Summary
ここでは、高速グリッド作成用の高速グリッド製造装置の使用と、時間分解実験を行うための迅速な混合と凍結の両方に関する詳細なプロトコルを提供します。
Abstract
クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の分野は、新しいハードウェアと処理アルゴリズムで急速に発展しており、より高い解像度の構造と、より困難なシステムに関する情報を生み出しています。cryo-EMのサンプル調製は、従来のブロッティングシステムに取って代わる新しいアプローチで同様の革命を起こしています。これらには、ピエゾ電気ディスペンサーの使用、ピン印刷および直接噴霧が含まれる。これらの開発の結果、グリッド調製の速度は数秒からミリ秒に進み、特にタンパク質と基質が急落凍結の前に急速に混合され、短命の中間状態を捕捉できる時間分解型クライオEMの分野で新たな機会を提供しています。ここでは、標準の高速グリッド準備と時間分解実験の両方のために、社内の時間分解EMデバイス上でグリッドを作成するための標準プロトコルを詳細に説明します。このプロトコルは、4グリッドの調製のために、2 mg/mLの≥濃度で、最低約50 μLのサンプルを必要とします。サンプルアプリケーションと凍結の間の遅延は10ミリ秒と低くすることができます。1つの制限は、より速い速度で氷の厚さを増加させ、ブロッティング法と比較することです。私たちは、このプロトコルが他の人が自分のグリッド作りデバイスを設計し、時間を解決した実験を設計することに興味を持っている人を助けることを願っています。
Introduction
バックグラウンド
最近のクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の発展により、高分解能でますます複雑化するシステムの構造研究が可能になりました。いくつかの例外を除いて、このような研究は平衡1 または比較的遅い反応2での生体高分子に限定されてきた。 インビボの 多くのプロセスは、より速いタイムスケール(ミリ秒)で発生し、これらのタイムスケール3で時間分解クライオEM(TrEM)への関心が高まっています。しかしながら、ブロッティング法による従来のクライオEMサンプル調製は、ミリ秒TrEMには遅すぎる。
ブロッティング法には、時間分解能の低さ以外にも制限があります。タンパク質およびタンパク質複合体は、格子4上で変性または好ましい向きに苦しむことができる。サンプル調製中の空気水界面への曝露時間を短縮することは、好ましい配向及びタンパク質変性5,6を緩和することが示されている。したがって、高速グリッドの準備はミリ秒のTrEMを可能にするだけでなく、グリッドの品質を向上させることができます。
現在、グリッドの自動準備には 3 つの異なるアプローチがあります。最初のアプローチでは、少量のサンプルを保持するピンまたはキャピラリーを使用します。液体とグリッド表面の間に接触を確立した後、サンプルはグリッド7、8に「書き込まれる」。サンプルアプリケーションプロセスは比較的遅く、数秒かかります。別のアプローチは、ピエゾディスペンサーと自己ウィッキンググリッド9によって制御された液滴生成を使用しています。これにより、より速いディスペンスが時間を凍結することができますが、まだドロップレットとウィッキング速度(現在54 msに達する)によって制限されています。これまでの最速アプローチは、サンプルがスプレーノズルと小さな(〜10〜20μm)と高速(>5 m/s)の液滴がクライオEMグリッドと接触したときに広がる直接スプレーアプローチです。サンプルスプレーは、エアブラストアトマイザー、表面音響波または超音波加湿器10、11、12、13などのさまざまな方法で生成することができる。私たちの経験では、直接噴霧アプローチと氷の厚さは大きいですが、直接噴霧は、分配剤が10ミリ秒<時間凍結することを可能にします。
このプロトコルは、マイクロ流体スプレーノズルを搭載した時間分解EMデバイス(TED)を使用して、高速タイムスケール14,15でグリッドを準備する方法をステップバイステップで説明しています。このデバイスは、サンプルアプリケーションと凍結の間に6ミリ秒の最小遅延時間でグリッドを準備し、2つのサンプルを迅速に混合および凍結するために使用されています。TED の設計は、以前のバージョン16に基づいており、他のスプレーベースの時間分解クライオ EM デバイス17に似ています。
