إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

Summary

هنا، نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام جهاز صنع الشبكة السريعة لكل من صنع الشبكة السريعة والاختلاط السريع والتجميد لإجراء تجارب حل الوقت.

Abstract

يتطور مجال المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) بسرعة باستخدام أجهزة جديدة وخوارزميات معالجة ، مما ينتج هياكل عالية الدقة ومعلومات عن الأنظمة الأكثر تحديا. ويخضع إعداد العينة للكريو-م لثورة مماثلة مع وضع نهج جديدة لتحل محل أنظمة النشاف التقليدية. وتشمل هذه استخدام موزعات بيزو الكهربائية، دبوس الطباعة والرش المباشر. ونتيجة لهذه التطورات، تسير سرعة إعداد الشبكة من ثوان إلى مللي ثانية، مما يوفر فرصا جديدة، لا سيما في مجال التبريد-EM الذي تم حله زمنيا حيث يمكن خلط البروتينات والركائز بسرعة قبل الهبوط في التجمد، مما يؤدي إلى محاصرة الدول المتوسطة قصيرة العمر. هنا نقوم بوصف، بالتفصيل، بروتوكول قياسي لصنع شبكات على جهاز EM الداخلي الذي تم حله زمنيا لإعداد الشبكة السريعة القياسية وكذلك للتجارب التي تم حلها زمنيا. يتطلب البروتوكول عينة لا تقل عن 50 ميكرولتر بتركيزات ≥ 2 ملغم/مل لإعداد 4 شبكات. يمكن أن يكون التأخير بين تطبيق العينة والتجميد منخفضا إلى 10 مللي ثانية. أحد القيود هو زيادة سمك الجليد بسرعات أسرع ومقارنتها بطريقة النشاف. نأمل أن يساعد هذا البروتوكول الآخرين في تصميم أجهزة صنع الشبكة الخاصة بهم والمهتمين بتصميم تجارب حلها الزمن.

Introduction

خلفية
وقد مكنت التطورات الأخيرة في المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) من إجراء دراسات هيكلية للأنظمة المتزايدة التعقيد بدقة عالية. مع استثناءات قليلة، اقتصرت هذه الدراسات على الجزيئات البيولوجية في التوازن¹ أو ردود الفعل بطيئة نسبيا². تحدث العديد من العمليات في الجسم الحي على مقياس زمني أسرع (مللي ثانية) وهناك اهتمام متزايد في cryo-EM (TrEM) الذي تم حله عبر الزمن على هذه الجداول الزمنية³. ومع ذلك، إعداد عينة cryo-EM التقليدية بواسطة أسلوب النشاف بطيئة جدا لTrEM ميلي ثانية.

أسلوب النشاف له قيود أخرى إلى جانب ضعف الوقت القرار. يمكن أن تعاني البروتينات ومجمعات البروتين من التشبع أو التوجه المفضل على الشبكات^4. وقد تبين أن تقليل وقت التعرض لواجهة الهواء والماء أثناء إعداد العينة للتخفيف من التوجه المفضل وتشبع البروتين^5،6. وبالتالي، فإن إعداد الشبكة بسرعة لا يتيح فقط TrEM ميلي ثانية ولكن يمكن أيضا تحسين جودة الشبكة.

حاليا، هناك ثلاثة نهج مختلفة لإعداد الشبكة الآلي. يستخدم النهج الأول دبوس أو الشعرية التي تحتوي على كمية صغيرة من العينة. بعد إقامة اتصال بين السائل وسطح الشبكة ، يتم "كتابة" العينة على الشبكة^7،8. عملية تطبيق نموذج بطيء نسبيا ويستغرق بضع ثوان. نهج بديل يستخدم توليد القطيرات التي تسيطر عليها موزع بيزو وشبكات الفتل الذاتي⁹. وهذا يسمح أسرع الاستغناء عن تجميد مرات، ولكن لا يزال محدودا عن طريق سرعة القطيرات والفتل (تصل حاليا إلى 54 مللي ثانية). أسرع نهج حتى الآن هو نهج الرش المباشر ، حيث يتم تفتيت العينة في فوهة رذاذ وقطرات صغيرة (~ 10 - 20 ميكرومتر) وسريعة (> 5 م / ثانية) تنتشر عند ملامسة شبكة cryo-EM. يمكن توليد رذاذ العينة من خلال طرق مختلفة مثل رذاذ الأرومة الهوائية ، والموجات الصوتية السطحية أو المرطبات بالموجات فوق الصوتية^{10،11،12،13}. في تجربتنا، سمك الجليد مع نهج الرش المباشر هو أكبر ولكن الرش المباشر تمكن الاستغناء عن تجميد مرات < 10 مللي ثانية.

يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة كيف يمكن استخدام جهاز EM (TED) الذي تم حله زمنيا والمجهز ب فوهة رذاذ microfluidic لإعداد الشبكات على مقياس زمني سريع^14و15. وقد استخدم الجهاز لإعداد الشبكات مع الحد الأدنى من وقت التأخير من 6 مللي ثانية بين تطبيق العينة وتجميد وخلط وتجميد عينات اثنين بسرعة. ويستند تصميم تيد على الإصدار السابق¹⁶ ويشبه غيرها من الأجهزة القائمة على رذاذ الوقت حل cryo-EM¹⁷.

أولا، يتم وصف الأجزاء الأربعة الرئيسية من إعداد تيد. جوهر تيد هو وحدة المناولة السائلة، وهي المسؤولة عن عينة الطموح والاستغناء. المكبس الهوائي يحرك الشبكة من خلال الرذاذ إلى الإيثان السائل. يتم تحقيق توليد الرذاذ مع فوهات رذاذ microfluidic ويتم التجميد في حاوية الإيثان السائل ، والتي يتم وصفها لفترة وجيزة. وأخيرا، يتم تسليط الضوء على الميزات الإضافية للتحكم في بيئة الشبكة، وخاصة الرطوبة. ويتبع ذلك بروتوكولات مفصلة لتشغيل الجهاز وإجراء تجارب TrEM. يتم إعطاء نتائج تمثيلية لإعداد الشبكة بسرعة وتجربة TrEM بسيطة.

