Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

Summary

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för användning av en snabb nättillverkningsenhet för både snabb nättillverkning och för snabb blandning och frysning för att utföra tidsbefriade experiment.

Abstract

Området kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) utvecklas snabbt med nya hårdvaru- och bearbetningsalgoritmer, vilket ger strukturer med högre upplösning och information om mer utmanande system. Provberedningen för cryo-EM genomgår en liknande revolution med nya metoder som utvecklas för att ersatt de traditionella blotting-systemen. Dessa inkluderar användning av piezo-elektriska dispensrar, stiftutskrift och direkt sprutning. Som ett resultat av denna utveckling går nätberedningens hastighet från sekunder till millisekunder, vilket ger nya möjligheter, särskilt när det gäller tidsuppfrista cryo-EM där proteiner och substrat snabbt kan blandas före dykfrysning och fånga kortlivade mellanliggande tillstånd. Här beskriver vi i detalj ett standardprotokoll för att göra rutnät på vår interna tids lösta EM-enhet både för standard snabb nätförberedelse och även för tids lösta experiment. Protokollet kräver minst ca 50 μL prov vid koncentrationer av ≥ 2 mg/ml för beredning av 4 rutnät. Fördröjningen mellan provprogram och frysning kan vara så låg som 10 ms. En begränsning är ökad istjocklek vid snabbare hastigheter och jämfört med blottingmetoden. Vi hoppas att detta protokoll kommer att hjälpa andra att utforma sina egna nättillverkningsanordningar och de som är intresserade av att utforma tids lösta experiment.

Introduction

Bakgrund
Den senaste utvecklingen inom kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) har möjliggjort strukturella studier av alltmer komplexa system med hög upplösning. Med få undantag har sådana studier begränsats till biologiska makromolekyler vid jämvikt¹ eller relativt långsamma reaktioner². Många processer in vivo sker i en snabbare tidsskala (millisekunder) och det finns ett ökande intresse för tidsupp lös cryo-EM (TrEM) på dessa tidsskalor³. Konventionell cryo-EM provberedning med blotting-metoden är dock för långsam för millisekskond TrEM.

Blotting-metoden har andra begränsningar än dålig tidsupplösning. Proteiner och proteinkomplex kan drabbas av denaturering eller föredragen orientering på galler⁴. Att minska exponeringstiden för luft-vatten-gränssnittet under provberedningen har visat sig mildra önskad orientering och proteindenaturering^5,6. Således möjliggör snabb nätberedning inte bara millisekekunder trEM utan kan också förbättra nätkvaliteten.

För närvarande finns det tre olika metoder för automatiserad nät förberedelse. Den första metoden använder en stift eller kapillär som rymmer en liten mängd prov. När provet har etablerat kontakt mellan vätskan och gallrets yta "skrivs" det på^{rutnätet 7,8}. Exempel program processen är relativt långsam och tar några sekunder. Ett alternativt tillvägagångssätt använder kontrollerad droppgenerering av en piezo dispenser och självtransporterande galler⁹. Detta gör det möjligt för snabbare dispens att frysa tider, men begränsas fortfarande av droppe och wicking hastighet (för närvarande når 54 ms). Det snabbaste tillvägagångssättet hittills är den direkta spraymetoden, där provet finfördelas i ett sprutmunstycke och de små (~ 10 - 20 μm) och snabba (> 5 m/s) dropparna sprids vid kontakt med cryo-EM-nätet. Provsprayen kan genereras på olika sätt som luftblästringsatomer, akustiska ytvågor eller ultraljudsfuktare^10,11,12,13. Enligt vår erfarenhet är istjockleken med direkt sprutning större men direkt sprutning gör det möjligt att frysa < 10 ms.

Detta protokoll beskriver steg för steg hur en tidsupp lös EM-enhet (TED) utrustad med ett mikrofluidiskt sprutmunstycke kan användas för att förbereda galler på en snabb tidsskala^14,15. Enheten har använts för att förbereda galler med en minsta fördröjningstid på 6 ms mellan provapplicering och frysning och för att snabbt blanda och frysa två prover. Utformningen av TED är baserad på en tidigare version¹⁶ och liknar andra spraybaserade tidsbefriade cryo-EM-enheter¹⁷.

Först beskrivs de fyra huvuddelarna i TED-installationen. Kärnan i TED är vätskehanteringsenheten, som ansvarar för provambition och dispensering. En pneumatisk kolv flyttar gallret genom sprayen till den flytande etanen. Generering av sprayen uppnås med mikrofluidiska sprutmunstycken och frysning sker i en flytande etanbehållare, som beskrivs kortfattat. Slutligen markeras de ytterligare funktionerna för att styra nätmiljön, särskilt fuktighet. Detta följs av detaljerade protokoll för driften av enheten och för att utföra TrEM-experiment. Representativa resultat ges för snabb nätberedning och ett enkelt TrEM-experiment.

