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Biochemistry

समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62199
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1School of Biomedical Sciences, Faculty of Biological Sciences & Astbury Centre for Structural and Molecular Biology, University of Leeds, 2School of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences & Astbury Centre for Structural and Molecular Biology, University of Leeds, 3Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

Summary

यहां, हम तेजी से ग्रिड बनाने दोनों के लिए एक रैपिड ग्रिड बनाने वाले डिवाइस के उपयोग के लिए और समय-हल किए गए प्रयोगों का संचालन करने के लिए तेजी से मिश्रण और ठंड के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) का क्षेत्र तेजी से नए हार्डवेयर और प्रसंस्करण एल्गोरिदम के साथ विकसित हो रहा है, जो उच्च संकल्प संरचनाओं और अधिक चुनौतीपूर्ण प्रणालियों के बारे में जानकारी का उत्पादन कर रहा है। क्रायो-ईएम के लिए नमूना तैयारी पारंपरिक ब्लॉटिंग सिस्टम को अधिस्थान करने के लिए विकसित किए जा रहे नए दृष्टिकोणों के साथ एक समान क्रांति के दौर से गुजर रही है। इनमें पीजो-इलेक्ट्रिक डिस्पेंसर का उपयोग, पिन प्रिंटिंग और प्रत्यक्ष छिड़काव शामिल हैं। इन घटनाओं के परिणामस्वरूप, ग्रिड तैयार करने की गति सेकंड से मिलीसेकंड तक जा रही है, विशेष रूप से समय-हल किए गए क्रायो-ईएम के क्षेत्र में नए अवसर प्रदान करती है, जहां प्रोटीन और सब्सट्रेट्स को डुबकी ठंड से पहले तेजी से मिलाया जा सकता है, अल्पकालिक मध्यवर्ती राज्यों को फंसाने। यहां हम विस्तार से, हमारे इन-हाउस समय-हल ईएम डिवाइस पर ग्रिड बनाने के लिए मानक फास्ट ग्रिड तैयारी और समय-हल किए गए प्रयोगों के लिए भी एक मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल के लिए 4 ग्रिड तैयार करने के लिए ≥ 2 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता पर न्यूनतम लगभग 50 माइक्रोन नमूना की आवश्यकता होती है। नमूना आवेदन और ठंड के बीच देरी के रूप में 10 एमएस के रूप में कम हो सकता है । एक सीमा तेज गति से बर्फ की मोटाई में वृद्धि हुई है और ब्लॉटिंग विधि की तुलना में । हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल दूसरों को अपने ग्रिड बनाने वाले उपकरणों और समय-हल किए गए प्रयोगों को डिजाइन करने में रुचि रखने वालों को डिजाइन करने में सहायता करेगा।

Introduction

पृष्ठभूमि
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) में हाल की घटनाओं ने उच्च संकल्प पर तेजी से जटिल प्रणालियों के संरचनात्मक अध्ययन को सक्षम किया है। कुछ अपवादों के साथ, इस तरह के अध्ययन संतुलन1 या अपेक्षाकृत धीमी प्रतिक्रियाओं पर जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स तक सीमित रहे हैं2। वीवो में कई प्रक्रियाएं तेजी से टाइमस्केल (मिलीसेकंड) पर होती हैं और इन टाइमस्केल 3 पर समय-हल होने वाले क्रायो-ईएम (टीआरईएम) में रुचि बढ़ रही है। हालांकि, ब्लॉटिंग विधि द्वारा पारंपरिक क्रायो-ईएम नमूना तैयार करना मिलीसेकंड टीआरईएम के लिए बहुत धीमा है।

ब्लॉटिंग विधि में खराब समय संकल्प के अलावा अन्य सीमाएं हैं। प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स4ग्रिड पर डेनैचेशन या पसंदीदा अभिविन्यास से पीड़ित हो सकते हैं। नमूना तैयारी के दौरान हवा-पानी के इंटरफ़ेस के संपर्क में आने वाले समय को कम करने के लिए पसंदीदा अभिविन्यास और प्रोटीन डेनैचुरेशन5,6को कम करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, फास्ट ग्रिड तैयारी न केवल मिलीसेकंड टीआरईएम को सक्षम बनाती है बल्कि ग्रिड की गुणवत्ता में भी सुधार कर सकती है।