الإعداد التجريبي

وحدة المناولة السائلة
يتم تشكيل نظام المناولة السائلة في تيد من خلال ثلاث مضخات محرك حقنة ('مضخات 1 - 3')، كل مجهزة صمام دوار(الشكل 1). توفر إمدادات الطاقة مضخات 1-3 مع 24 فولت DC. الاتصال مع برنامج التحكم (مكتوب في Visual Basic و C ++) عبر واجهة RS232 لضخ 1. يتم توزيع الأوامر من خلال منافذ توسيع الإدخال/إخراج التسلسلية من المضخة 1 إلى المضخات 2-3. مضخات 1-3 مجهزة المحاقن الزجاجية ('المحاقن 1-3'، ونحن نستخدم 250 ميكرولتر / صفر المحاقن حجم الميت هنا). كل صمام له موقفين، "تحميل" و "الاستغناء". يتم استخدام موضع "الحمل" لتنشق العينة في الحقنة. قطعة قصيرة (~ 3 - 4 سم) من 1/16 "O.D., 0.01′′I.D. يتم توصيل أنابيب FEP عبر ETFE / ETFE التجهيزات مع ذلك إلى موقف 'تحميل' من الصمامات 1-3. تصل هذه القطعة القصيرة من الأنابيب إلى خزان العينة (عادة أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل أو 0.5 مل). موقف "الاستغناء" يؤدي إلى فوهة رذاذ. يتم الاتصال بين منفذ "الاستغناء" وفوهة الرش عن طريق أنابيب PE (~ 20-30 سم طول، 0.043"O.D.، 0.015"I.D.)، مع قطعة قصيرة من أنابيب الأكمام (~ 0.5 سم) و ETFE / ETFE التجهيزات flangeless.

المكبس الهوائي
يستخدم TED المكبس الهوائي لتسريع الشبكة وتحريكها من خلال رذاذ العينة في حاوية الإيثان السائلة. ملاقط الضغط السلبي عقد الشبكة، مشدود في حامل المنزل الصنع الذي شنت على اسطوانة هوائية قضيب مزدوج(الشكل 2A).

يتم توفير الضغط من اسطوانة غاز النيتروجين الكبيرة (حجم W) ، ومجهزة منظم متعدد المراحل (0 - 10 بار ، "الضغط الرئيسي"). تربط أنابيب PVC المعززة المرنة (12 مم O.D. ) المنظم بمشعب مكون من 12 منفذا حيث يتم توصيل النيتروجين المضغوط إلى الفوهة والمغطاس الهوائي. تدفق الغاز من خلال فوهة ثابت، وينظم مباشرة في اسطوانة النيتروجين (الضغط الرئيسي). يتم إجراء الاتصال بالزهة مع أنابيب PU (4 مم O.D.، 2.5 مم I.D.)، قطعة قصيرة من أنابيب PE (طول ~ 8 سم، 0.043 بوصة، 0.015 بوصة) والموصلات المناسبة. يتم التحكم في الضغط على المكبس الهوائي من خلال صمام سولينويد. تربط أنابيب PU (4 مم O.D.، 2.5 مم I.D.) الصمام السولينويد بمنظم ومغطاس هوائي، للسماح بانخفاض ضغط الهبوط (≤ الضغط الرئيسي). صمام سولينويد هو الكمبيوتر التي تسيطر عليها. يتم إعطاء نظرة عامة تخطيطية الإعداد في الشكل 2B.

لاحظ أنه مع هذا الإعداد ضغط الهبوط هو دائما على قدم المساواة أو أصغر من ضغط الغاز رذاذ (الضغط الرئيسي). ومع ذلك ، يمكن بسهولة تغيير الإعداد من خلال دمج منظم ثان في المنبع من فوهة الرش للسماح بسرعات هبوط أعلى عند ضغط غاز الرش المنخفض. يمكن أن يؤدي الضغط العالي (>> 2 بار) إلى تلف فوهة رذاذ PDMS.

تنبيه: هذا هو نظام الضغط و "الضغط الرئيسي" يجب أن يكون دائما < 7 بار.

وعادة ما تستخدم الضغوط بين 0.5 و 2 شريط للمغطس الهوائية وتظهر علاقة خطية تقريبا بين الضغط والسرعة (في الموقف الرأسي للرذاذ). يتم قياس سرعات الهبوط مع منظار الذبذبات، متصلة تمشيا مع عداد ال وقوي الشريحة (10 kΩ) وبالتوازي مع مقاوم 2 كيلوΩ (الشكل 2C). توفر إمدادات الطاقة مقياس القوة مع 9 V DC. في حين يتم تعيين سرعة الهبوط التقريبية قبل التجربة عن طريق وضع ضغط الهبوط ، فإن مقياس القوة يعطي قراءات دقيقة للسرعة بعد التجربة.

فوهات الرش وحاوية الإيثان السائلة
وقد وصفت تصنيع وتشغيل فوهات افتراضية ديناميكية الغاز لتسليم العينة على أساس رذاذ في مكان آخر بالتفصيل¹⁵. كما هو موضح أعلاه، يتم توصيل منافذ "الاستغناء" من الصمامات 1-3 إلى مداخل السائل من فوهة (الشكل 3A). يتم توصيل غاز الرش المضغوط بمدخل الغاز في الفوهة. المداخل في فوهات رذاذ PDMS هي من هذا القبيل أن 0.043 "O.D. PE أنابيب يمكن استخدامها مباشرة دون الحاجة إلى التجهيزات. يحتوي تصميم الفوهة لدينا على هندسة "طائرة نفاثة" لخلط عينتين ، على غرار الجهاز الموصوف في المرجع^18. يظهر مخطط للتصميم في الشكل 3B، وتظهر صورة مجهرية لل وفوهة في الشكل 3C. يتطلب تخطيط الجهاز microfluidic استخدام ثلاث حقن لخلط عينتين. يتم وضع فوهة الرش عادة على مسافة 1-1.5 سم من الشبكة (أثناء تطبيق العينة).