Experimentell installation

Vätskehanteringsenheten
TED:s vätskehanteringssystem bildas av tre sprutpumpar ("pumparna 1 - 3"), var och en utrustad med en roterande ventil (figur 1). En strömförsörjning ger pumpar 1 - 3 med 24 V DC. Kommunikationen med styrprogramvaran (skriven i Visual Basic och C++) sker via ett RS232-gränssnitt för att pumpa 1. Kommandona distribueras via de seriella I/O-expansionsportarna från pump 1 till pumparna 2-3. Pumparna 1-3 är utrustade med glassprutor ("sprutor 1-3", vi använder 250 μL/noll döda volymsprutor här). Varje ventil har två lägen, "last" och "dispense". Lastläget används för att aspirera prov i sprutan. En kort bit (~ 3 - 4 cm) av 1/16" O.D., 0.01′′ I.D. FEP-slangar ansluts via ETFE / ETFE flänslösa beslag till "belastnings" -positionen för ventiler 1-3. Denna korta rörbit når in i provbehållaren (vanligtvis ett plaströr på 1,5 ml eller 0,5 ml). Dispenseringsläget leder till sprutmunstycket. Anslutningen mellan "dispense"-uttaget och sprutmunstycket görs genom PE-slangar (~ 20-30 cm längd, 0,043" O.D., 0,015" ID), med en kort bit ärmrör (~ 0,5 cm) och ETFE / ETFE flänslösa beslag.

Den pneumatiska kolven
TED använder en pneumatisk kolv för att accelerera gallret och flytta det genom provsprayen till den flytande etanbehållaren. Pincett med undertryck håller gallret, skruvat i en hembyggd hållare som är monterad på en pneumatisk cylinder med dubbla stångar (figur 2A).

Trycket levereras från en stor kvävegascylinder (storlek W), utrustad med en multistageregulator (0- 10 bar, "huvudtryck"). Flexibla förstärkta PVC-slangar (12 mm O.D.) förbinder regulatorn med ett grenrör med 12 portar där trycksatt kväve levereras till munstycket och den pneumatiska kolven. Gasflödet genom munstycket är konstant, reglerat direkt vid kvävecylindern (huvudtrycket). Anslutningen till munstycket är gjord med PU-slangar (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), en kort bit PE-slang (~ 8 cm längd, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) och lämpliga kontakter. Trycket på den pneumatiska kolven styrs genom en magnetventil. PU-slangar (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) förbinder magnetventilen med en regulator och den pneumatiska kolven för att möjliggöra ett reducerat avsvalkningstryck (≤ huvudtryck). Magnetventilen är datorstyrd. En schematisk översikt över installationen ges i figur 2B.

Observera att med denna inställning är avsvalkningstrycket alltid lika med eller mindre än sprutgastrycket (huvudtrycket). Installationen kan dock enkelt ändras genom att en andra regulator införlivas uppströms sprutmunstycket för att möjliggöra högre avsvalkningshastigheter vid lågt sprutgastryck. Högt tryck (>> 2 bar) kan skada PDMS spraymunstycke.

VARNING: Detta är ett trycksystem och "huvudtrycket" ska alltid vara < 7 bar.

Tryck mellan 0,5 och 2 bar används vanligtvis för den pneumatiska kolven och visar ett ungefär linjärt förhållande mellan tryck och hastighet (i sprayens vertikala läge). Avsvalkningshastigheter mäts med ett oscilloskop, anslutet i linje med en glidpotentiometer (10 kΩ) och parallellt med ett 2 kΩ-motstånd (Figur 2C). En strömförsörjning ger potentiometern 9 V LIKSTRÖM. Medan den ungefärliga avsvalkningshastigheten ställs in före experimentet genom att ställa in avsvalkningstrycket, ger potentiometern en exakt avläsning av hastigheten efter experimentet.

Sprutmunstycken och flytande etanbehållare
Tillverkning och drift av gasdynamiska virtuella munstycken för spraybaserad provleverans har beskrivits någon annanstans i detalj¹⁵. Som beskrivits ovan är ventilernas "dispense"-utlopp 1-3 anslutna till munstyckets vätskeinlopp(figur 3A). Den trycksatta spraygasen ansluts till munstyckets gasinlopp. Inloppen i PDMS-sprutmunstyckena är sådana att 0,043" O.D. PE-slangar kan användas direkt utan behov av beslag. Vår munstycksdesign innehåller en "jet-in-jet"-geometri för blandning av två prover, liknande den anordning som beskrivs i ref.¹⁸. Ett ritningsschema för konstruktionen visas i figur 3B, en mikroskopisk bild av ett munstycke visas i figur 3C. Utformningen av den mikrofluidiska enheten kräver användning av tre sprutor för att blanda två prover. Sprutmunstycket är vanligtvis placerat på 1-1,5 cm avstånd från gallret (under provapplicering).