まず、TED セットアップの 4 つの主要な部分について説明します。TEDのコアは、サンプル吸引と分配を担当する液体取扱ユニットです。空気プランジャーは、スプレーを通して液体エタンにグリッドを移動します。噴霧の生成はマイクロ流体噴霧ノズルで達成され、凍結は、簡単に説明される液体エタン容器で行われる。最後に、グリッド環境、特に湿度を制御する追加機能が強調表示されます。この後、デバイスの動作とTrEM実験を行うための詳細なプロトコルが続きます。高速グリッドの準備と簡単な TrEM 実験の代表的な結果が得られます。
実験用セットアップ
液体の取扱い単位
TEDの液体取扱システムは、3つのシリンジ駆動ポンプ('ポンプ1-3')によって形成され、それぞれにロータリーバルブが装備されています(図1)。電源モジュールは、24 V DC を備えたポンプ 1 ~ 3 を提供します。制御ソフトウェア (Visual Basic および C++ で記述された) との通信は、RS232 インターフェイスを介して 1 をポンプで送ります。コマンドは、シリアルI/O拡張ポートを通じてポンプ1からポンプ2-3に配信されます。ポンプ1-3はガラスの注射器が装備されている('シリンジ1-3'、我々はここで250 μL/ゼロデッドボリュームシリンジを使用する)。各バルブには、「負荷」と「ディスペンス」の2つの位置があります。「負荷」位置は、注射器にサンプルを吸引するために使用されます。1/16の短い部分(3 - 4 cm)O.D.、0.01′'I.D.FEPチューブは、ETFE / ETFEフラレンス継手を介してバルブ1-3の「負荷」位置に接続されます。この短いチューブは、サンプルリザーバ(通常は1.5 mLまたは0.5 mLのプラスチックチューブ)に届きます。「ディスペンス」位置はスプレーノズルに導く。「ディスペンス」出口とスプレーノズルの間の接続は、PEチューブ(〜20〜30 cmの長さ、0.043"O.D.、0.015"I.D.)、スリーブチューブ(〜0.5cm)とETFE / ETFEフラレンスフィッティングの短い部分で行われます。
空気圧プランジャー
TEDは空気式プランジャーを使用してグリッドを加速し、サンプルスプレーを通して液体エタン容器に移動します。負圧ピンセットは、グリッドを保持し、二重ロッドの空気圧シリンダに取り付けられた自家製ホルダーにねじ込みます(図2A)。
圧力は大きい窒素ガスのシリンダー(サイズW)から供給され、多段調節器(0- 10棒、'主圧力')が装備されている。フレキシブル強化PVCチューブ(12 mm O.D.)は、加圧窒素がノズルと空気プランジャーに送達される12ポートマニホールドにレギュレータを接続します。ノズルを通るガス流は一定であり、窒素シリンダー(主圧)で直接調節される。ノズルへの接続はPUチューブ(4 mm O.D.、2.5 mm I.D.)、短いPEチューブ(〜8 cmの長さ、0.043"O.D.、0.015"I.D.)および適切なコネクタで行われます。空気のプランジャーの圧力はソレノイド弁によって制御される。PUチューブ(4 mm O.D.、2.5 mm I.D.)は、ソレノイドバルブとレギュレータと空気圧プランジャーを接続して、プランジ圧力(≤主圧)を低減します。ソレノイド弁はコンピュータ制御される。セットアップの概略図の概要を 図 2Bに示します。
この設定では、プランジ圧力は常にスプレーガス圧(主圧)と同等または小さいことに注意してください。しかし、セットアップは、低スプレーガス圧力でより高いプランジ速度を可能にするために、スプレーノズルの第2のレギュレータの上流を組み込むことによって容易に変えることができる。高圧(>>2バー)はPDMSのスプレーノズルを損傷する可能性があります。
注意:これは加圧システムであり、「主圧力」は常に7バー<する必要があります。
0.5~2バー間の圧力は、通常、空気圧プランジャーに使用され、圧力と速度(スプレーの垂直位置)の間にほぼ直線的な関係を示します。プランジ速度は、スライドポテンショメータ(10 kΩ)と平行に接続されたオシロスコープで測定されます(図2C)。電源は9 V DCをポテンショメータに提供します。プランジ圧力を設定して実験前に近似プランジ速度を設定しますが、ポテンショメータは実験後の速度を正確に読み出します。
スプレーノズルと液体エタン容器
噴霧ベースのサンプル送達のためのガス動的仮想ノズルの製造と動作については、詳細15の他の場所で説明されている。上述したように、バルブ1~3の「ディスペンス」出口は、ノズルの液体入口に接続されている(図3A)。加圧スプレーガスは、ノズルのガス入口に接続されています。PDMSスプレーノズルの入口は、0.043インチO.D.PEチューブが継手を必要とせずに直接使用できるようなものです。私たちのノズルの設計はref.18で説明されている装置と同様に、2つのサンプルを混合するための「ジェットインジェット」幾何学を含んでいる。図 3Bに設計の概略を示す図3Bは、ノズルの顕微鏡画像を 図3Cに示す。マイクロ流体デバイスのレイアウトには、2つのサンプルを混合するために3つの注射器を使用する必要があります。スプレーノズルは、通常、(サンプルアプリケーション中)、グリッドから1〜1.5センチメートルの距離に配置されます。
