- Capture a imagem e salve o arquivo original, bem como exporte-a como um arquivo TIFF ou outro formato desejado.
5. Análise de imagem
- Use o software de análise de imagem de escolha(Tabela de Materiais) para ajustar o brilho e o contraste em cada canal até que a clareza ideal seja alcançada tanto nas imagens únicas quanto na renderização tridimensional da pilha z.
NOTA: Se o tamanho da etapa selecionada for suficientemente pequeno, a desconvolução 3D também poderá ser realizada para melhorar o sinal.
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Representative Results
Retinas modificadas processadas por CLARITY são tecido opticamente transparente.
Para formular um método de limpeza tecidual compatível com aplicações imunohistoquímicas na retina, ao mesmo tempo em que fornecemos delipidação adequada e retendo a integridade estrutural das proteínas celulares, adaptamos o método de limpeza tecidual CLARITY para retinas de camundongos de montagem total. Conseguimos simplificar o protocolo e modificá-lo para retinas de montagem inteira (ver Protocolo). Após a conclusão da hibridização tecidual, desobstrução e correspondência de índices refrativos, as retinas processadas com este protocolo CLARITY modificado mostraram quase total transparência óptica em toda a espessura da retina (Figura 1A) quando comparadas às retinas de controle não processadas(Figura 1B). Este resultado indica que esta modificação do protocolo CLARITY fornece tecido de retina de montagem integral suficientemente limpo.
Melhor imagem 3D de neurônios em retinas processadas CLARITY modificadas.
Para avaliar a qualidade e praticidade da coloração imunohistoquímica proporcionada por este método de CLARIDADE modificado, manchamos retinas processadas CLARITY com vários anticorpos primários(Tabela 2). Esses anticorpos marcam cada tipo de célula principal na retina: fotorreceptores de cone, células bipolares de vara, células amacrinas, RGCs e células gliais, bem como anticorpos contra proteínas sinopáticas subcelulares. Com exceção do marcador de atividade celular fospho-S6 (pS6), todos os anticorpos testados provaram ser compatíveis com clarity. Exemplos típicos são ilustrados na Figura 2. Realizamos rotulagem tripla com anticorpos contra detenção de cone, hidroxilase de tyrosina (TH) e RNA-Binding Protein com Splicing Múltiplo (RBPMS). Pegamos uma série de z-pilha de imagens de microscopia confocal do ONL para o GCL. Imagens individuais mostraram os cones rotulados no ONL (Figura 2A),DACs rotulados em TH no INL (Figura 2B) e RGCs marcados por RBPMS no GCL (Figura 2C). Uma imagem sobreposta revelou a localização relativa desses neurônios em toda a espessura da retina (Figura 2D). Esses resultados sugerem que a CLARITY pode melhorar a qualidade de muitas manchas imunohistoquímicas padrão e revelar claramente a estrutura 3D dos neurônios em toda a espessura da retina em preparações de montagem inteira.
A CLARITY modificada fornece uma melhor resolução 3D de processos finos de neurônios retinais e proteínas sinápticas.
Analisamos ainda a coloração de TH em retinas de montagem integral processadas pela CLARITY (Figuras 3A,B) e comparamos com imagens obtidas a partir da preparação padrão de montagem integral(Figuras 3C,D). Imagens confocal mostram que dendritos e processos semelhantes a axônios de DACs foram revelados muito mais claramente em uma retina processada CLARITY(Figura 3A) do que em uma retina padrão(Figura 3C). Em particular, os processos semelhantes a axônios de DACs apresentaram estruturas mais completas semelhantes a um anel em uma retina CLARITY (ver uma inserção na Figura 3A) do que em uma retina padrão (ver uma inserção na Figura 3C). Notavelmente, as estruturas semelhantes a um anel de uma retina CLARITY tomadas por microscopia de fluorescência (Figura 3B) eram quase idênticas às observadas utilizando confocal(Figura 3A). Além disso, os processos semelhantes ao axônio também corriam em direção à retina externa, o que foi observado em imagens orientadas a X-Z(Figura 4A). Esses dados sugerem que o CLARITY pode ser usado para identificar processos semelhantes a axônios de DACs em retinas de montagem inteira, mesmo com o uso de microscopia de fluorescência convencional.