वर्तमान में, स्वचालित ग्रिड तैयारी के लिए तीन अलग-अलग दृष्टिकोण हैं। पहला दृष्टिकोण एक पिन या केशिका का उपयोग करता है जो थोड़ी मात्रा में नमूना रखता है। तरल और ग्रिड सतह के बीच संपर्क स्थापित करने के बाद, नमूना ग्रिड7,8पर 'लिखा' है। नमूना आवेदन प्रक्रिया अपेक्षाकृत धीमी है और इसमें कुछ सेकंड लगते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक पीजो डिस्पेंसर और सेल्फ-बाती ग्रिड9द्वारा नियंत्रित बूंद पीढ़ी का उपयोग करता है। यह तेजी से समय फ्रीज करने के लिए बांटना की अनुमति देता है, लेकिन अभी भी बूंद और बाती गति से सीमित है (वर्तमान में ५४ एमएस तक पहुंचने) । अब तक का सबसे तेज़ दृष्टिकोण प्रत्यक्ष स्प्रे दृष्टिकोण है, जिसमें नमूना स्प्रे नोजल और छोटे (~ 10 - 20 माइक्रोन) और क्रायो-ईएम ग्रिड के संपर्क में फैलने वाली तेज (5 मीटर/>) बूंदों में परमाणु है। नमूना स्प्रे विभिन्न तरीकों जैसे एयरब्लास्ट एटमाइजर्स, सतह ध्वनिक तरंगों या अल्ट्रासोनिक ह्यूमिडिफायर्स10, 11,12,13जैसे विभिन्न तरीकों से उत्पन्न किया जासकताहै। हमारे अनुभव में, प्रत्यक्ष छिड़काव दृष्टिकोण के साथ बर्फ की मोटाई अधिक है, लेकिन प्रत्यक्ष छिड़काव 10 एमएस < के समय फ्रीज करने के लिए बांटना सक्षम बनाता है ।

यह प्रोटोकॉल चरण-दर-कदम बताता है कि माइक्रोफ्लुइडिक स्प्रे नोजल से लैस एक समय-हल ईएम डिवाइस (टेड) का उपयोग तेजी से टाइमस्केल14, 15पर ग्रिड तैयार करने के लिए कैसे किया जा सकता है। डिवाइस नमूना आवेदन और ठंड के बीच 6 एमएस की एक ंयूनतम देरी समय के साथ ग्रिड तैयार करने के लिए और तेजी से मिश्रण और दो नमूनों को फ्रीज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । टेड का डिजाइन पिछले संस्करण16 पर आधारित है और अन्य स्प्रे-आधारित समय-हल क्रायो-ईएम उपकरणों17के समान है।

सबसे पहले, टेड सेटअप के चार मुख्य भागों का वर्णन किया गया है। टेड का मूल तरल हैंडलिंग इकाई है, जो नमूना आकांक्षा और वितरण के लिए जिम्मेदार है। एक वायवीय प्लंजर स्प्रे के माध्यम से ग्रिड को तरल इथेन में ले जाता है। स्प्रे का उत्पादन माइक्रोफ्लुइडिक स्प्रे नोजल के साथ हासिल किया जाता है और ठंड एक तरल इथेन कंटेनर में की जाती है, जिसे संक्षेप में वर्णित किया जाता है। अंत में, ग्रिड पर्यावरण, विशेष रूप से आर्द्रता को नियंत्रित करने के लिए अतिरिक्त सुविधाओं पर प्रकाश डाला गया है। इसके बाद डिवाइस के संचालन के लिए और टीआरईएम प्रयोगों के संचालन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल हैं। प्रतिनिधि परिणाम तेजी से ग्रिड की तैयारी और एक सरल TrEM प्रयोग के लिए दिए जाते हैं।