نحن نستخدم الإيثان السائل ككريوجين، في وعاء الإيثان السائل / النيتروجين كما هو مستخدم لطريقة النشاف القياسية. يتم تحديد المواقع الرأسية لكأس الإيثان السائل من خلال منصة رفع مختبرية.

التحكم في بيئة الرذاذ والشبكة
وترد فوهة المكبس ورذاذ داخل مخصص بنيت PMMA (زجاج الاكريليك) مربع مع باب مزدوج(الشكل 4A). يتم تحقيق الرطوبة النسبية العالية داخل الصندوق من خلال نظام ترطيب الهواء في الجزء الخلفي من تيد(الشكل 4B). يتم توفير الهواء بواسطة مضخة وتغذية في أول 10 "علبة (تستخدم عادة لتنقية المياه تحت بالوعة). تمتلئ العبوة بمستوى منخفض (~ 5-10 سم) من الماء وتضم أيضا وحدة مرطب. يتم التحكم في طاقة التيار الكهربائي للمرطب بواسطة وحدة تحكم رقمية في الرطوبة / درجة الحرارة ومستشعر الرطوبة / درجة الحرارة الموجود داخل صندوق زجاج الأكريليك. يتم تعيين وحدة التحكم لإيقاف تشغيل المضخة عندما تصل الرطوبة النسبية ≥ 90 ٪. يتم ضخ الهواء المرطب من العبوة الأولى من خلال الناشر ، مغمورة في الماء في عبوة 10 بوصة ثانية ثم تدخل مربع زجاج الأكريليك.

تنبيه: نظرا لأن العينة يتم هباءها في فوهة الرش ، فإن العينة البيولوجية أو الكيميائية الخطرة ليست مناسبة كعينات.

تسلسل التشغيل
يبدأ الزر تشغيل البرنامج النصي في برنامج التحكم تسلسل التشغيل. يمكن تعريف تسلسل الأوامر هذا مسبقا في ملف البرنامج النصي وتغييره من خلال البرنامج. يتم شرح أهم المتغيرات هنا:

سرعة الرش: تحدد سرعة الرش معدل التدفق السائل الذي تستخدمه مضخة الحقنة. يمكن حساب معدل التدفق على النحو التالي: محركات مضخة الحقن المستخدمة هنا لها حجم خطوة ثابتة. وتنقسم المجموعة الكاملة للمضخة إلى 48،000 خطوة. العامل الثاني المهم هو حجم الحقنة. نحن عادة ما نستخدم 250 حقنة ميكرولتر. يتم تعيين سرعة الرش في برنامج التحكم وعدد من الخطوات / الثانية. سرعة الرش من 1000 خطوات / ثانية يتوافق مع:

حجم الرش: يحدد حجم الرش إجمالي الحجم الذي سيتم رشه. وهكذا، فإنه يحدد أيضا مدة رذاذ. يتم تعيين حجم الرش في برنامج التحكم كعدد من الخطوات. حجم رذاذ من 2000 خطوات، بسرعة رذاذ من 1000 خطوة / ثانية، ويؤدي إلى مدة رذاذ من 2 ق وحجم إجمالي قدره 10.4 ميكرولتر.

وقت ما قبل الرش: يحدد هذا المتغير الوقت بين بدء الرش والغطس. من المهم اختيار وقت التأخير بحيث يكون للرذاذ الوقت الكافي لتحقيق الاستقرار قبل إغراق الشبكة. عادة، يتم إعطاء رذاذ 1.5 -4 ق لتحقيق الاستقرار قبل أن تغرق الشبكة. يتم الحفاظ على الرذاذ حتى تتحرك الشبكة من خلال. عادة، يتم إيقاف تدفق السائل (وبالتالي رذاذ) 0.5 إلى 1 s بعد أن تم هوت الشبكة. باستخدام سرعة رش 1000 خطوة / ثانية وحجم رذاذ من 2000 خطوة ، فإن وقت الرش النموذجي هو 1.5 ثانية ، على سبيل المثال.

يظهر تسلسل مثالي للأوامر في الشكل 5A، ويتم توضيح موضع الشبكة بمرور الوقت في الشكل 5B.

Protocol

1. إعداد النظام

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي كيفية تحضير شبكات نموذج واحد. عادة، يتم إعداد شبكات النسخ المتماثل 2 كحد أدنى لكل عينة أو شرط. لسرعات الهبوط الأسرع (أقل من ~ 20 مللي ثانية تأخير الوقت)، وعادة ما تكون على استعداد 3 أو 4 شبكات تكرار لحساب عدد أقل من مناطق الجليد رقيقة.