液体エタンを、標準的なブロッティング法に使用する液体エタン/窒素容器に入れ、凍結剤として使用しています。液体エタンカップの縦位置は実験室の持ち上がるプラットホームと達成される。
スプレーおよびグリッド環境の制御
プランジャーとスプレーノズルは、カスタム構築されたPMMA(アクリルガラス)ボックスに含まれており、ダブルドアが付いています(図4A)。箱の中の高い相対湿度はTEDの後部の空気加湿システムによって達成される(図4B)。空気はポンプによって供給され、最初の10"キャニスターに供給される(通常、シンク水浄化の下で使用される)。キャニスターは水の低い(〜5-10 cm)レベルで満たされ、また加湿器の単位を収容する。加湿器への主電源は、デジタル湿度/温度コントローラとアクリルガラスボックス内にある湿度/温度センサーによって制御されます。相対湿度が90%に達すると、コントローラはポンプをオフ≥設定されています。最初のキャニスターからの加湿空気は、拡散器を通してポンプで送られ、第2の10"キャニスターに水に浸漬し、次いでアクリルガラスボックスに入る。
注意: サンプルはスプレーノズルでエアロゾル化されるため、有害な生物学的または化学的標本はサンプルとしては適していません。
実行シーケンス
コントロール ソフトウェアの [スクリプトの実行 ] ボタンをクリックすると、実行シーケンスが開始されます。この一連のコマンドは、スクリプトファイルで事前定義され、ソフトウェアを介して変更できます。最も重要な変数は、ここで説明します。
スプレー速度: スプレー速度は、シリンジポンプで使用される液体流量を決定します。流量は次のように計算することができます:ここで使用されるシリンジポンプモーターは固定のステップサイズを有する。ポンプの全範囲は48,000ステップに分けられる。2番目の重要な要素は、シリンジの体積です。通常は250μLのシリンジを使用します。制御ソフトウェアの噴霧速度は、ステップ数/秒として設定されます。1000ステップ/秒のスプレー速度は次の通りです:
スプレー量: スプレーの容積は、スプレーされる総容積を決定します。これにより、スプレーの持続時間も決定する。制御ソフトウェアのスプレーボリュームは、いくつかのステップとして設定されます。2000ステップのスプレー容積は1000ステップ/秒のスプレー速度で、2 sのスプレー持続時間および10.4 μLの総容積に導く。
プレスプレー時間:この変数は、スプレーの開始とプランジの開始までの時間を定義します。噴霧がグリッドを突っ込む前に安定するのに十分な時間を持つような遅延時間を選択することが重要である。通常、スプレーは、グリッドが突っ込む前に安定させるために1.5〜4 sを与えられる。スプレーは、グリッドが通過するまで維持されます。通常、液体の流れ(したがって、スプレー)は、グリッドが急落した後、0.5〜1 s停止します。1000ステップ/sのスプレー速度と2000ステップのスプレー量を使用して、典型的なプレスプレー時間は、例えば1.5 sです。
例示的な一連のコマンドを図 5Aに示しますが、グリッド位置を時間の経過としますが、 図 5Bに示します。
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Protocol
1. システムの準備
注: 次のプロトコルは、単一サンプルのグリッドを準備する方法を説明します。通常、サンプルまたは条件ごとに少なくとも 2 つの複製グリッドが用意されています。より速いプランジ速度(〜20 ms時間遅延未満)のために、3または4の複製グリッドは、通常、薄い氷領域の減少を考慮して準備されています。
- 目的のバッファー内の標的濃度にタンパク質サンプルを希釈します。通常、2 mg/mL≥最終濃度はTEDでのグリッド調製に適しています。サンプルはステップ10まで氷上に保つことができるので、ステップ10以降のサンプルは3-4グリッドを調製するのに約20分かかるため、室温でかなりの時間を費やします。
- TED をオンにします。その後、コントロールPCの電源を入れ、コントロールソフトウェアを起動します。
- 各シリンジポンプの 初期化 ボタン(下黒ボタン)を押して、すべてのシリンジポンプを初期化します。
- ポテンショメータの電源をオンにし、9 Vに設定してオシロスコープ制御ソフトウェアを起動します。