प्रायोगिक सेटअप

तरल हैंडलिंग इकाई
टेड का लिक्विड हैंडलिंग सिस्टम तीन सिरिंज ड्राइव पंप ('पंप 1 - 3') द्वारा बनाया गया है, प्रत्येक रोटरी वाल्व(चित्रा 1)से लैस है। एक बिजली की आपूर्ति 24 वी डीसी के साथ पंप 1 - 3 प्रदान करता है। नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ संचार (विजुअल बेसिक और सी ++) में लिखा गया है, जो 1 पंप करने के लिए RS232 इंटरफेस के माध्यम से है। आदेश 1 पंप से पंप 2-3 के लिए धारावाहिक I/O विस्तार बंदरगाहों के माध्यम से वितरित कर रहे हैं । पंप 1-3 ग्लास सीरिंज से लैस हैं ('सीरिंज 1-3', हम यहां 250 माइक्रोल/जीरो डेड वॉल्यूम सीरिंज का इस्तेमाल करते हैं)। प्रत्येक वाल्व में दो स्थितियां होती हैं, 'लोड' और 'डिस्पेंस'। 'लोड' स्थिति का उपयोग सिरिंज में नमूना को एस्पिरेट करने के लिए किया जाता है। एक छोटा टुकड़ा (~ 3-4 सेमी) 1/16 के "O.D., 0.01 ′ ' I.D. FEP टयूबिंग ETFE के माध्यम से जुड़ा हुआ है/ ट्यूबिंग का यह छोटा टुकड़ा नमूना जलाशय (आमतौर पर 1.5 एमएल या 0.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब) में पहुंचता है। 'डिस्पेंस' स्थिति स्प्रे नोजल की ओर जाता है। 'डिस्पेंस' आउटलेट और स्प्रे नोजल के बीच कनेक्शन पीई ट्यूबिंग (~ 20-30 सेमी लंबाई, 0.043" O.D., 0.015 "I.D.) द्वारा किया जाता है, जिसमें आस्तीन ट्यूबिंग (~ 0.5 सेमी) और ETFE/ETFE फ्लैंजलेस फिटिंग का एक छोटा टुकड़ा होता है।

वायवीय प्लंजर
टेड ग्रिड में तेजी लाने और नमूना स्प्रे के माध्यम से तरल इथेन कंटेनर में इसे स्थानांतरित करने के लिए एक वायवीय प्लंजर का उपयोग करता है। नकारात्मक दबाव चिमटी ग्रिड पकड़, एक घर में खराब धारक जो एक दोहरी रॉड वायवीय सिलेंडर(चित्रा 2A)के लिए मुहिम शुरू की है ।

दबाव एक बड़े नाइट्रोजन गैस सिलेंडर (आकार डब्ल्यू) से आपूर्ति की जाती है, जो एक बहुमंच नियामक (0 - 10 बार, 'मुख्य दबाव' से लैस है। लचीला प्रबलित पीवीसी ट्यूबिंग (12 मिमी O.D.) नियामक को 12-पोर्ट कई गुना से जोड़ता है जहां दबाव नाइट्रोजन नोजल और वायवीय प्लंजर को दिया जाता है। नोजल के माध्यम से गैस का प्रवाह स्थिर होता है, सीधे नाइट्रोजन सिलेंडर (मुख्य दबाव) पर विनियमित होता है। नोजल का कनेक्शन पीयू ट्यूबिंग (4 मिमी O.D., 2.5 मिमी I.D.), पीई ट्यूबिंग का एक छोटा टुकड़ा (~ 8 सेमी लंबाई, 0.043" O.D., 0.015 "I.D.) और उपयुक्त कनेक्टर के साथ बनाया गया है। वायवीय प्लंजर पर दबाव एक सोनालिका वाल्व के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। पीयू ट्यूबिंग (4 मिमी O.D., 2.5 मिमी I.D.) एक नियामक और वायवीय प्लंजर के साथ सोनालिका वाल्व को जोड़ता है, ताकि कम डुबकी दबाव (≤ मुख्य दबाव) की अनुमति दी जा सके। सोनालिका वाल्व कंप्यूटर नियंत्रित है। चित्रा 2बीमें सेटअप का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन दिया गया है ।

ध्यान दें कि इस सेटअप के साथ डुबकी दबाव हमेशा स्प्रे गैस दबाव (मुख्य दबाव) से बराबर या छोटा होता है। हालांकि, कम स्प्रे गैस दबाव पर उच्च डुबकी गति की अनुमति देने के लिए स्प्रे नोजल के एक दूसरे नियामक अपस्ट्रीम को शामिल करके सेटअप को आसानी से बदला जा सकता है। उच्च दबाव (>> 2 बार) पीडीएमएस स्प्रे नोजल को नुकसान पहुंचा सकता है।