1. تمييع عينة البروتين إلى التركيز المستهدف في العازلة المطلوبة. عادة، التركيزات النهائية ≥ 2 ملغم/مل تعمل بشكل جيد لإعداد الشبكة مع تيد. لاحظ أنه يمكن الاحتفاظ بالعينة على الجليد حتى الخطوة 10 ، من الخطوة 10 فصاعدا ستقضي العينة وقتا طويلا في درجة حرارة الغرفة حيث تستغرق حوالي 20 دقيقة لإعداد شبكات 3-4.
2. قم بتشغيل TED. ثم قم بتشغيل جهاز التحكم وبدء تشغيل برنامج التحكم.
3. تهيئة جميع مضخات الحقنة عن طريق الضغط على زر التهيئة (الزر الأسود السفلي) على كل مضخة حقنة.
4. قم بتشغيل مصدر الطاقة القوي، واضبطه على 9 فولت وابدأ تشغيل برنامج التحكم في الذبذبات.
5. تأكد من إغلاق الصمام التنظيمي للأسطوانات N_2. افتح صمام الأسطوانة. ثم، فتح ببطء صمام المنظم وضع الضغط منفذ للقيمة المطلوبة لضغط الغاز رذاذ (عادة 1-2 بار). بالنسبة ل وفوهات PDMS المستخدمة هنا ، لا تستخدم ضغوطا أعلى من ~ 2.5 شريط لتجنب تلف الفوهة. يمنع الغاز المتدفق باستمرار السائل من التنقيط والتراكم عند طرف الفوهة مما قد يؤدي إلى رش غير قابل للتدمير.
6. تأكد من أن جميع صمامات مضخة المحاقن في وضع "الحمل". ويمكن القيام بذلك عن طريق تبديل جميع الصمامات إلى موقف "الاستغناء" في برنامج التحكم ومن ثم العودة إلى "تحميل". اترك جميع الصمامات تتحول إلى "تحميل". تعيين جميع المحاقن إلى الصفر.
7. إزالة أي فقاعات الهواء موجودة في النظام في هذه المرحلة. للقيام بذلك، قد يكون المحاقن أن تكون غير مفككة، فقاعات إزالتها يدويا والمحاقن التي شنت مرة أخرى عند احتواء أي فقاعات أكثر.
8. عادة ما يتم تخزين مكونات المناولة السائلة في H₂O. قبل تحميل حل العينة، توازن النظام السائل مع المخزن المؤقت عن طريق غسل الأنابيب مع فائض من العازلة. استخدم معدل تدفق السائل الأقصى المناسب لتجنب الضغط الزائد على فوهة الرذاذ. قد تتسبب معدلات التدفق السائلة > 10 ميكرولتر /ثانية في تلف فوهات PDMS الموضحة هنا.
9. ضع أنبوبا سعة 1.5 مل يحتوي على ≥ 200 ميكرولتر على حقنة 1 (يجب ثقب الجزء العلوي لإرفاقه بالأنابيب).
   1. تأكد من أن الصمام 1 في وضع "الحمل". التبديل في برنامج التحكم، إذا لزم الأمر.
   2. يستنشق الكمية المطلوبة (عادة 50-100 ميكرولتر) من المخزن المؤقت مع حقنة 1 ، من خلال برنامج التحكم.
   3. قم بتبديل الصمام 1 إلى موضع "الاستغناء"، من خلال برنامج التحكم.
   4. الاستغناء عن كل من السائل في حقنة 1، من خلال برنامج التحكم.
   5. عودة صمام إلى 'تحميل'، إعادة تعيين موقف حقنة إلى '0' في البرنامج واضغط تهيئة على حقنة 1، لإعداد النظام للدورة القادمة.
      ملاحظة: عادة ما تتكرر الخطوات 1.9.1 - 1.9.5 ثلاث مرات لضمان غسل شامل للأنابيب.
10. تحميل ملاقط مع شبكة م (أي شرط لأي نوع معين) عن طريق تخفيف المشبك الذراع يغرق، ووضع ملاقط في المشبك وتشديد المشبك.
11. يدويا تحريك الذراع يغرق بحيث الشبكة وفوهة هي في نفس الارتفاع ("تطبيق عينة" الموقف). إذا تم محاذاة الفوهة والشبكة ، فسيتراكم السائل على الشبكة بعد الرش لفترة طويلة. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع الفوهة.
12. ضبط موقف كوب الإيثان السائل عن طريق تحريك الذراع يغرق يدويا مع ملاقط شنت إلى موقفها النهائي (الوصول إلى كأس الإيثان). عند إعدادها بشكل صحيح ، ستصل الشبكة التي تحتفظ بها الملاقط إلى مركز كوب الإيثان السائل تقريبا.
13. تحقق من أن "تشغيل البرنامج النصي" سيستخدم معدلات التدفق ووحدات التخزين والتوقيت المطلوبة. راجع القسم 'تسلسل التشغيل' أعلاه للحصول على التفاصيل.
14. تأكد من أن لا شيء يعيق مسار المكبس. يستنشق حجم المخزن المؤقت المطلوب لتشغيل واحد في حقنة 1. ويتم ذلك في برنامج التحكم، راجع قسم "تسلسل التشغيل" لإعداد نموذجي ووحدات التخزين. ثم تأكد من تحويل الصمام 1 إلى وضع "الاستغناء". إجراء اختبار تشغيل عن طريق الضغط على تشغيل البرنامج النصي في برنامج التحكم.
    تنبيه: ابتعد عن TED حتى ينتهي تسلسل التشغيل. الأجزاء المتحركة يمكن أن تسبب الإصابة!
15. عند الانتهاء من "تسلسل التشغيل"، قم بتعيين الضغط على الذراع المنغمس إلى القيمة المطلوبة (عادة 1-2 بار). ثم فقط اضغط موافق في برنامج التحكم للافراج عن الضغط من الذراع يغرق. إذا كان "تسلسل التشغيل" أو الضغط على الذراع المغرق بحاجة إلى تعديل ، فقد يتم تغيير هذه الإعدادات في هذه المرحلة والخطوات 1.13 - 1.15 المتكررة.

