Summary
在这里，我们提供了一个详细的协议，用于快速网格制作和快速混合和冻结的快速网格制作设备，以进行时间解决的实验。
Abstract
低温电子显微镜（cryo-EM）领域正在迅速发展，使用新的硬件和处理算法，产生更高的分辨率结构和更具挑战性的系统信息。低温-EM的样品制备正在经历一场类似的革命，正在开发新的方法来取代传统的印迹系统。其中包括使用压电分配器、针头打印和直接喷洒。由于这些发展，网格制备的速度从秒到毫秒，提供了新的机会，特别是在时间解决的低温EM领域，蛋白质和基板可以在暴跌冻结之前快速混合，捕获短寿命的中间状态。在这里，我们详细描述了一个标准协议，用于在内部时间解决的 EM 设备上制作网格，既用于标准快速网格准备，也用于时间解决实验。该协议要求至少 50 μL 样品的浓度为 ≥ 2 毫克/兆升，用于制备 4 个网格。样品应用和冻结之间的延迟可能低至 10 ms。与印迹方法相比，一个限制是以更快的速度增加冰厚。我们希望该协议将帮助其他人设计自己的网格制造设备和那些有兴趣设计时间已解决的实验。
Introduction
背景
低温电子显微镜（cryo-EM）的最新发展使对日益复杂的高分辨率系统进行了结构研究。除了少数例外，此类研究仅限于平衡1 或相对缓慢反应2的生物大分子。体内的许多过程 发生在 更快的时间尺度上（毫秒），并且对这些时间刻度3中时间解决的低温 EM （TrEM） 的兴趣与日增。然而，传统的低温EM样品制备的印迹方法太慢毫秒TrEM。
除时间分辨率差外，印迹方法还有其他限制。蛋白质和蛋白质复合物可能遭受变性或首选方向的网格4。在样品制备过程中减少暴露在空气-水界面上的时间，已证明可以减轻首选方向和蛋白质变性5，6。因此，快速网格制备不仅能实现毫秒 TrEM，还能提高电网质量。
目前，自动网格准备有三种不同的方法。第一种方法使用固定少量样品的针脚或毛细管。在建立液体和网格表面之间的接触后，样品被"写"到网格7，8。示例应用过程相对较慢，需要几秒钟。另一种方法使用由Piezo分配器和自吸电网9控制滴的生成。这允许更快的分配冻结时间，但仍然受到水滴和芯速的限制（目前达到54ms）。到目前为止，最快的方法是直接喷洒方法，其中样品在喷雾喷嘴和小（+10 - 20 μm）和快速（>5米/s）液滴中雾化，在与低温-EM网格接触后扩散。样品喷雾可以通过不同的方式产生，如空气母细胞雾化器，表面声波或超声波加湿器10，11，12，13。根据我们的经验，直接喷洒方法的冰厚更大，但直接喷洒可使喷涂时间冻结时间< 10 ms。
该协议描述了如何逐步解决的EM设备（TED）配备了微流体喷雾喷嘴可用于准备网格在快速时间尺度14，15。该设备用于制备网格，在样品应用和冷冻之间最短延迟时间为 6 ms，并快速混合和冻结两个样品。TED的设计是基于以前的版本16，类似于其他喷雾基于时间解决的低温EM设备17。
首先，描述了TED设置的四个主要部分。TED 的核心是液体处理单元，负责样品吸气和配药。气动柱塞通过喷雾将网格移动到液态乙烷中。喷雾的生成是通过微流体喷雾喷嘴实现的，冻结是在液体乙烷容器中完成的，该容器被简要描述。最后，突出了控制网格环境的其他功能，特别是湿度。随后是设备操作和进行 TrEM 实验的详细协议。为快速网格准备和简单的 TrEM 实验提供了具有代表性的结果。
实验设置
液体处理单元
TED 的液体处理系统由三个注射器驱动泵（"泵 1 - 3"）组成，每个泵都配有旋转阀（图 1）。电源提供泵 1 - 3 与 24 V 直流。与控制软件（以视觉基础和C++编写）的通信是通过 RS232 接口泵 1。命令通过序列 I/O 扩展端口从泵 1 分发到泵 2-3。泵 1-3 配备玻璃注射器（注射器 1-3'，我们在这里使用 250 μL/零死容量注射器）。每个阀门有两个位置，"负载"和"分配"。"负载"位置用于将样品吸进注射器。1/16"O.D.，0.01°I.D. FEP 管的短片（+ 3 - 4 厘米）通过 ETFE/ETFE 无法兰配件连接到阀门 1-3 的"负载"位置。这小块管子伸进样品储层（通常是 1.5 mL 或 0.5 mL 塑料管）。"分配"位置通向喷嘴。"分配"插座和喷雾喷嘴之间的连接由 PE 管（+ 20-30 厘米长，0.043" O.D.，0.015" I.D.）制成，带有一小块袖管（+0.5 厘米）和 ETFE/ETFE 无法兰配件。