Quando a subunidade de receptores AMPA GluA2 e a proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) foram examinadas em retinas padrão de montagem integral, nenhuma delas foi detectada, provavelmente devido à má penetração de anticorpos contra essas proteínas sinápticas na retina profunda. Para determinar se as retinas processadas pela CLARITY permitem que esses anticorpos imunoschem proteínas sinápticas, triplicamos a rotulagem de TH com a subunidade GluA2 e PSD-95. Imunostaining contra GluA2 e PSD-95 mostrou puncta distinta revelando receptores AMPA individuais contendo GluA2(Figura 4B) e locais postingais putativos(Figura 4C), respectivamente. Uma imagem de sobreposição mostrou algumas puncta aparentes nos processos DAC(Figura 4D). Nós imaginamos um ponto de colocação putativa com as três manchas e apresentamos em vistas 3D(Figura 5). Das três visões, o TH se colocalizou claramente com GluA2 e PSD-95 (Figura 5 A-C). Esses resultados de perspectiva 3D de retinas de montagem inteira validam nossos relatórios anteriores de expressão sináptica de receptores AMPA contendo GluA2 em processos DAC em fatias verticais de retina5,6.
Figura 1. A CLARITY fornece tecido opticamente transparente. As retinas do rato de montagem inteira foram processadas com o método CLARITY modificado (ver Protocolo) e toda a retina imagem com um microscópio de dissecção, sobreposta em uma grade quadrada de 0,67 cm para mostrar escala. A: Retina de montagem integral processada pela CLARITY, com linhas de grade claramente visíveis através do tecido transparente. Flechas delineiam a colocação da retina. B: Retina de controle não-claro processada, fixada em PFA por 1 h e incubada em PBS. As linhas de grade são obscurecidas pela opacidade relativa do tecido. Barra de escala: aproximadamente 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Melhor imagem 3D de neurônios através da espessura da retina em retinas processadas pela CLARITY. As retinas CLARITY de montagem total foram imunoss detidas com anticorpos contra cone arrestin, TH e RBPMS. A imagem representa uma renderização de volume 3D de uma imagem confocal empilhada em z, visualizada em uma orientação X-Z. A: Fotorreceptores de cone (seta) rotulados por cone arrestin (azul). Uma pequena mancha é visível na retina interna (pontas de flecha), provavelmente devido à coloração de fundo. B: Dac soma e dendritos (seta) rotulados por TH (vermelho). Pontas de flecha indicam vasos sanguíneos de retina na retina interna, visíveis devido à imunossuagem multi-rótulo. C: RGC somata (seta) rotulado por RBPMS (verde). Pontas de flecha indicam vasos sanguíneos de retina visíveis devido à autofluorescência e coloração não específica dos vasos sanguíneos. D: Imagem mesclada da coloração tripla rotulada, revelando a colocação relativa desses neurônios através da espessura da retina, com fotorreceptores de cone localizados na camada nuclear externa, DACs na camada nuclear interna, e RGCs na camada celular de gânglio. A escala da visualização de volume está marcada em incrementos de 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A CLAREZA revela estruturas finas da morfologia da DAC. A imunostaining TH foi realizada nas retinas processadas pela CLARITY(A e B)e nas retinas padrão(C e D). As imagens empilhadas em Z foram tiradas utilizando-se a microscopia de confocal(A e C)e a microscopia de fluorescência(B e D). Uma inserção de um único plano óptico em cada imagem destaca estruturas semelhantes a anéis presumivelmente formadas por processos semelhantes a axônios. As pontas de flecha indicam que as somatas do DAC são visíveis (exemplos são indicados por setas) no plexo denso de dendritos e processos semelhantes ao axônio revelados em retinas processadas pela CLARITY(A e B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A CLARITY modificada fornece uma melhor resolução 3D de estruturas dendríticas finas e proteínas sinápticas. A imunostaining tripla foi realizada em retinas de montagem integral processadas pela CLARITY com anticorpos contra TH, GluA2 e PSD-95. Uma renderização de volume foi reconstruída a partir de imagens confocal empilhadas em z e apresentada em uma orientação X-Z angular. A: DAC somata (pontas de flecha) na camada nuclear interna e processos (setas amarelas) estratificando na camada plexiforme interna distal (vermelho). Setas brancas indicam processos centrífugas que se estendem em direção à retina externa. B: Expressão pontual densa de receptores AMPA contendo GluA2 através da camada plexiforme interna (verde). A seta indica autofluorescência de um vaso sanguíneo da retina. C: Puncta revelando locais pós-sinápticos rotulados pelo PSD-95 na camada plexiforme interna (azul). Setas indicam vasos sanguíneos, aparentes devido ao uso de um anticorpo monoclonal de rato contra PSD-95. D: Imagem de sobreposição demonstrando sobreposição dos processos DAC rotulados por TH com a expressão de GluA2 e PSD-95. A escala da visualização de volume está marcada em incrementos de 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Expressão sináptica de receptores AMPA contendo GluA2 em DACs. Um ponto de colocalização de th, GluA2 e PSD-95 mostrado na Figura 4 foi selecionado e investigado em 3D. A1 representa um segmento de um processo DAC (vermelho) na orientação X-Z (A5). A2 e A3 mostram um único punctum GluA2 (verde) e PSD-95 punctum (azul), respectivamente, na mesma orientação. A imagem mesclada (A4) demonstra colocalização tripla de TH, GluA2 e PSD-95 (seta). B1-B4 mostram o mesmo ponto de colocalização (seta) em uma orientação Y-Z (B5). C1-C4 mostram colocalização do mesmo ponto (seta) no plano X-Y (C5). A colocalização tripla é claramente aparente em cada orientação. Barra de escala: 2 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| solução | composição | anotações |
| 0,1 M PBS | 137 mM NaCl | Ajuste o pH para 7.4 |
| 26,8 mM KCl | ||
| 10,1 mM Na2HPO4 | ||
| 17,6 mM KH2PO4 | ||
| A4P0 | 4% de acrilamida | Prepare-se no gelo, aliquot e armazene a -20 ºC |
| 0,25% VA-044 | ||
| 0,1 M PBS | ||
| PBST | 0,1% (v/v) Triton-X-100 | |
| 0,1 M PBS | ||
| Solução de bloqueio | 2% NDS ou 1% BSA | |
| 0,01% NaN3 | ||
| PBST | ||
| Tampão fosfato de 0,1 M | 11,93 g Na2HPO4/litro | Ajuste o pH para 7,5 |
| 15,34 g NaH2PO4/litro | ||
| ddH2O | ||
| sRIMS | 70% de sorbitol | Ajuste pH para 7.5 com NaOH |
| 0,1% interpolação-20 | ||
| 0,01% NaN3 | ||
| Tampão fosfato de 0,02 M | ||
Mesa 1. Composição de soluções.
| anticorpo | IHC | anfitrião | diluição | catálogo # | fornecedor | ID de registro ab | alvo |
| Opsina azul-sensível | +3 | Policlonal de cabra | 1:1000 | SC-14363 | Biotecnologia de Santa Cruz | AB_2158332 | S-cone |
| Cone arrestin | +2 | Polclonal de coelho | 1:1000 | AB15282 | EMD Millipore | AB_1163387 | cone |
| Proteína quinase C alfa (PKC-α) | +3 | Polclonal de coelho | 1:1000 | SC-208 | Biotecnologia de Santa Cruz | AB_2168668 | Célula bipolar de rod |
| Proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) | +3 | Policlonal de cabra | 1:500 | SC-6170 | Biotecnologia de Santa Cruz | AB_641021 | Astrocyte |
| Hidroxilase de tyrosina (TH) | +3 | Policlonal de ovelhas | 1:500 | AB1542 | EMD Millipore | AB_90755 | Célula amacrina dopaminérgica |
| Hidroxilase de tyrosina (TH) | +2 | Polclonal de coelho | 1:500 | OPA1-04050 | ThermoFisher | AB_325653 | Célula amacrina dopaminérgica |
| Acetiltransferase de colina (ChAT) | +1 | Policlonal de cabra | 1:500 | AB144P | EMD Millipore | AB_2079751 | Célula amacrina starburst |
| Proteína de ligação de RNA com emenda múltipla (RBPMS) | +1 | Policlonal de cobaia | 1:2000 | ABN1376 | EMD Millipore | AB_2687403 | Célula gânglio de retina |
| GluA2 | +3 | Polclonal de coelho | 1:500 | AB1768-I | EMD Millipore | AB_2247874 | Receptor AMPA ca2+impermeável |
| GluA2 | +2 | Monoclonal do rato | 1:250 | MABN1189 | EMD Millipore | AB_2737079 | Receptor AMPA ca2+impermeável |
| Proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) | +3 | Monoclonal do rato | 1:1000 | 75-028 | NeuroMab | AB_2877189 | Locais sinápticos |
| Phospho-S6 (pS6) | 0 | Polclonal de coelho | 1:500 | 44-923G | ThermoFisher | AB_2533798 | Marcador de atividade celular |
Mesa 2. Resumo dos anticorpos primários testados. Lenda do IHC: +3 = coloração consistente e altamente específica; +2 = coloração consistentemente boa, fundo mínimo; +1 = boa coloração, algum fundo; 0 = incompatível com a CLARIDADE.