सावधानी: यह एक दबाव प्रणाली है और 'मुख्य दबाव' हमेशा 7 बार < होना चाहिए।

0.5 और 2 बार के बीच दबाव आमतौर पर वायवीय प्लंजर के लिए उपयोग किया जाता है और दबाव और गति (स्प्रे की ऊर्ध्वाधर स्थिति पर) के बीच लगभग रैखिक संबंध दिखाता है। डुबकी की गति को ऑसिलोस्कोप के साथ मापा जाता है, जो स्लाइड शक्तिशाली (10 kΩ) के अनुरूप और 2 kΩ प्रतिरोधक(चित्रा 2C)के समानांतर जुड़ा हुआ है। एक बिजली की आपूर्ति 9 वी डीसी के साथ शक्तिशाली आइटम प्रदान करता है। जबकि अनुमानित डुबकी गति डुबकी दबाव स्थापित करके प्रयोग से पहले सेट किया जाता है, शक्तिशालीमीटर प्रयोग के बाद गति का एक सटीक readout देता है ।

स्प्रे नोजल और तरल इथेन कंटेनर
स्प्रे आधारित नमूना वितरण के लिए गैस-गतिशील वर्चुअल नोजल के निर्माण और संचालन को विस्तार से15अन्य जगहों पर वर्णित किया गया है। जैसा कि ऊपर वर्णित है, वाल्व 1-3 के 'डिस्पेंस' आउटलेट नोजल(चित्रा 3 ए)के तरल इनलेट्स से जुड़े होते हैं। दबाव स्प्रे गैस नोजल के गैस इनलेट से जुड़ा होता है। पीडीएमएस स्प्रे नोजल में इनलेट्स ऐसे हैं कि 0.043 "डी पीई ट्यूबिंग का उपयोग फिटिंग की आवश्यकता के बिना सीधे किया जा सकता है। हमारे नोजल डिजाइन में दो नमूनों के मिश्रण के लिए 'जेट-इन-जेट' ज्यामिति शामिल है, जो रेफरी18में वर्णित डिवाइस के समान है। चित्र 3बीमें डिजाइन की एक योजनाबद्ध दिखाया गया है, एक नोजल की एक सूक्ष्म छवि चित्र 3 सीमें दिखाई गई है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के लेआउट में दो नमूनों को मिलाने के लिए तीन सीरिंज के इस्तेमाल की जरूरत होती है । स्प्रे नोजल आमतौर पर ग्रिड (नमूना आवेदन के दौरान) से 1-1.5 सेमी दूरी पर तैनात है।

हम एक क्रायोजेन के रूप में तरल इथेन का उपयोग करते हैं, एक तरल इथेन/नाइट्रोजन कंटेनर में के रूप में मानक ब्लॉटिंग विधि के लिए इस्तेमाल किया । तरल इथेन कप की ऊर्ध्वाधर स्थिति प्रयोगशाला उठाने के मंच के साथ हासिल की जाती है।

स्प्रे और ग्रिड पर्यावरण का नियंत्रण
प्लंजर और स्प्रे नोजल एक कस्टम निर्मित पीएमएमए (ऐक्रेलिक ग्लास) बॉक्स के भीतर एक डबल डोर(चित्रा 4A)के साथ निहित हैं। बॉक्स के अंदर उच्च सापेक्ष आर्द्रता टेड(चित्रा 4B)के पीछे एक वायु-आर्द्रीकरण प्रणाली द्वारा प्राप्त की जाती है। हवा एक पंप द्वारा आपूर्ति की है और एक पहले 10 में खिलाया "कनस्तर (आम तौर पर सिंक पानी शुद्धिकरण के तहत के लिए इस्तेमाल किया) । कनस्तर पानी के एक कम (~ 5-10 सेमी) स्तर से भरा हुआ है और यह भी एक ह्यूमिडिफायर इकाई घरों। ह्यूमिडिफायर को मेन्स पावर को डिजिटल आर्द्रता/तापमान नियंत्रक और एक्रेलिक ग्लास बॉक्स के अंदर स्थित आर्द्रता/तापमान सेंसर द्वारा नियंत्रित किया जाता है । नियंत्रक को पंप बंद करने के लिए सेट है जब सापेक्ष आर्द्रता ९०% ≥ तक पहुंचता है । पहले कनस्तर से आर्द्रीकृत हवा को एक विसारक के माध्यम से पंप किया जाता है, जो दूसरे 10 "कनस्तर में पानी में डूबे होते हैं और फिर ऐक्रेलिक ग्लास बॉक्स में प्रवेश करते हैं।