Vi använder flytande etan som kryogen, i en flytande etan/ kvävebehållare som används för standard blotting-metoden. Vertikal positionering av vätskeetankoppen uppnås med en laboratorielyftplattform.

Kontroll av sprut- och nätmiljön
Kolven och sprutmunstycket finns i en specialbyggd PMMA-låda (akrylglas) med dubbeldörr (Figur 4A). Hög relativ luftfuktighet inuti lådan uppnås genom ett luftfuktningssystem på baksidan av TED(figur 4B). Luft levereras av en pump och matas in i en första 10" behållare (vanligtvis används för vattenrening under diskbänk). Behållaren är fylld med en låg (~ 5-10 cm) vattennivå och rymmer även en luftfuktare. Nätström till luftfuktaren styrs av en digital fukt-/temperaturregulator och en fukt-/temperatursensor som finns inuti akrylglaslådan. Styrenheten är inställd på att stänga av pumpen när den relativa luftfuktigheten når ≥ 90 %. Fuktad luft från den första behållaren pumpas genom en diffusor, nedsänkt i vatten i en andra 10"-behållare och går sedan in i akrylglaslådan.

VARNING: Eftersom provet aerosoliseras i sprutmunstycket är farligt biologiskt eller kemiskt prov inte lämpligt som prover.

Körsekvensen
Knappen Kör skript i kontrollprogramvaran initierar körningssekvensen. Den här kommandosekvensen kan fördefinieras i en skriptfil och ändras via programvaran. De viktigaste variablerna förklaras här:

Sprayhastighet: Sprayhastigheten bestämmer det vätskeflöde som används av sprutpumpen. Flödeshastigheten kan beräknas enligt följande: De sprutpumpsmotorer som används här har en fast stegstorlek. Pumpens hela räckvidd är uppdelad i 48 000 steg. Den andra viktiga faktorn är sprutvolymen. Vi använder vanligtvis 250 μL sprutor. Spruthastigheten i styrprogramvaran är inställd som antal steg/sekund. En spruthastighet på 1000 steg/sekund motsvarar:

Sprayvolym: Sprayvolymen bestämmer den totala volymen som ska sprutas. Således bestämmer det också sprayens varaktighet. Sprayvolymen i styrprogramvaran är inställd som ett antal steg. En sprayvolym på 2000 steg, med en sprayhastighet på 1000 steg/sekund, leder till en spraylängd på 2 s och en total volym på 10,4 μL.

Pre-spray tid: Denna variabel definierar tiden mellan initiering av sprayen och dopp. Det är viktigt att välja fördröjningstiden så att sprayen har tillräckligt med tid att stabilisera innan du fäller gallret. Vanligtvis ges sprayen 1,5 - 4 s för att stabiliseras innan gallret kastas. Sprayen bibehålls tills gallret har gått igenom. Vanligtvis stoppas vätskeflödet (och därmed sprayen) 0,5 till 1 s efter att gallret har kastats. Med en sprayhastighet på 1000 steg/s och en sprayvolym på 2000 steg är en typisk pre-spraytid till exempel 1,5 s.

En exemplarisk sekvens av kommandon visas i figur 5A, rutnätets position över tiden illustreras i figur 5B.

Protocol

1. Förbereda systemet

I följande protokoll beskrivs hur du förbereder rutnät för ett enda prov. Vanligtvis förbereds minst 2 replikatrutnät för varje prov eller tillstånd. För snabbare avsvalkningshastigheter (mindre än ~ 20 ms tidsfördröjning) är 3 eller 4 replikatnät vanligtvis beredda att ta hänsyn till ett minskat antal tunna isområden.