- N2-シリンダーのレギュレータバルブが閉じられていることを確認します。シリンダーバルブを開きます。次いで、出口圧力を噴霧ガス圧(通常1~2バール)に所望の値に設定するレギュレータバルブをゆっくりと開く。ここで使用するPDMSノズルの場合、ノズルの損傷を避けるために~2.5バール以上の圧力を使用しないでください。連続的に流れる気体は、ノズルチップに液体が滴下して蓄積するのを防ぎ、再現不可能な噴霧につながる可能性があります。
- すべてのシリンジポンプバルブが「負荷」位置にあることを確認します。これは、すべてのバルブを制御ソフトウェアの「ディスペンス」位置に切り替え、次に「負荷」に戻すことによって行うことができます。すべてのバルブを「負荷」に切り替えておいてください。すべてのシリンジをゼロに設定します。
- この段階でシステムに存在する気泡をすべて取り除きます。これを行うには、シリンジを緩め、気泡を手動で取り外し、もう泡を含まなくなったときに再び取り付ける注射器を取り付ける必要があります。
- 液体取扱成分は、通常、H2Oに保存される。サンプル溶液をロードする前に、過剰なバッファーでチューブを洗浄することによって液体系をバッファーで平衡化する。スプレーノズルの過圧を避けるために、適切な最大液体流量を使用してください。液体流量は10 μL/s>、ここで説明するPDMSノズルに損傷を与える可能性があります。
- 200 μL バッファー≥入った 1.5 mL チューブをシリンジ 1 に配置します(チューブに取り付けるには、上部をピアスする必要があります)。
- バルブ 1 が「負荷」位置に入っていることを確認します。必要に応じて、コントロールソフトウェアを切り替えます。
- 制御ソフトウェアを介して、シリンジ1のバッファーの所望量(通常50〜100 μL)を吸引する。
- 制御ソフトウェアを介して、バルブ1を「ディスペンス」位置に切り替えます。
- コントロールソフトウェアを介して、シリンジ1内のすべての液体を分配します。
- バルブを「負荷」に戻し、プログラムでシリンジ位置を「0」にリセットし、シリンジ1で初期化を押して、次のサイクルに向けてシステムを準備します。
注: 手順 1.9.1 ~ 1.9.5 は、チューブの完全な洗浄を確実にするために、通常 3 回繰り返されます。
- 突っ込んだアームクランプを緩め、ピンセットをクランプに入れてクランプを締めることで、EMグリッド(特定のタイプの要件なし)でピンセットをロードします。
- グリッドとノズルが同じ高さになるように、突っ込んだアームを手動で動かします(サンプルアプリケーションの位置)。ノズルとグリッドが揃っていると、長期間噴霧した後、グリッド上に液体が蓄積します。必要に応じて、ノズルの位置を調整します。
- 取り付けられたピンセットを持つ突っ込んだ腕を終了位置に手動で移動して、液体エタンカップの位置を調整します(エタンカップに到達)。正しく設定すると、ピンセットが保持するグリッドが液体エタンカップの中心近くにあります。
- 「実行スクリプト」が目的の流量、ボリューム、タイミングを使用することを確認します。詳細については、上記の「実行シーケンス」セクションを参照してください。
- プランジャーの経路を妨げるものは何もないようにしてください。1回のランに必要なバッファーの体積をシリンジ1に吸引する。これは、制御ソフトウェアで行われ、典型的な設定とボリュームについては「実行シーケンス」セクションを参照してください。次に、バルブ1が「ディスペンサー」位置に切り替えられることを確認します。コントロールソフトウェアで スクリプトの実行 を押してテストを実行します。
注意: 実行シーケンスが完了するまで TED をクリアします。可動部分は怪我を引き起こす可能性があります! - 「実行シーケンス」が終了したら、急降下アームの圧力を希望の値(通常は1-2バー)に設定します。その後、制御ソフトウェアで OKを 押して、急激な腕から圧力を解放します。突っ込んだアームの「実行シーケンス」または圧力を調整する必要がある場合、これらの設定はこの段階で変更され、ステップ1.13から1.15が繰り返されます。
2. 高速グリッドの準備
- 液体エタン/窒素容器を最初に液体窒素で満たします。十分に冷たく、液体窒素を含まない場合は、カップに液体エタンを充填します。液体エタンの固化を避けてください。このステップは、従来のグリッド調製の場合と同様である。
注: エタン汚染を最小限に抑えるには、ステップ 2.2 ~ 2.13 をできるだけ速く実行してください。
注意:液体エタンは凍結剤であり、可燃性です。取り扱いの際は注意が必要です。 - グロー放電用のクライオEMグリッドを用意します。私たちは通常、0.1 mbarの空気圧および10 mAで、90 sのための穴のあいたカーボングリッドおよびグロー放電を使用する。通常、一度に4つ以下のグリッドがグロー放電されます。グリッドはグロー放電の30分以内に使用されます。