सावधानी: क्योंकि नमूना स्प्रे नोजल में एयरोसोलाइज्ड है, खतरनाक जैविक या रासायनिक नमूना नमूने के रूप में उपयुक्त नहीं हैं।

रन अनुक्रम
नियंत्रण सॉफ्टवेयर में रन स्क्रिप्ट बटन रन अनुक्रम शुरू करता है। आदेशों के इस अनुक्रम को स्क्रिप्ट फ़ाइल में पूर्व-परिभाषित किया जा सकता है और सॉफ्टवेयर के माध्यम से बदल दिया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण चर यहां समझाया गया है:

स्प्रे गति: स्प्रे की गति सिरिंज पंप द्वारा उपयोग किए जाने वाले तरल प्रवाह को निर्धारित करती है। फ्लिकेट की गणना इस प्रकार की जा सकती है: यहां उपयोग की जाने वाली सिरिंज पंप मोटर्स का एक निश्चित चरण आकार होता है। पंप की पूरी रेंज 48,000 चरणों में विभाजित है। दूसरा महत्वपूर्ण कारक सिरिंज की मात्रा है। हम आम तौर पर 250 माइक्रोन सीरिंज का उपयोग करते हैं। नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्प्रे की गति चरणों/सेकंड की संख्या के रूप में निर्धारित की जाती है । 1000 चरणों/सेकंड की एक स्प्रे गति से मेल खाती है:

Equation 1

स्प्रे की मात्रा: स्प्रे की मात्रा कुल मात्रा को छिड़काव करने के लिए निर्धारित करती है। इस प्रकार, यह स्प्रे की अवधि भी निर्धारित करता है। नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्प्रे की मात्रा कई चरणों के रूप में सेट की जाती है। 1000 चरणों/सेकंड की स्प्रे गति पर 2000 चरणों की स्प्रे मात्रा, 2 एस की स्प्रे अवधि और 10.4 माइक्रोन की कुल मात्रा की ओर जाता है।

प्री-स्प्रे समय: यह चर स्प्रे की शुरुआत और डुबकी के बीच के समय को परिभाषित करता है। यह देरी समय इस तरह का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्प्रे ग्रिड जल्दी से आगे बढ़नेवाला से पहले स्थिर करने के लिए पर्याप्त समय है । आमतौर पर, ग्रिड के गिरने से पहले स्थिर होने के लिए स्प्रे 1.5 - 4 एस दिया जाता है। जब तक ग्रिड के माध्यम से स्थानांतरित नहीं हो जाता तब तक स्प्रे बनाए रखा जाता है। आमतौर पर, ग्रिड के गिर जाने के बाद तरल प्रवाह (और इसलिए स्प्रे) को 0.5 से 1 एस बंद कर दिया जाता है। 1000 चरणों/एस की स्प्रे गति और 2000 चरणों की स्प्रे मात्रा का उपयोग करके, उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट प्री-स्प्रे समय 1.5 एस है।

आदेशों का एक अनुकरणीय अनुक्रम चित्रा 5 एमें दिखाया गया है , समय के साथ ग्रिड की स्थिति चित्र 5बीमें दिखाई जाती है ।

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Protocol

1. सिस्टम तैयार करना

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल बताता है कि एक ही नमूने के ग्रिड कैसे तैयार किए जाएं। आमतौर पर, प्रत्येक नमूने या स्थिति के लिए न्यूनतम 2 दोहराने वाले ग्रिड तैयार किए जाते हैं। तेज डुबकी गति (~ 20 एमएस समय देरी से कम) के लिए, 3 या 4 दोहराने ग्रिड आम तौर पर पतली बर्फ क्षेत्रों की एक कम संख्या के लिए खाते के लिए तैयार कर रहे हैं ।