1. Späd proteinprovet till målkoncentrationen i önskad buffert. Vanligtvis fungerar slutliga koncentrationer ≥ 2 mg/ml bra för nätberedning med TED. Observera att provet kan hållas på is till steg 10, från steg 10 och framåt kommer provet att spendera avsevärd tid vid rumstemperatur eftersom det tar cirka 20 minuter att förbereda 3-4 rutnät.
2. Sätt på TED. Slå sedan på kontrolldatorn och starta kontrollprogramvaran.
3. Initiera alla sprutpumpar genom att trycka på knappen Initialisera (nedre svarta knappen) på varje sprutpump.
4. Slå på potentiometerns strömförsörjning, ställ in den på 9 V och starta oscilloskopets kontrollprogramvara.
5. Se till att regulatorventilen på N_2-cylindernär stängd. Öppna cylinderventilen. Öppna sedan långsamt regulatorventilen som ställer in utloppstrycket till önskat värde för sprutgastrycket (vanligtvis 1-2 bar). För pdms-munstyckena som används här ska du inte använda tryck som är högre än ~ 2,5 bar för att undvika skador på munstycket. Den kontinuerligt flödande gasen förhindrar att vätska droppar och ackumuleras vid munstyckesspetsen vilket kan leda till irreducibel sprutning.
6. Se till att alla sprutpumpventiler är i "belastningsläge". Detta kan göras genom att byta alla ventiler till "dispense" -positionen i styrprogramvaran och sedan tillbaka till "belastning". Låt alla ventiler bytas till "last". Ställ in alla sprutor på noll.
7. Ta bort eventuella luftbubblor som finns i systemet i detta skede. För att göra detta kan sprutorna behöva skruvas loss, bubblor avlägsnas manuellt och sprutorna monteras igen när de inte innehåller några fler bubblor.
8. Vätskehanteringskomponenterna förvaras vanligtvis i H₂O. Innan provlösningen lastas jämviktar du vätskesystemet med buffert genom att tvätta slangen med ett överskott av buffert. Använd ett lämpligt maximalt vätskeflöde för att undvika övertryck på sprutmunstycket. Vätskeflöden > 10 μL/s kan orsaka skador på de PDMS-munstycken som beskrivs här.
9. Placera ett 1,5 ml-rör som innehåller ≥ 200 μL-buffert på sprutan 1 (toppen måste genomborras för att fästas på slangen).
   1. Se till att ventil 1 är i "belastningsläge". Byt vid behov in styrprogramvaran.
   2. Aspirera önskad mängd (vanligtvis 50-100 μL) buffert med spruta 1, genom kontrollprogramvaran.
   3. Byt ventil 1 till "dispense"-läget genom styrprogramvaran.
   4. Dispensera all vätska i spruta 1 genom kontrollprogramvaran.
   5. Sätt tillbaka ventilen på "last", återställ sprutans läge till "0" i programmet och tryck på initialisera på spruta 1 för att förbereda systemet för nästa cykel.
      OBS: Steg 1.9.1 - 1.9.5 upprepas vanligtvis tre gånger för att säkerställa noggrann tvättning av slangen.
10. Last pincett med ett EM-galler (inget krav på någon specifik typ) genom att lossa den fallande armklämman, placera pincetten i klämman och dra åt klämman.
11. Flytta den fallande armen manuellt så att gallret och munstycket är i samma höjd (läget "provapplicering"). Om munstycket och gallret är i linje kommer vätska att ackumuleras på gallret efter sprutning under en längre period. Justera vid behov munstycksläget.
12. Justera den flytande etankoppens läge genom att manuellt flytta den fallande armen med monterade pincett till sitt ändläge (som sträcker sig in i etankoppen). När det är korrekt installerat kommer ett galler som hålls av pincetterna att nå ungefär mitten av den flytande etankoppen.
13. Kontrollera att "kör skriptet" använder önskade flödeshastigheter, volymer och tidsinställningar. Se avsnittet "Körsekvensen" ovan för mer information.
14. Se till att inget hindrar kolvens väg. Aspirera på den buffertvolym som krävs för en enda körning i sprutan 1. Detta görs i kontrollprogramvaran, se avsnittet "Körsekvensen" för typisk inställning och volymer. Se sedan till att ventil 1 är omkopplad till dispenseringsläget. Utför en testkörning genom att trycka på Kör skript i kontrollprogramvaran.
    VARNING: Håll dig borta från TED tills körningssekvensen är klar. Rörliga delar kan orsaka personskador!
15. När "körsekvensen" är klar ställer du trycket på den fallande armen till önskat värde (vanligtvis 1-2 bar). Tryck först på OK i kontrollprogramvaran för att frigöra tryck från den fallande armen. Om "körsekvensen" eller trycket på den fallande armen behöver justeras kan dessa inställningar ändras i detta skede och steg 1.13 - 1.15 upprepas.