2. إعداد الشبكة السريعة

1. ملء السائل الإيثان / النيتروجين حاوية الأولى مع النيتروجين السائل. عندما تكون باردة بما فيه الكفاية وخالية من النيتروجين السائل، وملء الكأس مع الإيثان السائل. تجنب تجسيد الإيثان السائل. هذه الخطوة هي نفسها لإعداد الشبكة التقليدية.
   ملاحظة: لتقليل تلوث الإيثان، تأكد من تنفيذ الخطوات 2.2 -2.13 في أسرع وقت ممكن
   تنبيه: الإيثان السائل هو cryogen والقابلة للاشتعال. يجب توخي الحذر عند التعامل معها.
2. إعداد شبكات التبريد م لتوهج التفريغ. نحن عادة ما نستخدم شبكات الكربون هولي وتوهج التفريغ لمدة 90 ثانية، في ضغط الهواء 0.1 mbar و 10 MA. عادة، لا يتم تفريغ أكثر من 4 شبكات في وقت واحد. وتستخدم الشبكات في غضون 30 دقيقة من توهج تفريغ.
3. إعادة توازن الأنابيب مع عينة (باتباع الخطوات 1.9.1 - 1.9.5، باستخدام عينة بدلا من المخزن المؤقت). إذا كان حجم العينة المتوفرة منخفضا، فقد يتم إعادة توازن الأنابيب بحجم واحد فقط.
4. يستنشق كمية العينة المطلوبة لتشغيل واحد في حقنة 1 في برنامج التحكم (انظر القسم 'تسلسل التشغيل' للحصول على التفاصيل). ثم قم بتبديل الصمام 1 إلى موضع "الاستغناء".
5. تأكد من أن الرطوبة النسبية قد وصلت إلى القيمة المطلوبة (نحن عادة ما نعد الشبكات بنسبة 60٪ رطوبة نسبية أو أعلى). بمجرد ≥ الرطوبة 60 ٪ يتم التوصل إليها ، وفتح غرفة الرطوبة فقط لفترة ضئيلة من الوقت ، للحفاظ على رطوبة عالية.
6. ضع الملاقط ، مع عقد شبكة توهج تفريغها ، في المكبس الهوائي وإصلاحها. نقل المكبس إلى موضع البداية (في الأعلى).
7. تأكد من أن شريط التمرير الخاص بمقياس القوة في موضع البداية ، جاهزا للقياس ، عن طريق تحريكه يدويا للاتصال بالمغطاس. تعيين المشغل على منظار الذبذبات في برنامج الذبذبات.
8. ضع حاوية الإيثان/النيتروجين السائلة.
9. اضغط على تشغيل البرنامج النصي في برنامج التحكم. عند مطالبتك، انقر فوق موافق في برنامج التحكم لبدء التشغيل.
   تنبيه: ابتعد عن TED حتى ينتهي تسلسل التشغيل. الأجزاء المتحركة يمكن أن تسبب الإصابة!
10. بمجرد الانتهاء من "تسلسل التشغيل" ، قم بتحرير الضغط على المكبس الهوائي بالنقر فوق موافق في برنامج التحكم.
11. فتح غرفة الرطوبة، وتخفيف الصلة بين الذراع يغرق وملاقط بيد واحدة في حين تأمين ملاقط مع الآخر. عندما تكون الملاقط حرة، تحريك الذراع يغرق مع الحفاظ على الشبكة في الإيثان السائل. ثم نقل الشبكة إلى مساحة التخزين في السائل المحيط N₂. بعد التجميد، يجب الاحتفاظ بالشبكة عند درجة حرارة N₂ السائلة في جميع الأوقات.
12. حفظ قياس الذبذبات. يدويا إعادة تعيين موقف شريط التمرير عداد القوة والغطاس بعد ذلك.
13. كرر الخطوات 2.4-2.12 لإعداد شبكات النسخ المتماثل
14. نقل الشبكات إلى التخزين طويل الأجل حتى قص الشبكة وجمع البيانات.
15. اغسل النظام بالمخزن المؤقت، وفقا للخطوات 1.9.1 - 1.9.5. ثم غسل النظام مع H₂O، وفقا للخطوات 1.9.1 - 1.9.5.
16. إيقاف منظم غاز النيتروجين الرئيسي وإيقاف تشغيل الطاقة.
17. ضع حاوية الإيثان/النيتروجين في غطاء الدخان للسماح لها بالإحماء والسماح للسيل إيثان وN_{2 بالتبخر.}

3. وقت حل cryo-EM

ملاحظة: عند إجراء التجارب التي تم حلها مع TED، هناك جوانب إضافية يجب مراعاتها، على الرغم من أن الإعداد الأساسي والمتغيرات تبقى كما هي. ويفترض هنا أن هناك حلين مختلطين في نسبة 1:1 (v/v) لإنتاج الخليط النهائي الذي يتم إيداعه على الشبكة. اتبع البروتوكول الموضح في '1. إعداد الشبكة بسرعة مع TED' ، مع التغييرات التالية:

1. استخدام تركيزات المخزون أعلى لتجارب خلط من لتجارب رش بسيطة. خلط في 1:1 (v/v) نسبة سيؤدي إلى تخفيف 2X من كل عنصر.
2. لتجربة خلط سريع، استخدم جميع المحاقن الثلاثة بدلا من حقنة واحدة فقط.
   1. إرفاق أنابيب إلى مضخات حقنة 2-3.
   2. إرفاق أنابيب من مضخات حقنة 2-3 إلى فوهة رذاذ.
   3. توازن جميع المحاقن الثلاثة في العازلة وعينة على حدة. عادة، يتم تعبئة حقنة 1 مع عينة A والمحاقن 2-3 تمتلئ العينة B (الشكل 3).
3. تغيير تسلسل التشغيل. مثال على تسلسل تشغيل باستخدام جميع المحاقن 3 لتجربة خلط السريع هو في الشكل 6. انظر أيضا قسم "تسلسل التشغيل" للحصول على التفاصيل.
4. يمكن تحقيق تأخيرات زمنية مختلفة بطريقتين:
   1. تغيير سرعة المكبس. عن طريق ضبط سرعة المكبس، يمكن تغيير تأخير الوقت في نطاق ضيق نسبيا. على سبيل المثال، مع مسافة رذاذ / الإيثان من 2 سم، يمكن نقل المكبس في 1 م / ثانية أو 2 م / ث لإعطاء تأخير زمني قدره 20 مللي ثانية أو 10 مللي ثانية، على التوالي. ويتم ذلك على النحو المبين في الخطوة 1-15.
   2. تغيير موقف رذاذ / الإيثان عن طريق ضبط الموقف (العمودي) من فوهة رذاذ. إذا تم وضع الفوهة على مسافة 5 سم من سطح الإيثان ، على سبيل المثال ، فإن سرعة الهبوط 1 م / ث تعطي تأخيرا زمنيا قدره 50 مللي ثانية. يتطلب تحقيق تأخيرات زمنية أطول بكثير إجراء مزيد من التعديلات على الإعداد.
      ملاحظة: بسبب تدفق صفح في منطقة التركيز تدفق الفوهة، ونحن لا نتوقع خلط كبيرة في هذا الجزء من فوهة. بدلا من ذلك، نتوقع أن يحدث الاختلاط أثناء توليد الرش، في قطرات في طريقها إلى الشبكة وأثناء انتشار القطيرات على الشبكة. ويقدر وقت الطيران لرذاذ قطرات للوصول إلى الشبكة ≤ 1 مللي ثانية (لسرعة قطرة من ≥ 10 م / ث ومسافة شبكة فوهة من 1 سم). وبالتالي، فإن الوقت بين هبوط القطيرات والتزجيج هو وحده الذي يعتبر "التأخير الزمني".