  1. वांछित बफर में लक्ष्य एकाग्रता के लिए प्रोटीन नमूना पतला। आमतौर पर, 2 मिलीग्राम/एमएल ≥ अंतिम सांद्रता टेड के साथ ग्रिड तैयार करने के लिए अच्छी तरह से काम करती है। ध्यान दें कि नमूना 10 कदम तक बर्फ पर रखा जा सकता है, कदम 10 के बाद से नमूना कमरे के तापमान पर काफी समय खर्च करेगा क्योंकि 3-4 ग्रिड तैयार करने में लगभग 20 मिनट लगते हैं।
  2. टेड चालू करें। इसके बाद कंट्रोल पीसी चालू करें और कंट्रोल सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  3. प्रत्येक सिरिंज पंप पर प्रारंभिक बटन (कम काला बटन) दबाकर सभी सिरिंज पंपों को शुरू करें।
  4. शक्तिशाली बिजली की आपूर्ति चालू करें, इसे 9 वी में सेट करें और ऑसिलोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू करें।
  5. सुनिश्चित करें कि एन2-सिलेंडर का नियामक वाल्व बंद हो गया है। सिलेंडर का वाल्व खोलें। फिर, धीरे-धीरे स्प्रे गैस दबाव (आमतौर पर 1-2 बार) के लिए वांछित मूल्य के लिए आउटलेट दबाव स्थापित करने वाले नियामक वाल्व को खोलें। यहां उपयोग किए जाने वाले पीडीएमएस नोजल के लिए, नोजल को नुकसान से बचने के लिए ~ 2.5 बार से अधिक दबाव का उपयोग न करें। लगातार बहने वाली गैस तरल को नोजल टिप पर टपकने और जमने से रोकती है जिससे अपरिवर्तनीय छिड़काव हो सकता है।
  6. सुनिश्चित करें कि सभी सिरिंज पंप वाल्व 'लोड' स्थिति में हैं। यह नियंत्रण सॉफ्टवेयर में 'डिस्पेंस' स्थिति में सभी वाल्व स्विच करके और फिर वापस 'लोड' पर किया जा सकता है। सभी वाल्व को 'लोड' में बंद कर दें। सभी सीरिंज को शून्य पर सेट करें।
  7. इस स्तर पर सिस्टम में मौजूद किसी भी हवा-बुलबुले को हटा दें। ऐसा करने के लिए, सीरिंज को अनस्क्रूड करना पड़ सकता है, बुलबुले मैन्युअल रूप से हटाए जा सकते हैं और सीरिंज फिर से चढ़कर जब कोई और बुलबुले नहीं होते हैं।
  8. तरल हैंडलिंग घटक आमतौर पर एच2ओ में संग्रहीत होते हैं। नमूना समाधान लोड करने से पहले, बफर की अधिकता के साथ ट्यूबिंग को धोकर तरल प्रणाली को बफर के साथ बराबर करें। स्प्रे नोजल पर ओवरप्रेशर से बचने के लिए उचित अधिकतम तरल प्रवाह का उपयोग करें। 10 माइक्रोन/एस > तरल प्रवाह यहां वर्णित पीडीएमएस नोजल को नुकसान पहुंचा सकता है।
  9. एक 1.5 एमएल ट्यूब जिसमें ≥ 200 माइक्रोन बफर को सिरिंज 1 पर रखें (ट्यूबिंग से जुड़ने के लिए शीर्ष को छेदा जाना चाहिए)।
    1. सुनिश्चित करें कि वाल्व 1 'लोड' स्थिति में है। यदि आवश्यक हो तो नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्विच करें।
    2. नियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से, सिरिंज 1 के साथ बफर की वांछित राशि (आमतौर पर 50-100 माइक्रोन) को एस्पिरेट करें।
    3. नियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से वाल्व 1 को 'डिस्पेंस' स्थिति में स्विच करें।
    4. नियंत्रण सॉफ्टवेयर के माध्यम से सिरिंज 1 में तरल के सभी बांटना।
    5. 'लोड' करने के लिए वाल्व वापसी, कार्यक्रम में '0' के लिए सिरिंज की स्थिति रीसेट और अगले चक्र के लिए प्रणाली तैयार करने के लिए, सिरिंज 1 पर शुरू प्रेस।
      नोट: टयूबिंग की पूरी तरह से धुलाई सुनिश्चित करने के लिए चरण 1.9.1 - 1.9.5 आमतौर पर तीन बार दोहराए जाते हैं।
  10. जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ क्लैंप ढीला करके, क्लैंप में चिमटी रखने और क्लैंप कस द्वारा एक ईएम ग्रिड (किसी भी विशिष्ट प्रकार के लिए कोई आवश्यकता नहीं) के साथ चिमटी लोड करें।
  11. मैन्युअल रूप से जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ ले जाएँ ताकि ग्रिड और नोजल एक ही ऊंचाई ('नमूना आवेदन' स्थिति) पर हैं। यदि नोजल और ग्रिड गठबंधन कर रहे हैं, तरल एक विस्तारित अवधि के लिए छिड़काव के बाद ग्रिड पर जमा होगा । यदि आवश्यक हो, तो नोजल स्थिति को समायोजित करें।
  12. तरल इथेन कप की स्थिति को मैन्युअल रूप से घुड़सवार चिमटी के साथ जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ को अपनी अंत स्थिति (एथेन कप में पहुंचने) के लिए स्थानांतरित करके समायोजित करें। जब सही ढंग से स्थापित किया जाता है, तो चिमटी द्वारा आयोजित एक ग्रिड तरल इथेन कप के लगभग केंद्र तक पहुंच जाएगा।
  13. जांच करें कि 'रन स्क्रिप्ट' वांछित फ्लोरेट, वॉल्यूम और समय का उपयोग करेगी। विवरण के लिए ऊपर अनुभाग 'द रन सीक्वेंस' देखें.
  14. सुनिश्चित करें कि कुछ भी प्लंजर के रास्ते में बाधा नहीं डाल रहा है। सिरिंज 1 में एक ही रन के लिए आवश्यक बफर की मात्रा को एस्पिरेट करें। यह नियंत्रण सॉफ्टवेयर में किया जाता है, विशिष्ट सेटिंग और वॉल्यूम के लिए सेक्शन 'द रन सीक्वेंस' देखें। फिर सुनिश्चित करें कि वाल्व 1 को 'डिस्पेंस' स्थिति में बंद कर दिया गया है। नियंत्रण सॉफ्टवेयर में रन स्क्रिप्ट दबाकर एक परीक्षण रन करें।
    सावधानी: रन अनुक्रम समाप्त होने तक टेड से स्पष्ट रहें। चलती भागों चोट का कारण बन सकता है!
  15. जब 'रन अनुक्रम' समाप्त हो जाता है, तो वांछित मूल्य (आमतौर पर 1-2 बार) के लिए जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ पर दबाव निर्धारित करें। तभी जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ से दबाव जारी करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर में ठीक प्रेस। यदि जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ पर 'रन अनुक्रम' या दबाव को समायोजित करने की आवश्यकता है, तो इन सेटिंग्स को इस स्तर पर बदला जा सकता है और कदम 1.13 - 1.15 दोहराया जा सकता है।