2. Snabb gallerförberedelse

1. Fyll först vätskeetan/kvävebehållaren med flytande kväve. Fyll koppen med flytande etan när den är tillräckligt kall och fri från flytande kväve. Undvik stelning av den flytande etanen. Detta steg är detsamma som för konventionell nätberedning.
   OBS: För att minimera etanföroreningen, se till att steg 2.2 - 2.13 utförs så snabbt som möjligt
   VARNING: Flytande etan är en kryogen och brandfarlig. Försiktighet bör vidtas vid hantering.
2. Förbered cryo-EM-galler för självurladdning. Vi använder vanligtvis håliga kolnät och glödurladdning för 90 s, vid 0,1 mbar lufttryck och 10 mA. Vanligtvis är inte mer än 4 rutnät glöduttömda åt gången. Gallret används inom 30 minuter från urladdning.
3. Balansera slangen med prov (enligt steg 1.9.1 - 1.9.5, med prov i stället för buffert). Om den tillgängliga provvolymen är låg kan slangen balanseras med endast 1 död volym.
4. Aspirera på den mängd prov som behövs för en enda körning i spruta 1 i kontrollprogramvaran (se avsnittet "Körsekvensen" för mer information). Byt sedan ventil 1 till dispenseringsläget.
5. Kontrollera att den relativa luftfuktigheten har nått önskat värde (vi förbereder vanligtvis galler vid 60 % relativ luftfuktighet eller högre). När ≥ 60 % luftfuktighet uppnås, öppna fuktighetskammaren endast under en minimal tid för att bibehålla hög luftfuktighet.
6. Placera pincetterna, håll ett glödurmatat galler, i den pneumatiska kolven och fixa dem. Flytta kolven till startpositionen (högst upp).
7. Se till att potentiometerns skjutreglage är i startläge, klart för mätningen, genom att flytta det manuellt för att kontakta kolven. Ställ in avtryckaren på oscilloskopet i oscilloskopprogramvaran.
8. Placera vätskeetern/kvävebehållaren.
9. Tryck på Kör skript i kontrollprogramvaran. När du uppmanas till det klickar du på OK i kontrollprogramvaran för att starta körningen.
   VARNING: Håll dig borta från TED tills körningssekvensen är klar. Rörliga delar kan orsaka personskador!
10. När "körsekvensen" är klar släpper du trycket på den pneumatiska kolven genom att klicka på OK i kontrollprogramvaran.
11. Öppna fuktighetskammaren, lossa anslutningen mellan fallande arm och pincett med ena handen samtidigt som pincetten säkras med den andra. När pincetterna är fria, flytta upp den fallande armen samtidigt som du håller gallret i den flytande etanen. Överför sedan gallret till dess lagringsutrymme i den omgivande vätskan N₂. Efter frysning måste gallret alltid hållas vid flytande N_{2-temperatur.}
12. Spara oscilloskopmätningen. Återställ försiktigtometerreglagets och kolvens läge manuellt efteråt.
13. Upprepa steg 2.4-2.12 för att förbereda replikerade rutnät
14. Överför rutnäten till långsiktig lagring tills rutnätsurklipp och datainsamling.
15. Tvätta systemet med buffert enligt steg 1.9.1 - 1.9.5. Tvätta sedan systemet med H₂O, enligt steg 1.9.1 - 1.9.5.
16. Stäng av huvudgasregulatorn och stäng av strömmen.
17. Placera etan/kvävebehållaren i en rökhuv så att den värms upp och låt den flytande etanen och N_{2 avdunsta.}

3. Tidsbefriad cryo-EM

OBS: När tidsupp lösta experiment utförs med TED finns det ytterligare aspekter att överväga, även om de grundläggande konfigurationerna och variablerna förblir desamma. Det antas här att två lösningar blandas i ett 1:1 (v/v) förhållande för att producera den slutliga blandningen som deponeras på nätet. Följ protokollet som beskrivs i '1. Snabb rutnätsförberedelse med TED' med följande ändringar:

1. Använd högre lagerkoncentrationer för blandning av experiment än för enkla sprayexperiment. Blandning i ett 1:1 (v/v) förhållande resulterar i en 2x utspädning av varje komponent.
2. För ett snabbt blandningsexperiment, använd alla tre sprutorna snarare än bara en enda.
   1. Fäst slangen på sprutpumparna 2-3.
   2. Fäst slangar från sprutpumpar 2-3 på sprutmunstycket.
   3. Balansera alla tre sprutorna i buffert och prov separat. Vanligtvis fylls sprutan 1 med prov A och sprutorna 2-3 fylls med prov B (figur 3).
3. Ändra körningssekvensen. Ett exempel på en körningssekvens med alla 3 sprutor för ett snabbt blandningsexperiment ges i figur 6. Se även avsnittet "Körsekvensen" för mer information.
4. Olika tidsfördröjningar kan uppnås på två sätt:
   1. Ändra kolvens hastighet. Genom att justera kolvens hastighet kan tidsfördröjningen ändras inom ett relativt smalt intervall. Med ett spray/etanavstånd på 2 cm kan kolven till exempel flyttas på 1 m/s eller 2 m/s för att ge en tidsfördröjning på 20 ms respektive 10 ms. Detta görs enligt beskrivningen i steg 1.15.
   2. Ändra spray/etanposition genom att justera sprutmunstyckets (vertikala) läge. Om munstycket är placerat på 5 cm avstånd från etanytan, till exempel, ger en avsvalkningshastighet på 1 m/s en tidsfördröjning på 50 ms. För att uppnå betydligt längre tidsfördröjningar krävs ytterligare ändringar av installationen.
      OBS: På grund av laminärt flöde i munstyckets flödesfokuserande region förväntar vi oss inte någon signifikant blandning i denna del av munstycket. Istället förväntar vi oss att blandning sker under sprutgenerering, i droppar på väg till nätet och under droppspridning på nätet. Flygtiden för spraydroppar för att nå gallret uppskattas till ≤ 1 ms (för en dropphastighet på ≥ 10 m/s och ett munstyckesnätavstånd på 1 cm). Det är alltså bara tiden mellan dropplandning och vitrifiering som "tidsfördröjningen".