- チューブをサンプルと平衡化します(バッファの代わりにサンプルを使用して、手順1.9.1から1.9.5を実行します)。使用可能なサンプルボリュームが少ない場合、チューブは1つのデッドボリュームのみで平衡化される可能性があります。
- 制御ソフトウェアのシリンジ1に対して1回の実行に必要なサンプルの量を吸引します(詳細については「実行シーケンス」セクションを参照)。次に、バルブ1を「ディスペンサー」位置に切り替える。
- 相対湿度が希望の値に達していることを確認します(通常、相対湿度60%以上でグリッドを用意します)。湿度60%に達≥、湿度室を最小限の時間だけ開き、高湿度を維持します。
- グロー放電グリッドを保持するピンセットを空気圧プランジャーに入れ、固定します。プランジャを開始位置(上部)に移動します。
- ポテンショメータのスライダーが開始位置にあり、測定の準備ができていることを確認します。オシロスコープソフトウェアのオシロスコープにトリガーを設定します。
- エタン/窒素容器を入れます。
- コントロールソフトウェアで [スクリプトを実行 ]をクリックします。プロンプトが表示されたら、コントロールソフトウェアで [OK]を クリックして実行を開始します。
注意: 実行シーケンスが完了するまで TED をクリアします。可動部分は怪我を引き起こす可能性があります! - 「実行シーケンス」が完了したら、コントロールソフトウェアで OK をクリックして空気圧プランジャーの圧力を解放します。
- 開いた湿度室は、他方でピンセットを固定しながら、片手で突っ込んだ腕とピンセットの間の接続を緩めます。ピンセットがフリーになったら、液体エタンにグリッドを保ちながら、突っ込んだ腕を上に動かします。次に、グリッドを周囲の液体N2の貯蔵空間に移す。凍結後、グリッドは常に液体N2 温度に保つ必要があります。
- オシロスコープの測定を保存します。後でポテンショメータスライダーとプランジャーの位置を手動でリセットします。
- 手順 2.4 ~ 2.12 を繰り返して、複製グリッドを準備します。
- グリッドクリッピングとデータ収集が行われるまで、グリッドを長期ストレージに転送します。
- ステップ1.9.1 - 1.9.5に従って、システムをバッファで洗浄します。その後、ステップ1.9.1 - 1.9.5に従って、H2Oでシステムを洗浄します。
- メインの窒素ガスレギュレータをオフにし、電源を切ります。
- エタン/窒素容器をヒュームフードに入れ、温め、エタンとN2 を蒸発させます。
3. 時間分解クライオEM
注: TED で時間分解実験を行う場合、基本的な設定と変数は変わりませんが、考慮すべき追加の側面があります。ここでは、2つの溶液を1:1(v/v)比で混合して、最終的な混合物をグリッド上に堆積させると仮定します。'1 で説明されているプロトコルに従ってください。TED'を使用した高速グリッド準備、次の変更を行います。
- 単純なスプレー実験よりも、混合実験に高いストック濃度を使用してください。1:1(v/v)比で混合すると、各成分の2倍の希釈が生じる。
- 迅速な混合実験では、1つのシリンジだけでなく、3つの注射器をすべて使用します。
- チューブをシリンジポンプ2-3に取り付けます。
- 注射器ポンプ2~3のチューブをスプレーノズルに取り付けます。
- バッファーとサンプルの 3 つのシリンジすべてを別々に平衡化します。典型的には、シリンジ1はサンプルAで満たされ、注射器2〜3はサンプルB(図3)で満たされる。
- 実行シーケンスを変更します。迅速な混合実験のために3つの注射器すべてを使用した実行シーケンスの例を 図6に示します。詳細については、「実行シーケンス」も参照してください。
- 異なる時間遅延は、2 つの方法で達成できます。
- プランジャ速度を変更します。プランジャ速度を調整することで、比較的狭い範囲で時間遅延を変更することができます。たとえば、スプレー/エタン距離が2cmのプランジャーは、1 m/sまたは2 m/sで移動して、それぞれ20 msまたは10 msの時間遅延を与えることができます。これは、ステップ 1.15 で説明したとおりに行われます。
- スプレーノズルの(垂直)位置を調整して、スプレー/エタンの位置を変更します。たとえば、ノズルがエタン表面から 5 cm の距離に配置されている場合、1 m/s のプランジ速度は 50 ミリ秒の遅延時間になります。大幅に長い時間遅延を達成するには、セットアップをさらに変更する必要があります。