气动柱塞
TED 使用气动柱塞加速网格，并通过样品喷雾将其移动到液态乙烷容器中。负压钳子保持网格，拧成一个自制的支架，安装在双杆气动缸（图2A）。
压力来自一个大氮气瓶（W大小），配备多级调节器（0 - 10杆，"主压力"）。柔性增强 PVC 管（12 mm O.D.）将调节器连接到 12 端口歧管，其中加压氮输送到喷嘴和气动柱塞。通过喷嘴的气体流是恒定的，直接在氮气瓶（主压力）调节。与喷嘴的连接由PU管（4 毫米 O.D.，2.5 毫米 I.D.）、一小块 PE 管（+ 8 厘米长，0.043 英寸 O.D.，0.015 英寸 I.D.）和适当的连接器制成。气动柱塞的压力通过电磁阀控制。PU 管（4 mm O.D.，2.5 mm I.D.）将电磁阀与调节器和气动柱塞连接起来，从而降低下陷压力（≤主压力）。电磁阀由计算机控制。 图 2B中给出了设置的示意图概述。
请注意，使用此设置，暴跌压力始终等于或小于喷雾气体压力（主压力）。但是，通过在喷嘴上游加入第二个调节器，可以轻松更改设置，从而在低喷气压力下允许更高的俯冲速度。高压（>>2杆）会损坏PDMS喷嘴。
警告：这是一个加压系统，"主要压力"应始终< 7 条。
0.5 和 2 条之间的压力通常用于气动柱塞，并显示压力和速度之间的大致线性关系（在喷雾的垂直位置）。俯冲速度使用示波器测量，与滑动电能计 （10 k？） 连接，并同时与 2 k Ω 电阻器 （图 2C） 连接。电源为电压计提供 9 V 直流。虽然通过设置暴跌压力在实验前设定了近似的暴跌速度，但强力计在实验后给出了速度的精确读数。
喷雾喷嘴和液体乙烷容器
气体动态虚拟喷嘴的制造和操作，用于喷雾样品的输送，已详细描述其他地方15。如上所述，阀门 1-3 的"分配"插座与喷嘴的液体入口相连（图 3A）。加压喷雾气体与喷嘴的气体入口相连。PDMS 喷嘴中的入口非常多，无需配件即可直接使用 0.043" O.D. PE 管。我们的喷嘴设计包含一个"喷射"几何形状，用于混合两个样品，类似于参考18中描述的设备。设计示意图显示在 图3B中，喷嘴的微观图像显示在 图3C中。微流体设备的布局需要使用三个注射器混合两个样品。喷嘴通常位于离网格 1-1.5 厘米的距离（在样品应用期间）。
我们使用液乙烷作为低温源，在用于标准印迹方法的液态乙烷/氮容器中。液态乙烷杯的垂直定位通过实验室提升平台实现。
控制喷雾和网格环境
柱塞和喷雾喷嘴包含在一个定制的PMMA（丙烯酸玻璃）盒与双门（图4A）。箱内的高相对湿度通过 TED 背面的空气加湿系统（图 4B）实现。空气由泵提供，并送入前 10 个罐（通常用于水槽净水下）。罐中装满了低（+5-10厘米）的水，还装有加湿器单元。加湿器的电源由位于丙烯酸玻璃盒内的数字湿度/温度控制器和湿度/温度传感器控制。当相对湿度达到 90% ≥ 时，控制器将关闭泵。第一罐的加湿空气通过扩散器泵送，浸入水中，浸入第二个 10" 罐中，然后进入丙烯酸玻璃盒。
注意事项：由于样品在喷雾喷嘴中具有气溶胶化，因此危险生物或化学标本不适合作为样品。
运行序列
控制软件中的 "运行脚本 "按钮启动"运行"序列。此命令序列可以在脚本文件中预先定义并通过软件更改。此处解释了最重要的变量：