Representative Results

Snabb nätförberedelse med TED
Som ett testprov för snabb gallerberedning har vi använt apoferritin från häst mjälte vid 20 μM i 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. En rekonstruktion klockan 3.5 Å-upplösning erhölls från 690 mikrografer enligt beskrivningen i ref.¹⁵ (Figur 7A). Defokusområdet valdes så att partiklar lätt kan identifieras i de råa bilderna (Figur 7B). Ett typiskt rutnät som förberetts med en tidsfördröjning på 10-40 ms visar tillräckligt med områden med tunn is (figur 7C) för att möjliggöra insamling av > 1000 mikrografer. Den resulterande upplösningen begränsas sannolikt av istjocklek, visade tomografisk analys av ett antal olika galler 96 ± 33 nm^{istjocklek 6}.

Tidsbefriad cryo-EM
För att demonstrera snabb blandning och tidsupplösning med TED har vi använt dissociation av actomyosinkomplexet genom att blanda med ATP som modellreaktion¹⁹. Detta val baserades på den enkla skillnaden mellan aktomyosin och gratis F-aktin från råa mikrografer och reaktionens väl förstådda kinetik.

I följande visas de representativa resultaten för TrEM av dissociation av actomyosin komplexa av ATP. Detaljerade experimentella förfaranden och resultat anges i ref.¹⁹. I korthet blandades F-aktin och kanin skelett myosin S1 i 10 mM MOPS, 50 mM KAc, 2 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, pH 7 vid slutliga monomerkoncentrationer på 40 μM för att förbereda actomyosin (AM) komplexet. AM-komplexet laddades i spruta 1 och 200 μM MgATP i samma buffert laddades i sprutor 2 och 3. De viktigaste experimentella parametrarna för de två olika tidspunkter som förberetts visas i tabell 1.

För båda tidspunkterna var resultatet en 1:1 v/v blandning av AM-komplex och MgATP, vilket gav slutliga koncentrationer på 20 μM AM-komplex och 100 μM MgATP. Beräknad blandning till frystid var 7 och 13 ms enligt tabell 1. Den beräknade flygtiden för spraydroppar mellan munstycke och galler var < 1 ms.

En liten cryo-EM-datauppsättning (306 och 123 mikrografer) förvärvades för varje tidspunkt och de kombinerade data som bearbetades med hjälp av standard spiralformiga bearbetningsförfaranden²⁰. Den resulterande konsensusrekonstruktionen (båda tidsramarna tillsammans) visas i figur 8A. De kombinerade uppgifterna utsattes sedan för fokuserad klassificering och delades upp i en AM-komplex och en F-aktinklass(figur 8B,C). Sedan beräknades fraktionen av AM-komplexa eller F-aktinpartiklar för varje tidspunkt och visas i figur 8D.

Understödja klassar klassar konstanten för AM-komplex dissociation är 1.5 · 10⁶ M^-1 s^-1 21. Under antagandet att

Den integrerade hastighetslagen kan approximeras till

Där [AM-komplex] är den tidsberoende koncentrationen av AM-komplex är [AM-komplex]₀ den ursprungliga koncentrationen, k är den andra orderfrekvenskonstanten och [ATP]₀ är den (ursprungliga) ATP-koncentrationen.

Med hjälp av denna ekvation modellerades kinetiken i AM-komplex dissociation. Modellen överensstämmer ganska väl med de experimentella TrEM-data. Det finns signifikant variation per mikrograf som visas i figur 8D.