Representative Results

إعداد الشبكة بسرعة مع TED
كعينة اختبار لإعداد الشبكة السريعة ، استخدمنا أبوفريتين من طحال الخيول بسرعة 20 ميكرومتر في 30 mM HEPES ، 150 mM NaCl ، درجة الحموضة 7.5. تم الحصول على إعادة بناء في القرار 3.5 ألف من 690 ميكروجراف كما هو موضح في المرجع¹⁵ (الشكل 7A). تم اختيار نطاق defocus بحيث يمكن التعرف بسهولة على الجسيمات في الصور الخام(الشكل 7B). تظهر الشبكة النموذجية المعدة مع تأخير زمني من 10-40 مللي ثانية مساحات كافية من الجليد الرقيق(الشكل 7C)للسماح بجمع > 1000 ميكروجراف. القرار الناتج هو على الأرجح محدودة من سمك الجليد، أظهر التحليل الطبوغرافي لعدد من الشبكات المختلفة 96 ± 33 نانومتر سمك الجليد⁶.

التبريد-EM الذي تم حله زمنيا
من أجل إظهار الخلط السريع ودقة الوقت باستخدام تيد، استخدمنا فصام مجمع actomyosin عن طريق الاختلاط مع ATP كرد فعل نموذجي¹⁹. واستند هذا الاختيار على التمييز السهل بين actomyosin وF-actin الحرة من micrographs الخام والحركية مفهومة جيدا من رد الفعل.

وفيما يلي، تظهر النتائج التمثيلية لTrEM من تفكك مجمع actomyosin بواسطة ATP. وترد الإجراءات والنتائج التجريبية التفصيلية في المرجع^19. باختصار، تم خلط F-actin والأرنب الهيكل العظمي myosin S1 في 10 M MOPS، 50 MM KAc، 2 mM MgCl_2،0.1 mM EGTA، درجة الحموضة 7 في تركيزات مونومر النهائي من 40 ميكرومتر لإعداد مجمع actomyosin (AM). تم تحميل مجمع AM في حقنة 1 و 200 ميكرومتر مغاتب في نفس العازلة تم تحميلها في المحاقن 2 و 3. يتم سرد المعلمات التجريبية الرئيسية للنقاط الزمنية المختلفة اثنين المعدة في الجدول 1.

بالنسبة لكلا النقطتين الزمنيتين، كانت النتيجة خليطا 1:1 v/v من مركب AM و MgATP، مما أعطى تركيزات نهائية من 20 ميكرومتر AM مركب و 100 ميكرومتر ملغاتب. وكان الاختلاط المحسوب لأوقات التجميد 7 و 13 مللي ثانية كما هو مبين في الجدول 1. وكان الوقت المقدر للرحلة لقطرات رذاذ بين فوهة والشبكة < 1 مللي ثانية.

تم الحصول على مجموعة بيانات صغيرة من cryo-EM (306 و 123 ميكروجراف) لكل نقطة زمنية ومعالجة البيانات المجمعة باستخدام إجراءات المعالجة الهزلية القياسية^20. ويظهر إعادة الإعمار التوافقي الناتج (كلتا النقطتين معا) في الشكل 8A. ثم تم إخضاع البيانات المجمعة لتصنيف مركز وانقسمت إلى فئة AM-complex وF-actin(الشكل 8B، C). ثم تم حساب جزء من جسيمات AM-complex أو F-actin لكل نقطة زمنية ويظهر في الشكل 8D.

معدل الترتيب الثاني ثابت للتفكك AM-المعقدة هو 1.5 · 10⁶ م^-1 ق^-1 21. على افتراض أن

يمكن تقريب قانون المعدل المتكامل إلى:

حيث [AM-complex] هو التركيز المعتمد على الوقت من AM-complex، [AM-complex]₀ هو التركيز الأولي، k هو ثابت معدل الدرجة الثانية و [ATP]₀ هو تركيز ATP (الأولي).

باستخدام هذه المعادلة، تم نمذجة حركية التفكك AM-المعقدة. النموذج يتفق بشكل جيد إلى حد معقول مع البيانات التجريبية TrEM. هناك اختلاف كبير لكل ميكروجراف كما هو موضح في الشكل 8D.