喷雾速度：喷雾速度决定注射器泵使用的液体流速。流速可按以下方式计算：此处使用的注射器泵电机具有固定的步数大小。泵的全系列分为 48，000 步。第二个重要因素是注射器体积。我们通常使用 250 μL 注射器。控制软件中的喷射速度设置为步数/秒。喷雾速度为 1000 步/秒对应于：
喷量：喷量决定要喷洒的总体积。因此，它也决定喷雾的持续时间。控制软件中的喷射音量设置为多个步骤。喷雾量为 2000 步，喷速为 1000 步/秒，喷喷持续时间为 2 秒，总喷量为 10.4 μL。
喷洒前时间：此变量定义了开始喷洒和暴跌之间的时间。重要的是要选择延迟时间，使喷雾有足够的时间稳定之前暴跌的网格。通常，喷雾剂在网格下降之前被给予 1.5 - 4s 以稳定。喷雾一直保持到网格通过。通常，液体流动（因此喷雾）在网格中断后停止 0.5 到 1 s。例如，使用 1000 步/s 的喷雾速度和 2000 步的喷雾量，典型的预喷时间为 1.5 s。
图 5A中显示了一个模范的命令序列，图5B中显示了随着时间的推移的网格位置。
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Protocol
1. 准备系统
注：以下协议描述了如何准备单个示例的网格。通常，为每个示例或条件准备了至少 2 个复制网格。对于更快的暴跌速度（小于 +20 ms 时间延迟），3 或 4 个复制网格通常准备考虑减少的薄冰区数量。
- 将蛋白质样本稀释至所需缓冲区的目标浓度。通常，最终浓度≥ 2 毫克/mL 与 TED 配合使用，可很好地进行网格准备。请注意，样品可以保存在冰上直到第 10 步，从第 10 步开始，样品将花费相当长的时间在室温下，因为准备 3-4 网格大约需要 20 分钟。
- 打开 TED。然后打开控制 PC 并启动控制软件。
- 通过按每个注射器泵上的 初始化 按钮（下黑色按钮），初始化所有注射器泵。
- 打开强力计电源，将其设置为 9 V 并启动示波器控制软件。
- 确保关闭 N2缸的调节阀。打开气缸阀。然后，慢慢打开调节阀，将出口压力设置为喷雾气体压力（通常为 1-2 杆）的预期值。对于此处使用的 PDMS 喷嘴，请不要使用高于 +2.5 条的压力以避免对喷嘴的损坏。持续流动的气体可防止液体在喷嘴尖端滴落和积聚，从而导致无法生产喷洒。
- 确保所有注射器泵阀处于"负载"位置。这可以通过将所有阀门切换到控制软件中的"分配"位置，然后返回到"负载"即可完成。让所有阀门都切换到"负载"。将所有注射器设置为零。
- 在此阶段，删除系统中存在的任何气泡。为此，注射器可能需要拧开，手动去除气泡，并且不再包含气泡时再次安装注射器。
- 液体处理组件通常存储在 H2O 中。在加载样品溶液之前，通过用过量的缓冲器清洗管子，使液体系统与缓冲器平滑。使用适当的最大液体流动速率，以避免喷雾喷嘴上的压力过大。液体流速> 10 μL/s 可能会对此处描述的 PDMS 喷嘴造成损坏。
- 将含有 200 μL 缓冲器 ≥的 1.5 mL 管放在注射器 1 上（顶部必须穿孔才能连接到管子上）。
- 确保阀门 1 处于"负载"位置。如有必要，切换控制软件。
- 通过控制软件，用注射器 1 吸气所需的缓冲量（通常为 50-100 μL）。
- 通过控制软件将阀门 1 切换到"分配"位置。
- 通过控制软件将注射器 1 中的所有液体分配。
- 将阀门返回到"负载"，将程序中的注射器位置重置为"0"，然后按下注射器 1 的初始化，为下一个周期的系统做好准备。
注：步骤 1.9.1 - 1.9.5 通常重复三次，以确保彻底清洗管子。
- 通过松开下垂的臂夹、将钳子放在夹子中并拧紧夹子，将带有 EM 网格的钳子（无需任何特定类型）加载钳子。
- 手动移动下垂的臂，使网格和喷嘴处于相同的高度（"示例应用"位置）。如果喷嘴和网格对齐，液体在喷洒后会积聚在网格上很长一段时间。如有必要，调整喷嘴位置。
- 通过手动将带安装钳子的下垂臂移动到其末端位置（伸入乙烷杯），调整液态乙烷杯的位置。正确设置后，钳子保持的网格将到达液态乙烷杯的中心。