Bild 1: Den tidsbefriade EM-enheten (TED). B)Vätskehanteringsenheten med pumpar 1-3. Den fjärde pumpen till vänster används inte i detta arbete. Last- och dispenseringslägen anges för ventil 1, liksom provbehållaren ("prov 1"). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2:Pneumatisk kolv och linjär potentiometer. (A) Detaljer om TED:s pneumatiska kolv med viktiga komponenter märkta. B)Schematisk för TED:s pneumatiska system. Siffrorna motsvarar N_2-cylindern (1), huvudtrycksregulatorn (2), sprutmunstycket (3), magnetventilen (4), avsvalkningshastighetsregulatorn (5) och den dubbla stångens pneumatiska cylinder (6). C)Schematiskt för kretsen för potentiometern. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 3:Gasdynamiska virtuella munstycken för blandning och sprutning. a)Ett munstycke med 4 inloppsrör anslutna, för leverans till proverna (A och B) och N_2-gas. B)Schematisk för den centrala delen av PDMS-sprutmunstyckena med dubbelflödesfokuserande geometri för att uppnå flödesfokusering (för nedströmsblandning) och gasfokusering eller atomisering. Prov B visas i gult och prov A i lila. C)Mikroskopisk bild av blandnings- och atomiseringssektionerna i det mikrofluidiska munstycket. Bild från ref.¹⁵. Skala stång 100 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4:Miljökontroll av gallret och spray i akrylglaslådan. (A) Vy framifrån och( B) från sidan av TED. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 5: Körningssekvensen. (A) Ett exempel kör sekvens som visar variabler överst och sekvensen av kommandon längst ned. Några av nyckelkommandona är kommenterade i rött. (B) Rutnätsposition under tidsförloppet för en "körsekvens" som visas som en svart heldragen linje. Gallrets startposition är 0 cm. Spray initieras vid t = 0 s för 2 s, avståndet mellan spray och flytande etan är ~ 2 cm. Vid 1,5 s börjar gallret röra sig med 2 m/s, genom sprayen och in i den flytande etanen. Sekvensen slutar när sprayen slutar efter 2 s. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 6: Exempel kör sekvens för ett snabbt blandningsexperiment. Viktiga skillnader mot figur 5 A kommenteras i rött. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 7: Representativa resultat från ettenkelt sprutexperiment. (A) 3,5 Å rekonstruktion av hästapoferritin från ett galler förberett i 36 ms mellan sprutning och vitrifiering (EMD- 10533). B)Rå bild av samma apoferritinprov. C)Rutnätets låga förstoringsvy, en exemplarisk rutnätsruta som innehåller tunn is markeras med den streckade blå rektangeln, området med tunn is inom denna rutnätsruta indikeras av den blå pilen. Områden med tjock is eller förorening indikeras med asterisker. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 8: Representativa resultat av ett blandningsexperiment. (A) Konsensusrekonstruktion av am-komplexet som visas vid ett högt tröskelvärde (färgat) och lågt tröskelvärde (transparent). En myosintäthet är märkt och markerad med en streckad linje. Rekonstruktionen genererades från data från båda tidpunkterna tillsammans. F-aktinklass som inte visar någon myosinbunden. C)AM-komplex klass som visar myosinbundet (myosin i grått, huvudsakligen bundet till den ljusröda aktinunderenheten). (D) Jämförelse mellan kinetisk modell och experimentella TrEM-data. Visas är fraktionen av AM-komplex i förhållande till den ursprungliga koncentrationen. Stora solida svarta punkter indikerar genomsnittliga TrEM-data, små punkter visar TrEM-data per mikrograf. Den lila streckade linjen representerar den kinetiska modellen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

	flödeshastighet (μL/s)			spray/etanavstånd (cm)	avsvalkningshastighet (m/s)	tidsfördröjning (ms)
	spruta 1	spruta 2	spruta 3
	Jag är ledsen för det här.	- Jag är inte så bra på att se till att det finns en	- Jag är inte så bra på att se till att det finns en
7 ms	2.08	1.04	1.04	1.4	2	7
13 ms	1.04	0.52	0.52	2	1.6	13

Tabell 1: Experimentella inställningar för TrEM av AM-komplex dissociation av ATP

Discussion

Protokollen i detta arbete kan användas för snabb nätberedning genom direkt sprutning och TrEM-experiment. Snabb nätberedning kan användas för att minska partikelinteraktioner med luftvattengränssnittet⁵. De viktigaste begränsningarna är den tillgängliga provkoncentrationen och istjockleken på nätet. Inom dessa gränser och förutsatt att provkvaliteten är god, producerar protokollet galler som är lämpliga för högupplöst cryo-EM.

Felsökning
Vätskeflöde och näthastighet bestämmer mängden vätska som deponeras på nätet. Med de exempelinställningar som anges ovan (vätskeflöde 5 μL/s och avsvalkningshastighet 1-2 m/s) förväntas en bra täckning av nätet med droppar. Om munstycket inte var väl justerat (så spraydroppar missar gallret), visar frusna galler mycket få eller inga droppar.

Kontaminering av galler kan inte helt undvikas (se figur 7C)men kan minskas genom att minimera exponeringstiden för flytande etan till en fuktig miljö. Detta uppnås genom att förbereda replikerade rutnät så snabbt som möjligt (≤ 20 min för 4 rutnät). Vi förbereder vanligtvis 4 galler innan vi byter ut den flytande etanen.