الشكل 1:جهاز EM الذي تم حله زمنيا (TED). (A) نظرة عامة على TED. (ب) وحدة المناولة السائلة مع مضخات 1-3. لا يتم استخدام المضخة الرابعة على اليسار في هذا العمل. تتم الإشارة إلى وضعية التحميل والاستغناء للصمام 1، وكذلك خزان العينة ('العينة 1'). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2:المكبس الهوائي ومقياس القوة الخطي. (أ) تفاصيل المكبس الهوائي لل تيد مع مكونات هامة وصفت. (ب) تخطيطي للنظام الهوائي لل TED. أرقام تتوافق مع N₂ اسطوانة (1), منظم الضغط الرئيسي (2), فوهة رذاذ (3), صمام سولينويد (4), منظم سرعة الهبوط (5) ومزدوج قضيب اسطوانة هوائية (6). (ج)تخطيطي للدائرة لمقياس القوة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3:فوهات افتراضية ديناميكية للغاز للخلط والرش. (أ) فوهة مع 4 أنابيب مدخل متصلة، لتوريد عينات (A و B) والغاز N_2. (ب)التخطيطي للقسم المركزي من فوهات رذاذ PDMS مع تدفق مزدوج تركز الهندسة لتحقيق التركيز على تدفق (لخلط المصب) والتركيز على الغاز أو الانحلال. تظهر العينة B باللون الأصفر و العينة A باللون الأرجواني. (ج) صورة مجهرية لأقسام الاختلاط والانحلال من فوهة microfluidic. صورة من^{المرجع.} شريط مقياس 100 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التحكم البيئي للشبكة والرش في صندوق زجاج الاكريليك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تسلسل التشغيل. (أ) مثال تشغيل تسلسل يظهر المتغيرات في الأعلى وتسلسل الأوامر في الأسفل. بعض أوامر المفاتيح مشروحة باللون الأحمر. (ب) موضع الشبكة على مدار الوقت من "تسلسل التشغيل" كما هو موضح كخط صلب أسود. موضع بداية الشبكة هو 0 سم. يبدأ الرذاذ عند t = 0 s لمدة 2 ثانية ، والمسافة بين الرذاذ والإيثان السائل ~ 2 سم. عند 1.5 ثانية ، تبدأ الشبكة في التحرك بسرعة 2 م / ث ، من خلال الرذاذ وإلى الإيثان السائل. ينتهي التسلسل مع توقف الرش بعد 2 s. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: مثال تشغيل تسلسل لتجربة خلط سريع. الاختلافات الهامة في الشكل 5 A مشروحة باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: النتائج التمثيلية لتجربة رش بسيطة. (A) 3.5 Å إعادة بناء أبوفيريتيين الخيول من شبكة أعدت في 36 مللي ثانية بين الرش والتزجيج (EMD- 10533). (ب) صورة الخام من عينة apoferritin نفسه. (ج) عرض التكبير منخفضة من الشبكة، يتم تسليط الضوء على واحد نموذجي الشبكة مربع يحتوي على الجليد رقيقة من المستطيل الأزرق محطما، ويشار إلى مساحة الجليد رقيقة داخل هذه الشبكة مربع من قبل السهم الأزرق. ويشار إلى مناطق الجليد السميك أو التلوث بالعلامات النجمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: النتائج التمثيلية لتجربة خلط. (أ) إعادة بناء توافق الآراء من AM-المعقدة هو مبين على عتبة عالية (ملونة) و عتبة منخفضة (شفافة). يتم وضع علامة على كثافة الميوسين واحدة وتسليط الضوء عليها مع خط متقطع. وقد تم إنشاء إعادة الإعمار من البيانات من كلتا النقطتين الزمنيتين مجتمعتين. (ب) F-actin فئة تظهر أي myosin ملزمة. (C) AM-فئة معقدة تظهر الميوسين ملزمة (myosin باللون الرمادي, ملزمة أساسا إلى وحدة فرعية actin الأحمر الفاتح). (د)مقارنة بين نموذج الحركية والبيانات TrEM التجريبية. يظهر هو جزء من AM-معقدة بالنسبة للتركيز الأولي. تشير النقاط السوداء الصلبة الكبيرة إلى متوسط بيانات TrEM ، وتظهر النقاط الصغيرة بيانات TrEM لكل ميكروجراف. يمثل الخط الأرجواني المتقطع النموذج الحركي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

	معدل التدفق (ميكرولتر/ثانية)			مسافة الرش/الإيثان (سم)	سرعة الهبوط (م / ثانية)	تأخير الوقت (ms)
	حقنة 1	حقنة 2	حقنة 3
	(صباحا)	(ATP)	(ATP)
7 مللي ثانية	2.08	1.04	1.04	1.4	2	7
13 مللي ثانية	1.04	0.52	0.52	2	1.6	13

الجدول 1: الإعدادات التجريبية لTrEM من التفكك المركب AM بواسطة ATP

Discussion

يمكن استخدام البروتوكولات في هذا العمل لإعداد الشبكة بسرعة عن طريق الرش المباشر وتجارب TrEM. يمكن استخدام إعداد الشبكة السريعة للحد من تفاعلات الجسيمات مع واجهة مياه الهواء⁵. القيود الرئيسية هي تركيز العينة المتاحة وسمك الجليد على الشبكة. ضمن هذه الحدود وشريطة أن تكون جودة العينة جيدة، ينتج البروتوكول شبكات مناسبة للكريو-EM عالية الدقة.

استكشاف الاخطاء
يحدد معدل تدفق السائل وسرعة الشبكة كمية السائل المودع على الشبكة. مع إعدادات المثال المذكورة أعلاه (معدل تدفق السائل 5 ميكرولتر / ثانية وسرعة الهبوط 1-2 م / ث) ، ومن المتوقع تغطية جيدة للشبكة مع قطرات. إذا لم يتم محاذاة الفوهة بشكل جيد (لذلك تفوت قطرات الرش الشبكة) ، فإن الشبكات المجمدة تظهر عددا قليلا جدا من القطرات أو لا تظهرها.

ولا يمكن تجنب تلوث الشبكات تماما (انظر الشكل 7C)ولكن يمكن تقليله عن طريق تقليل وقت تعرض الإيثان السائل إلى بيئة رطبة. ويتحقق ذلك عن طريق إعداد شبكات النسخ المتماثل في أسرع وقت ممكن (≤ 20 دقيقة ل4 شبكات). نحن عادة إعداد 4 شبكات قبل استبدال الإيثان السائل.