- 检查"运行脚本"是否将使用所需的流速、卷和时间。有关详细信息，请参阅上面的"运行序列"部分。
- 确保没有阻碍柱塞路径。吸气单次运行到注射器 1 所需的缓冲体积。这是在控制软件中完成的，请参阅"运行序列"部分，了解典型设置和体积。然后确保阀门 1 切换到"分配"位置。通过在控制软件中按 下运行脚本 执行测试运行。
注意：在运行序列完成之前，请远离 TED。移动部件可能会造成伤害！ - 当"运行序列"完成后，将下垂臂上的压力设置为所需的值（通常为 1-2 条）。只有这样，在控制软件中按 OK 以释放从下垂的手臂上释放压力。如果需要调整"运行顺序"或对下垂臂的压力，则此设置可能会在此阶段更改，并重复步骤 1.13 - 1.15。
2. 快速网格准备
- 首先用液氮填充液态乙烷/氮容器。当足够冷且没有液氮时，将杯子中填充液态乙烷。避免凝固液体乙烷。此步骤与常规网格准备相同。
注意：为了最大限度地减少乙烷污染，请确保尽快执行步骤 2.2 - 2.13
警告：液态乙烷是一种低温和易燃物。处理时应小心谨慎。 - 准备低温-EM网格以进行发光放电。我们通常使用孔碳网格和发光放电 90s，在 0.1 mbar 气压和 10 mA。通常，一次发光的网格不超过 4 个。网格在发光放电后 30 分钟内使用。
- 用样品等价管（以下步骤 1.9.1 - 1.9.5，使用样品而不是缓冲）。如果可用的样本量较低，管子可能仅等于 1 个死体积。
- 在控制软件中，将单次运行到注射器 1 所需的样本量（有关详细信息，请参阅"运行序列"部分）。然后将阀门 1 切换到"分配"位置。
- 检查相对湿度是否达到预期值（我们通常以 60% 的相对湿度或更高）准备网格）。一旦达到≥ 60% 的湿度，仅打开湿度室的时间最少，以保持高湿度。
- 将钳子放在气动柱塞中，并固定它们。将柱塞移到起始位置（顶部）。
- 通过手动移动以接触柱塞，确保强力计的滑块处于起始位置，为测量做好准备。在示波器软件中的示波器上设置触发器。
- 放置液态乙烷/氮容器。
- 在控制软件中按 运行脚本 。提示时，单击控制软件中的 "确定 "以启动运行。
注意：在运行序列完成之前，请远离 TED。移动部件可能会造成伤害！ - 完成"运行序列"后，通过单击控制软件中的 OK 来释放气动柱塞的压力。
- 打开湿度室，用一只手松开手臂和钳子之间的连接，同时用另一只手固定钳子。当钳子是免费的，移动暴跌的手臂，同时保持网格在液体乙烷。然后将网格转移到周围液体 N2的存储空间。冻结后，网格需要始终保持在液 N2 温度。
- 保存示波器测量。之后手动重置强力计滑块和柱塞的位置。
- 重复步骤 2.4-2.12 以准备复制网格
- 将网格传输到长期存储，直到网格剪报和数据收集。
- 根据步骤 1.9.1 - 1.9.5 用缓冲器清洗系统。然后按照步骤1.9.1- 1.9.5 用 H 2 O 清洗系统。
- 关闭主氮气调节器并关闭电源。
- 将乙烷/氮容器放入烟气罩中，让它加热，让液态乙烷和N2 蒸发。
3. 时间解决低温EM
注：在 TED 进行时间解决实验时，需要考虑其他方面，尽管基本设置和变量保持不变。这里假定两种溶液混合在 1：1 （v/v） 比率中，以产生沉积在网格上的最终混合物。遵循 '1 中描述的协议。与 TED 的快速网格准备，并具有以下更改：
- 与简单的喷雾实验相比，混合实验使用更高的库存浓度。以 1：1 （v/v） 比率混合将导致每个组件稀释 2 倍。
- 对于快速混合实验，请使用所有三个注射器，而不仅仅是一个注射器。
- 将管子连接到注射器泵 2-3。
- 将注射器泵的管子 2-3 连接到喷嘴。
- 将所有三个注射器均均衡在缓冲器中，并分别取样。通常，注射器 1 充满样品 A，注射器 2-3 充满样品 B（图3）。