注: ノズルの流れ焦点領域の層流れのため、ノズルのこの部分での有意な混合は期待できません。代わりに、混合はスプレー発生中、グリッドに向かう途中の液滴、およびグリッドに広がる液滴の間に起こることを期待する。噴霧液滴がグリッドに到達するまでの飛行時間は、1 ms≤推定されます(≥10 m/sの液滴速度と1cmのノズルグリッド距離)。したがって、液滴着陸とガラス化の間の時間だけが「時間遅延」と考えられる。
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Representative Results
TED を使用した高速グリッド準備
高速グリッド調製用の試験試料として、30mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.5で20μMの馬脾臓からアポフェリチンを使用しました。ref.15 (図7A)に記載されている690顕微鏡写真から3.5 Å解像度での再構成を得た。焦点が焦点を下す範囲は、未加工の画像で粒子を容易に識別できるように選択した(図7B)。10~40ミリ秒の時間遅延で作製された典型的なグリッドは、>1000顕微鏡写真の収集を可能にする薄い氷の十分な領域(図7C)を示しています。結果として得られる解像度は、氷の厚さによって制限される可能性が高く、多くの異なる格子の断層分析は、96±33nmの氷の厚さ6を示した。
時間分解クライオエム
TEDを用いた迅速な混合と時間分解能を実証するために、モデル反応19としてATPと混合してアキュミオシン複合体の解離を用いた。この選択は、生の顕微鏡写真からのアクトミオシンと遊離F-アクチンと反応のよく理解された運動学との間の容易な区別に基づいていた。
以下では、ATPによるアトミオシン複合体の解離のTrEMの代表的な結果が示される。詳細な実験手順と結果は ref.19に記載されています。簡単に言うと、F-アクチンおよびウサギ骨格筋膜S1を10mM MOPS、50 mM KAc、2 mM MgCl2、0.1 mM EGTA、pH7で40μMの最終モノマー濃度で混合し、アクトミオシン(AM)複合体を調製した。AM複合体は、同じバッファ内のシリンジ1と200μM MgATPにロードされ、シリンジ2と3にロードされました。用意された 2 つの異なるタイムポイントの主要な実験パラメータを表 1に示します。
どちらのタイムポイントでも、結果はAM複合体とMgATPの1:1 v/v混合物であり、最終的な濃度は20 μM AM複合体と100 μM MgATPの最終濃度を与えました。凍結時間までの計算混合は 、表1に示すように7と13ミリ秒であった。ノズルとグリッド間のスプレー液滴の飛行時間の推定は1ミリ<であった。
小さなクライオEMデータセット(306および123マイクログラフ)は、各タイムポイントと標準らせん処理手順20を用いて処理された複合データについて取得した。結果として得られるコンセンサス再構築(両方のタイムポイントを組み合わせた)を図8Aに示す。結合されたデータは、その後、焦点を合わせた分類を受け、AM複合体とF-actinクラスに分割された(図8B、C)。次に、各タイムポイントに対するAM錯体またはF-アクチン粒子の割合を算出し、図8Dに示す。
AM複合解離の2次レート定数は1.5 ·106 M-1 s-1 21.という仮定の下で
統合レート法は、以下に近似することができます。
[AM-複素数]はAM複合体の時間依存濃度であり、[AM-複素数]0は初期濃度、kは第2次率定数、[ATP]0は(初期)ATP濃度である。
この方程式を用いて、AM錯体解離の運動学をモデル化した。このモデルは、実験的な TrEM データと合理的に一致します。 図 8Dに示すように、マイクログラフごとの大きな変動があります。
図1: 時間解決EMデバイス(TED)(A)TEDの概要(B)ポンプ1-3を備えた液体処理ユニット。左側の4つ目のポンプは、この作業では使用されません。負荷と分配位置は、サンプルリザーバ('サンプル1')と同様に、バルブ1に対して示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:空気圧プランジャーと線形ポテンショメータ(A)重要な部品をラベル付けしたTEDの空気圧プランジャーの詳細。(B) TEDの空気圧システムの概略図。数字は、N2気筒(1)、主圧力レギュレータ(2)、スプレーノズル(3)、ソレノイドバルブ(4)、プランジスピードレギュレータ(5)および二重棒空気圧筒(6)に対応しています。(C)ポテンショメータの回路の概略。