Glaskroppsis på galler kan (delvis) kristalliseras om den första kylningen i flytande etan är för långsam. I enlighet med en tidigare studie²²har vi funnit låga avsvalkningshastigheter (< 0,5 m/s) leder till en ökning av kristallin is. Områden med mycket tjock is (≥ 200 nm) visar vanligtvis kristallin is på grund av i sig långsammare kylning. Om gallret värms upp under något av stegen efter beredningen av gallret (överföring från flytande etan till flytande kväve, överföring till lagring etc.) kan kristallin is också förekomma.

Datainsamling för TED-förberedda rutnät
Den genomsnittliga istjockleken som produceras av TED är tjockare än det "idealiska" cryo-EM-nätet som är förberett på ett standard blotting-system. Istjockleken kan också variera mellan förvärvsområden. Det innebär att förvärvsområden måste väljas noggrant för att ge den tunnaste möjliga isen. Defokusområdet kan behöva justeras för att få bilder med hög kontrast. När isen är tjock och partiklarna har låg kontrast föreslår vi ett första pilotdatainsamling med mycket höga defokusvärden (3 - 5 μm). Det senaste arbetet tyder på att hög upplösning fortfarande kan uppnås med hjälp av så höga defokusvärden²³.

För konventionell cryo-EM-datainsamling samlas ofta en hel datauppsättning in från ett enda rutnät. Vi har dock funnit insamlingen av flera små datamängder och sammanslagningen av dessa datamängder användbar. På så sätt kan flera tidspunkter registreras inom begränsad mikroskoptid och tidspunkter av intresse kan identifieras.

Behandling och analys av TrEM-data
Sammanslagning av datamängder kan rutinmässigt göras i de vanligaste cryo-EM-databehandlingsprogramvaran. Som beskrivits ovan och i andras arbete kan sammanslagning av datamängder från separata tidspunkter vara användbar¹⁷. Det är viktigt att partiklar kan spåras tillbaka till sin ursprungliga delmängd (tidspunkt) under hela bearbetningen.

Konventionella kinetiska mätningar (till exempel med hjälp av ljusspridning eller fluorescens) kan vara ett värdefullt komplement till TrEM-experiment. Hastighetskonstanter från biokemiska mätningar kan användas för att förutsäga livslängden för mellanliggande intressetillstånd eller för att bekräfta den kinetik som observerats av TrEM. För en grundläggande introduktion till reaktionskinetik och deras förhållande till tidsbefriade strukturstudier, se ref.²⁴.

Det finns ett antal möjliga orsaker till skillnader mellan TrEM och konventionella kinetiska experiment. Som visas i figur 8Dkan TrEM-data visa betydande variationer per mikrograf. Vi noterar också att preliminära data tyder på minst 5% variabilitet i relativa partikeltal mellan replikerade rutnät. Partikelklassificering (klasstilldelning) kan vara ofullständig, särskilt om tillstånden är strukturellt lika eller om en struktur är mycket flexibel. Partiklar, och därmed TrEM-härledd kinetik, kan också påverkas av partikelinteraktioner med luft-vattengränssnittet eftersom sådana interaktioner reduceras men inte elimineras vid snabba hastigheter.

Detta arbete ger några riktlinjer för TrEM men vi noterar att detta är ett aktivt forskningsområde, och vi förväntar oss ytterligare framsteg i framtiden. Medan TrEM-experiment kräver betydande experimentell ansträngning, kan de erbjuda högupplöst insikt i dynamiken i makromolekylära komplex.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Time resolved device
acrylic glass box	USA scientific
digital humidity/temperature controller	THE20 digital humidity/temperature controller
dual rod pneumatic cylinder	dual rod pneumatic cylinder TN 10x70
FEP tubing	Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing
flangeless fittings	Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings
flexible reinforced PVC tubing	12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing
glass syringes	Kloehn 250 µL zero-dead volume
humidifier pump	Interpret Aqua Air AP3
liquid ethane container	from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
multistage regulator	GASARC class 3 multistage regulator
negative pressure tweezers	Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers
oscilloscope	Hantek 6022BE oscilloscope
PE tubing	Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing
power supply	Mean Well GSM160A24-R7B
power supply	Wanptek KPS305D power supply
PU tubing	SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing
regulator	Norgren R72G-2GK-RMN
slide potentiometer	PS100 slide potentiometer
solenoid valve	SMC NVJ314M solenoid valve
syringe drive pumps	Kloehn V6 48K model
Reagents & Materials
apoferritin from equine spleen	Sigma-Aldrich, A3660
ATP	Sigma-Aldrich, A2383
cryo-EM grids	Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA	Sigma Aldrich E3889
F-actin	Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)
glow-discharger	Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit
HEPES	Sigma-Aldrich, H7006
KAc	Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2	Sigma-Aldrich, M8266
MOPS	Sigma-Aldrich, M1254
NaCl	Sigma-Aldrich, S9888
Skeletal muscle myosin S1	Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)
Ref 1	Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).
Ref 2	White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).