قد يتبلور الجليد الزجاجي على الشبكات (جزئيا) إذا كان التبريد الأولي في الإيثان السائل بطيئا جدا. بالاتفاق مع دراسة سابقة²²، وجدنا سرعات هبوط منخفضة (< 0.5 م / ثانية) تؤدي إلى زيادة الجليد البلوري. مناطق من الجليد سميكة جدا (≥ 200 نانومتر) تظهر عادة الجليد البلوري بسبب التبريد أبطأ بطبيعتها. إذا كانت الشبكة تسخن خلال أي من الخطوات التالية لإعداد الشبكة (نقل من الإيثان السائل إلى النيتروجين السائل، ونقل إلى التخزين، الخ)قد يحدث الجليد البلوري، أيضا.

الحصول على البيانات لشبكات TED المعدة
متوسط سمك الجليد الذي تنتجه تيد هو أكثر سمكا من "مثالية" شبكة التبريد م أعدت على نظام النشاف القياسية. كما يمكن أن يختلف سمك الجليد بين مناطق الاستحواذ. وهذا يعني أن مناطق الاستحواذ تحتاج إلى اختيار بعناية لإعطاء أنحف الجليد ممكن. قد تحتاج إلى ضبط نطاق defocus للحصول على صور التباين العالي. عندما يكون الجليد سميكا ويكون للجسيمات تباين منخفض ، نقترح الحصول على بيانات تجريبية أولية باستخدام قيم ديفوكوس عالية جدا (3 - 5 ميكرومتر). تشير الأعمال الحديثة إلى أنه لا يزال من الممكن تحقيق دقة عالية باستخدام قيم defocus عالية^23.

لجمع البيانات التقليدية cryo-EM، غالبا ما يتم جمع مجموعة بيانات كاملة من شبكة واحدة. ومع ذلك، وجدنا أن جمع مجموعات بيانات صغيرة متعددة ودمج مجموعات البيانات هذه مفيد. وبهذه الطريقة، يمكن تسجيل نقاط زمنية متعددة في غضون وقت مجهر محدود ويمكن تحديد النقاط الزمنية ذات الاهتمام.

معالجة وتحليل بيانات TrEM
يمكن دمج مجموعات البيانات بشكل روتيني في معظم برامج معالجة البيانات cryo-EM الشائعة. كما هو موضح أعلاه وفي عمل الآخرين ، يمكن أن يكون دمج مجموعات البيانات من نقاط زمنية منفصلة مفيدا¹⁷. من المهم أن يمكن تتبع الجسيمات إلى المجموعة الفرعية الأصلية (timepoint) طوال المعالجة.

يمكن أن تكون القياسات الحركية التقليدية (على سبيل المثال باستخدام تشتت الضوء أو الفلورسينس) إضافة قيمة لتجارب TrEM. يمكن استخدام ثوابت المعدل من القياسات الكيميائية الحيوية للتنبؤ بمدى عمر الحالة المتوسطة للاهتمام، أو في تأكيد الحركية التي لاحظها TrEM. للحصول على مقدمة أساسية لمحركية التفاعل وعلاقتها بالدراسات الهيكلية التي تم حلها زمنيا، راجع المرجع^24.

هناك عدد من الأسباب المحتملة للاختلافات بين TrEM والتجارب الحركية التقليدية. كما هو موضح في الشكل 8D، يمكن أن تظهر بيانات TrEM اختلافات كبيرة لكل ميكروجراف. كما نلاحظ أن البيانات الأولية تشير إلى تباين بنسبة 5٪ على الأقل في أعداد الجسيمات النسبية بين الشبكات المتماثلة. تصنيف الجسيمات (تعيين الفئة) يمكن أن يكون ناقصا، لا سيما إذا كانت الدول متشابهة هيكليا أو إذا كان الهيكل مرنا للغاية. كما أن الجسيمات، وبالتالي الحركيات المشتقة من TrEM، قد تتأثر أيضا بتفاعلات الجسيمات مع واجهة الهواء والماء لأن هذه التفاعلات يتم تقليلها ولكن لا يتم القضاء عليها بسرعات سريعة.

يوفر هذا العمل بعض المبادئ التوجيهية لTrEM ولكننا نلاحظ أن هذا مجال نشط للبحث ، ونتوقع المزيد من التقدم في المستقبل. في حين أن تجارب TrEM تتطلب جهدا تجريبيا كبيرا ، إلا أنها يمكن أن تقدم رؤية عالية الدقة لديناميكيات المجمعات الجزيئية الكلية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Time resolved device
acrylic glass box	USA scientific
digital humidity/temperature controller	THE20 digital humidity/temperature controller
dual rod pneumatic cylinder	dual rod pneumatic cylinder TN 10x70
FEP tubing	Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing
flangeless fittings	Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings
flexible reinforced PVC tubing	12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing
glass syringes	Kloehn 250 µL zero-dead volume
humidifier pump	Interpret Aqua Air AP3
liquid ethane container	from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
multistage regulator	GASARC class 3 multistage regulator
negative pressure tweezers	Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers
oscilloscope	Hantek 6022BE oscilloscope
PE tubing	Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing
power supply	Mean Well GSM160A24-R7B
power supply	Wanptek KPS305D power supply
PU tubing	SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing
regulator	Norgren R72G-2GK-RMN
slide potentiometer	PS100 slide potentiometer
solenoid valve	SMC NVJ314M solenoid valve
syringe drive pumps	Kloehn V6 48K model
Reagents & Materials
apoferritin from equine spleen	Sigma-Aldrich, A3660
ATP	Sigma-Aldrich, A2383
cryo-EM grids	Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA	Sigma Aldrich E3889
F-actin	Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)
glow-discharger	Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit
HEPES	Sigma-Aldrich, H7006
KAc	Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2	Sigma-Aldrich, M8266
MOPS	Sigma-Aldrich, M1254
NaCl	Sigma-Aldrich, S9888
Skeletal muscle myosin S1	Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)
Ref 1	Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).
Ref 2	White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).