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:混合と噴霧用のガス動的仮想ノズル(A)4つの入口管が接続されたノズルで、サンプル(A、B)およびN2ガスに供給する。(B)PDMSスプレーノズルの中央部の概略は、フローフォーカス(下流混合用)およびガスの焦点合わせまたは霧化を達成するための形状を焦点を合わせた二重流を有する。サンプル B は黄色で、サンプル A は紫で示されています。(C)マイクロ流体ノズルの混合と霧化切片の顕微鏡画像。ref.15からの画像 。スケールバー 100 nm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アクリルガラスボックス内のグリッドとスプレーの環境制御。(A)前面からの眺め、TEDの側面からの(B)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 実行シーケンス( A) 変数を上部に、コマンドのシーケンスを下部に示す実行シーケンスの例。キーコマンドの一部は赤で示されています。(B) 黒実線で示された「実行シーケンス」の時間経過に沿ったグリッド位置。グリッドの開始位置は 0 cm です。スプレーは2sのt= 0 sで開始され、スプレーと液体エタンの間の距離は~2cmで~2cmで、グリッドは2m/sで、噴霧を通って液体エタンに移動し始める。2 s. の後にスプレーが停止すると、シーケンスは終了 します。
図6:高速混合実験の実行シーケンス例図5 Aとの重要な違いは赤で示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:代表的なスプレー実験の結果である(A)3.5スプレーとガラス化の間に36msで調製された格子から馬のアポフェリチンの再構成(EMD- 10533)。(B)同じアポフェリチンサンプルの生画像。(C)グリッドの低倍率図は、薄い氷を含む1つの例示的な格子状の正方形が破線の青い長方形によって強調され、このグリッド四角形内の薄い氷の領域は青色の矢印で示される。厚い氷や汚染の領域は、アスタリスクで示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:代表的な結果は混合実験から得られたものであり、(A)高い閾値(色付き)および低い閾値(透明)で示されるAM複合体のコンセンサス再構成。ミオシン密度の1つは、破線でラベル付けされ、強調表示されます。再構築は、両方のタイムポイントの組み合わせから生成されました。(B) ミオシンが結合していないF-アクチンクラス(C) ミオシン結合を示す AM 複合体クラス (ミオシンは灰色で、主にライトレッドアクチンサブユニットに結合)。(D) 運動モデルと実験用TrEMデータの比較図示は、初期濃度に対するAM錯体の割合である。大きな黒い点は平均されたTrEMデータを示し、小さな点は顕微鏡写真ごとのTrEMデータを示す。紫色の破線は、運動モデルを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 流量(μL/秒) | スプレー/エタン距離(cm) | プランジスピード(m/s) | 時間遅延 (ミリ秒) | |||
| シリンジ 1 | シリンジ2 | シリンジ3 | ||||
| (午前) | (ATP) | (ATP) | ||||
| 7ミリ秒 | 2.08 | 1.04 | 1.04 | 1.4 | 2 | 7 |
| 13ミリ秒 | 1.04 | 0.52 | 0.52 | 2 | 1.6 | 13 |
表1: ATPによるAM複合解離のTrEMの実験的設定
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Discussion
この研究のプロトコルは、直接噴霧およびTrEM実験により、高速グリッド調製に使用することができる。高速グリッド調製は、空気水界面5との粒子相互作用を低減するために使用することができる。主な制限は、グリッド上で利用可能なサンプル濃度と氷の厚さです。これらの限界内で、サンプルの品質が良い場合、プロトコルは高解像度のクライオEMに適したグリッドを生成します。
トラブルシューティング
液体流量およびグリッド速度は、グリッド上に堆積する液体の量を決定します。上記の例の設定(液流量5μL/s、プランジ速度1~2 m/s)では、液滴を使用したグリッドの良好なカバレッジが期待されます。ノズルがうまく整列していない場合(スプレー液滴がグリッドを逃す)、凍結されたグリッドは非常に少ないか、または全く液滴を示さない。