- 更改运行顺序。 图6中给出了使用所有3个注射器进行快速混合实验的运行序列示例。另请参阅"运行序列"部分，了解详细信息。
- 不同的时间延迟可以通过两种方式实现：
- 更改柱塞速度。通过调整柱塞速度，可以在相对狭窄的范围内更改时间延迟。例如，喷雾/乙烷距离为 2 厘米，柱塞可以移动为 1 米/s 或 2 米/s，时间延迟分别为 20 ms 或 10 ms。这一点如第 1.15 步所述。
- 通过调整喷嘴的（垂直）位置来更改喷雾/乙烷位置。例如，如果喷嘴位于距离乙烷表面 5 厘米的距离内，则 1 m/s 的俯冲速度会延迟 50 ms。要实现显著更长的延迟时间，需要对设置进行进一步修改。
注：由于喷嘴的流量聚焦区域的层压流，我们预计喷嘴的这一部分不会进行显著的混合。相反，我们预计混合发生在喷雾发电期间、在通往电网的液滴中以及在网格上扩散的液滴中。喷雾液滴到达网格的飞行时间估计为 1 ms ≤（液滴速度为 ≥ 10 米/s，喷嘴网格距离为 1 厘米）。因此，只有滴落和美化之间的时间才被视为"时间延迟"。
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Representative Results
与 TED 的快速网格准备
作为快速网格制备的测试标本，我们使用了马脾的阿波费里汀，在 30 mM HEPES 中为 20 μM，150 mM NaCl，pH 7.5。从参考 15 中描述的 690 个显微图（图 7A）中获得了3.5 + 分辨率的重建。选择脱焦范围，以便在原始图像中轻松识别粒子（图7B）。一个典型的网格，时间延迟为10-40ms显示足够的薄冰区域（图7C），允许收集>1000微图。由此产生的分辨率可能受冰厚的限制，对多个不同网格的断层分析显示96±33纳米冰厚6。
时间解决低温 -EM
为了证明使用TED的快速混合和时间分辨率，我们使用分离的ACTOmisin复合物与ATP混合作为模型反应19。这一选择是基于从原始显微图中很容易区分行动肌素和自由F-actin以及众所周知的反应动力学。
在下列情况中，显示了 ATP 分离行为肌素复合物的 TrEM 的代表性结果。详细的实验程序和结果在参考19中提供。简言之，F-actin 和兔子骨骼肌素 S1 混合在 10 mM MOPS， 50 mM KAc， 2 m M MgCl2，0.1 mM EGTA， pH 7 在 40 μM 的最终单体浓度准备行动肌素 （AM） 复合物.AM 复合物被装入注射器 1 和 200 μM MgATP 在同一缓冲区被加载到注射器 2 和 3。所准备的两个不同时间点的关键实验参数列在 表1中。
对于两个时间点，结果是 AM 复合物和 MgATP 的 1：1 v/v 混合物，最终浓度为 20 μM AM 复合物和 100 μM MgATP。计算混合到冻结时间是7和13ms，如 表1所示。喷嘴和网格之间的喷液滴的飞行时间估计为 1 ms <。
每个时间点都获得了一个小的低温-EM数据集（306和123显微图），使用标准螺旋处理程序20处理的合并数据。由此产生的共识重建（两个时间点加起来）显示在图8A中。然后，合并后的数据进行重点分类，并分为 AM 复合体和 F-actin 类（图8B，C）。然后，计算每个时间点的 AM 复合物或 F-actin 粒子的分数，并显示在图 8D中。
AM 复合分离的第二个订单速率常数为 1.5 •106 M-1 s-1 21.假设
综合费率法可大致约定：
如果 [AM 复杂] 是 AM 复合物的时间依赖浓度，[AM 复合体]0 是初始浓度，k 是第二个订单速率常数，[ATP]0 是（初始）ATP 浓度。
使用此方程，模拟了 AM 复杂分离的动因。该模型与实验性TrEM数据相当一致。 如图8D所示，每幅显微图都有显著的变化。