| anfitrião | Espécies-alvo | conjugado | diluição | fornecedor |
| burro | Anti-ovelhas | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-ovelhas | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-coelho | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-coelho | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| cabra | Anti-coelho | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-rato | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-rato | Alexa Fluor 647 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-cabra | Alexa Fluor 568 | 1:500 | Invitrogen |
| burro | Anti-cabra | Alexa Fluor 594 | 1:500 | Invitrogen |
| cabra | Anti-cobaia | Alexa Fluor 488 | 1:500 | Invitrogen |
Mesa 3. Resumo dos anticorpos secundários testados.
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Discussion
Modificação do protocolo CLARITY para retinas de montagem inteira.
Simplificamos o protocolo CLARITY para alcançar a polimerização adequada sem a necessidade de uma câmara de evacuação ou dessecação a vácuo, como é usado na maioria dos estudos anteriores7,9,11. O processo de polimerização é inibido pelo oxigênio, exigindo que a amostra seja isolada do ar durante a etapa de polimerização do protocolo. No entanto, em vez de desgasear com nitrogênio, descobrimos que cobrir a amostra com óleo isolou suficientemente a amostra para permitir a polimerização sem afetar negativamente o restante do protocolo após uma lavagem completa, como documentado anteriormente12. Simplificamos ainda o protocolo com um método de compensação passiva para limitar o risco de escanteamento tecidual e danos à estrutura tecidual associada à limpeza eletroforética11. A clareira passiva é acelerada por agitação suave e temperatura elevada, permitindo a limpeza completa do tecido em apenas dois dias. Durante esse período, a delipidação suficiente é alcançada para resultar em tecido opticamente transparente, minimizando a perda de proteínas e outras biomoléculas integrais à estrutura celular e coloração imunohistoquímica.
A CLARITY preserva proteínas de neurônios retinianos e células gliais em preparações de montagem inteira.
Nossos resultados mostram que quase todos os anticorpos testados funcionam em retinas processadas CLARITY. Esses anticorpos marcam fotorreceptores, células bipolares, células amacrinas, RGCs e células gliais. Embora não tenhamos sido capazes de testar anticorpos para subtipos de cada classe de neurônios da retina, nossos resultados implicam que as retinas processadas clarity podem ser usadas para a maioria dos marcadores celulares na retina. Embora a maioria dos anticorpos que testamos também possa imunostain neurônios da retina em retinas processadas não-CLARITY, descobrimos que a CLARITY permitiu a penetração adequada de anticorpos no tecido profundo da retina, fornecendo boa especificidade da coloração na camada média da retina. Além disso, descobrimos que a CLARITY melhorou a penetração da luz em toda a espessura da retina, reduzindo a dispersão de luz e permitindo imagens de alta resolução até mesmo através das camadas mais profundas. Esses fatores contribuem para uma melhoria tanto na coloração quanto na imagem nas retinas de montagem integral processadas pela CLARITY em comparação com o IHC13padrão não-CLARITY. O fundo reduzido e as renderizações de imagem e volume 3D melhoradas permitem uma investigação completa das estruturas celulares em todas as camadas através da espessura da retina.