グリッドの汚染は完全に回避することはできません( 図7Cを参照)、湿気の多い環境への液体エタンの暴露時間を最小限に抑えることで減らすことができます。これは、できるだけ早く複製グリッドを準備することで達成されます(4グリッドの場合≤20分)。液体エタンを交換する前に、通常4グリッドを用意します。
液体エタンの初期冷却が遅すぎると、グリッド上の氷が結晶化する(部分的に)可能性があります。以前の研究22と一致して、我々は低いプランジ速度(<0.5 m/s)が結晶性氷の増加につながることが判明した。非常に厚い氷(≥200 nm)の領域は、典型的には、本質的に冷却が遅いために結晶性の氷を示す。グリッドが、グリッド調製後のいずれかのステップ(液体エタンから液体窒素への移動、貯蔵 等)中にウォームアップした場合、結晶性の氷も発生する可能性があります。
TED準備グリッドのデータ取得
TEDによって生成される平均氷の厚さは標準的なブロッティングシステムで作られる「理想的な」クライオEMの格子より厚い。氷の厚さは、取得領域によっても変化する場合があります。つまり、最も薄い氷を与えるために、集録領域を慎重に選択する必要があります。焦点がずれる範囲は、ハイコントラスト画像を得るために調整する必要があります。氷が厚く、粒子のコントラストが低い場合、非常に高い焦点脱焦点値(3~5μm)を使用して初期のパイロットデータ取得を提案します。最近の研究では、このような高い脱焦点値23を使用して、高解像度を達成することができることが示唆されている。
従来の cryo-EM データ収集では、データセット全体が単一のグリッドから収集されることがよくあります。しかし、複数の小さなデータセットのコレクションとこれらのデータセットのマージが役立つことがわかりました。このようにして、対象となる限られた顕微鏡時間およびタイムポイント内で複数のタイムポイントを記録することができる。
TrEMデータの処理と分析
データセットのマージは、ほとんどの一般的なcryo-EMデータ処理ソフトウェアで日常的に行うことができます。上記の説明と他の作業で説明したように、別々のタイムポイントからのデータセットのマージは、17を使用すると便利です。パーティクルは、処理全体を通して元のサブセット(タイムポイント)に戻ってトレースできることが重要です。
従来の運動測定(例えば光散乱または蛍光を用いる)は、TrEM実験に有益な付加物であり得る。生化学的測定からの速度定数は、目的の中間状態の寿命を予測するために、またはTrEMによって観察された運動学を確認するのに使用することができる。反応動態の基本的な紹介と時間分解構造研究との関係については、ref.24を参照してください。
TrEMと従来の運動実験の間には、多くの理由が考えられます。 図8Dに示すように、TrEMデータは顕微鏡写真当たりの有意な変動を示すことができます。また、予備データは、複製グリッド間の相対粒子数の少なくとも5%の変動を示唆していることにも注意してください。粒子分類(クラス割り当て)は、特に状態が構造的に類似している場合、または構造が非常に柔軟である場合には不完全である可能性があります。粒子、つまりTrEM由来の動態は、そのような相互作用は減少するが速い速度では除去されないため、空気と水の界面との粒子相互作用の影響を受ける可能性があります。
この研究はTrEMに関するいくつかのガイドラインを提供しますが、これは研究の活発な分野であり、今後さらなる進歩が期待されます。TrEM実験には多大な実験が必要ですが、高分子複合体のダイナミクスに関する高解像度の洞察を提供することができます。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
モリー・S.Cグラヴェットの有益な議論とABSL施設スタッフにクライオEMデータ収集の支援を感謝します。デビッド・P・クレブルは、リーズ大学が出資するアストベリー・センターのウェルカム・トラスト4年間の博士号プログラムの博士課程の学生です。FEIタイタンクリオス顕微鏡は、リーズ大学(UoL ABSL賞)とウェルカムトラスト(108466/Z/15/Z)によって資金提供されました。この研究は、スティーブン・P・ミュエンチ(BB/P026397/1)へのBBSRC助成金によって資金提供され、米国心臓協会(AMR21-236078)のハワード・D・ホワイトと米国国立衛生研究所(171261)のハワード・D・ホワイトとヴィトルド・ガルキンへの研究助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10x70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
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