图1：时间已解决的EM设备（TED）（A）TED概述。（B） 带泵 1-3 的液体处理装置。此工作不使用左侧的第四个泵。阀门 1 指示负载和分配位置，示例储层（"示例 1"）也指示。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：气动柱塞和线性电压计。 （A） TED气动柱塞的详细信息，并标有重要部件。（B） TED气动系统的示意图。数字对应于N2 缸（1）、主压力调节器（2）、喷嘴（3）、电磁阀（4）、俯冲速度调节器（5）和双杆气动缸（6）。（C） 电路的示意图为强力计。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：气体动态虚拟喷嘴，用于混合和喷洒。 （A） 连接 4 个入口管的喷嘴，供应样品（A 和 B）和 N2 气体。（B） PDMS 喷射喷嘴中央部分的示意图，具有双流量聚焦几何形状，以实现流量聚焦（用于下游混合）和气体聚焦或雾化。样品 B 以黄色显示，样本 A 以紫色显示。（C） 微流体喷嘴混合和雾化部分的微观图像。图片从参考15。缩放杆 100 nm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：丙烯酸玻璃盒内网格和喷雾的环境控制。 （A） 从TED的正面和侧面（B）查看。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：运行序列。（A）显示顶部变量的示例和底部命令的序列。一些关键命令以红色注释。（B） 网格位置在"运行序列"的时间过程中显示为黑色实线。网格的起始位置为 0 厘米。喷雾在 t = 0 s 为 2 s 启动， 喷雾和液体乙烷之间的距离为 ±2 厘米。在 1.5 s 时， 网格开始以 2 米/s 的速度移动， 通过喷雾进入液体乙烷。序列在 2s 后停止时结束，请单击此处查看此图的较大版本。
图6：快速混合实验的示例运行序列。图 5 A 的重要差异以红色注释。请单击此处查看此图的较大版本。
图7：代表结果来自一个简单的喷雾实验。（A） 3.5 + 从喷洒和病毒化之间36ms的网格中重建马阿波里汀（EMD-10533）。（B） 同一聚二甲蛋白样品的原始图像。（C） 网格的低放大视图，一个包含薄冰的模范网格方块由破折号的蓝色矩形突出显示，此网格方形内的薄冰区域由蓝色箭头表示。厚冰或污染区域用星号表示。请单击此处查看此图的较大版本。
图8：混合实验的代表性结果。（A） 以高阈值（彩色）和低阈值（透明）显示的AM复合体的共识重建。一个肌素密度被标记和突出显示与虚线。重建是从两个时间点加起来的数据生成的。（B） F - actin 类显示没有肌素绑定。（C） AM 复合类显示肌素绑定 （肌素在灰色， 主要绑定到浅红色行为子联盟）.（D） 动能模型与实验性TrEM数据的比较。显示的是 AM 复合物相对于初始浓度的分数。大实心黑点表示平均 TrEM 数据，小点表示每微图 TrEM 数据。紫色虚线表示动能模型。请单击此处查看此图的较大版本。
| 流速 （μL/s） | 喷雾/乙烷距离（厘米） | 暴跌速度（米/s） | 延时 （ms） | |||
| 注射器 1 | 注射器 2 | 注射器 3 | ||||
| （上午） | （ATP） | （ATP） | ||||
| 7ms | 2.08 | 1.04 | 1.04 | 1.4 | 2 | 7 |
| 13 ms | 1.04 | 0.52 | 0.52 | 2 | 1.6 | 13 |
表1：ATP对AM复杂分离的TrEM的实验设置
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Discussion
这项工作中的方案可用于通过直接喷洒和TrEM实验进行快速网格准备。快速网格制备可用于减少颗粒与空气水接口的相互作用。主要限制是网格上可用的样品浓度和冰厚。在这些限制内，只要样品质量良好，协议将生成适合高分辨率低温-EM的网格。