A CLAREZA revela processos finos e estrutura sináptica de DACs em retinas de montagem inteira.
Nossos resultados demonstram que estruturas semelhantes a anéis e processos centrífugas de DACs são revelados em retinas totalmente processadas pela CLARITY do que em retinas de montagem integral não-CLARITY. Em particular, a imunossuagem com tecido processado pela CLARITY permite uma boa resolução dessas estruturas finas mesmo com microscopia de fluorescência padrão sem a necessidade de imagens confocal. Dada a importância dos DACs na função visual, a preparação da CLARITY pode ser usada para investigar as estruturas dos DACs em retinas normais e alterações morfológicas em condições doentes.
Ao imunostaining para PSD-95 e GluA2 com tecido integral padrão, observamos pouca ou nenhuma rotulagem dessas estruturas subcelulares nas camadas profundas da retina, indicando baixa penetração de anticorpos. A aplicação do protocolo CLARITY permite a coloração distinta dessas proteínas nas camadas internas da retina, indicando melhor penetração de anticorpos no tecido profundo. Nossos resultados mostram que a CLARITY permite a detecção de proteínas sinápticas nos processos DAC em retinas de montagem integral, que normalmente é observada nas preparações verticaisde fatias 6. Uma vez que os processos semelhantes ao axônio não podem ser distinguidos dos dendritos em fatias verticais, as retinas de montagem integral clarity fornecem uma oportunidade para determinar se as entradas sinápticas para DACs de outros neurônios, como células bipolares e ipRGCs ocorrem em dendritos, processos semelhantes a axônios, ou ambos5,6. Uma vez que os receptores AMPA e as proteínas PSD-95 são amplamente distribuídos em todo o IPL, a expressão dessas proteínas em DACs é um excelente exemplo para que as retinas CLARITY sejam usadas para identificação de proteínas sinápticas em outros neurônios da retina.
Considerações, limitações e aplicações futuras do protocolo CLARITY para retinas de montagem inteira.
Primeiro, os protocolos de polimerização e limpeza para retinas de montagem integral processadas pela CLARITY adicionam vários dias ao processo de preparação do tecido. No entanto, o método ainda é altamente prático pelo fato de que as retinas clarificas podem ser armazenadas em PBS contendo azida de sódio por até duas semanas com degradação mínima do tecido. Em segundo lugar, observou-se alguma expansão do tecido ao longo do processo de compensação, conforme documentado em aplicações anteriores do CLARITY7,11. No entanto, descobrimos que a retina voltou ao tamanho aproximadamente original após o equilíbrio com a solução de correspondência de índices refrativos. As possíveis pequenas alterações no volume do tecido podem não causar distorção significativa da estrutura celular ou subcelular7,11. Em terceiro lugar, quando a imagem de amostras cerebrais mais grossas, o objetivo do microscópio é frequentemente imerso diretamente na mídia de montagem para permitir a correspondência completa do índice refrativo a partir da lente do microscópio através do tecido12. Com amostras mais finas, como a retina, usamos tampas para montagem para deixar as amostras mais lisonjeiras e mais uniformes para a imagem. Os efeitos da refração através do deslizamento parecem ser mínimos na imagem. Em quarto lugar, algumas de nossas imagens mostram manchas não específicas dos vasos sanguíneos porque não perfundiamos todo o animal com perfusão intracardiac (sugerida para evitar manchas não específicas) antes de enuclear os olhos. Por fim, o protocolo atual adaptado para camundongos pode ser usado para retinas de outras espécies. Em particular, retinas de animais grandes como cães, porcos, cavalos e primatas são muito mais espessas do que as de ratos. Este protocolo CLARITY poderia tornar as retinas desses animais mais opticamente transparentes após a remoção de lipídios e preservar as estruturas finas dos neurônios da retina e suas proteínas para imunossuagem.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Bing Ye, Nathan Spix e Hao Liu pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) e pelo Oakland University Provost Graduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
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