故障 排除
液体流速和网格速度决定了沉积在网格上的液体量。以上述示例设置（液体流速 5 μL/s 和俯冲速度 1-2 m/s）为例，预计网格与液滴的覆盖范围良好。如果喷嘴对齐不好（因此喷液滴漏格），冻结网格显示的液滴很少或没有。
电网的污染不能完全避免（见 图7C），但可以通过尽量减少液态乙烷暴露在潮湿环境中的时间来减少。这是通过尽快准备复制网格（4 个网格的≤ 20 分钟）实现的。在更换液态乙烷之前，我们通常会准备 4 个网格。
如果液态乙烷的初始冷却速度过慢，电网上的葡萄冰可能会（部分）结晶。根据先前的一项研究22，我们发现低暴跌速度（<0.5米/升）导致结晶冰的增加。非常厚的冰（≥200纳米）区域通常显示结晶冰，由于冷却速度本身较慢。如果网格在网格制备后的任何步骤（从液态乙烷转移到液氮、转移到存储 等）过程中变暖，也可能发生结晶冰。
TED 准备网格的数据采集
TED 产生的平均冰厚比标准印迹系统上制备的"理想"低温-EM 网格厚。冰厚度也可能因采集区域而异。这意味着需要仔细选择收购区域，以提供尽可能薄的冰。可能需要调整脱焦范围以获得高对比度图像。当冰层厚，颗粒对比度较低时，我们建议使用非常高的脱焦值（3 - 5 μm）进行初始试点数据采集。最近的研究表明，高分辨率仍然可以实现使用如此高的脱焦值23。
对于传统的低温-EM 数据收集，通常从单个网格收集整个数据集。但是，我们发现收集多个小型数据集和合并这些数据集很有用。这样，可以在有限的显微镜时间内记录多个时间点，并可以识别感兴趣的时间点。
TrEM 数据的处理和分析
数据集的合并通常可以在最常见的低温-EM数据处理软件中完成。如上所述，在其他人的工作中，将数据集从单独的时间点合并是有用的。重要的是，粒子可以追溯到其原始子集（时间点）在整个处理。
传统的动能测量（例如使用光散射或荧光）可能是TrEM实验的宝贵补充。生化测量的速率常数可用于预测中间利益状态的寿命，或用于确认 TrEM 观察到的动能学。有关反应动力学及其与时间解决结构研究的关系的基本介绍，请参阅参考24。
TrEM 和传统动力学实验之间存在差异的原因有很多。如图 8D所示，TrEM 数据可以显示每微图的显著差异。我们还注意到，初步数据显示，复制网格之间的相对粒子数至少有 5% 的变异性。粒子分类（类分配）可能不完美，特别是如果状态在结构上相似或结构非常灵活。粒子，因此TrEM衍生的动能，也可能受到粒子与空气-水界面相互作用的影响，因为这种相互作用减少，但不会在快速下消除。
这项工作为TrEM提供了一些指导方针，但我们注意到，这是一个活跃的研究领域，我们期待在未来取得进一步的进展。虽然TrEM实验需要大量的实验努力，但它们可以提供对大分子复合物动力学的高分辨率洞察。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们要感谢莫莉S.C格雷维特的有益讨论和ABSL设施的工作人员帮助冷冻-EM数据收集。David P. Klebl 是利兹大学资助的阿斯特伯里中心韦康信托 4 年博士项目的博士生。FEI泰坦克里奥斯显微镜由利兹大学（UoL ABSL奖）和韦尔康信托（108466/Z/15/Z）资助。这项工作由BBSRC授予斯蒂芬·穆恩奇（BB/P026397/1）的赠款资助，并得到了美国心脏协会（AMR21-236078）和美国国家卫生研究院（171261）霍华德·怀特和维托尔德·加尔金的研究资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10x70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
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