2. फास्ट ग्रिड तैयारी

  1. तरल एथेन/नाइट्रोजन कंटेनर को सबसे पहले तरल नाइट्रोजन के साथ भरें। जब पर्याप्त रूप से ठंडा और तरल नाइट्रोजन से मुक्त हो, तो कप को तरल इथेन से भरें। तरल इथेन के जमना से बचें। यह कदम पारंपरिक ग्रिड तैयारी के समान है।
    नोट: इथेन संदूषण को कम करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि चरण 2.2 - 2.13 जितनी जल्दी हो सके किए जाते हैं
    सावधानी: तरल इथेन एक क्रायोजन और ज्वलनशील है। हैंडलिंग करते समय सावधानी बरतनी चाहिए।
  2. ग्लो-डिस्चार्ज के लिए क्रायो-ईएम ग्रिड तैयार करें। हम आम तौर पर 0.1 mbar हवा के दबाव और 10 एमए पर, 90 एस के लिए होले कार्बन ग्रिड और ग्लो-डिस्चार्ज का उपयोग करते हैं। आमतौर पर, एक समय में 4 से अधिक ग्रिड चमक नहीं होते हैं। ग्रिड का उपयोग 30 मिनट के भीतर चमक-निर्वहन के भीतर किया जाता है।
  3. नमूना के साथ ट्यूबिंग को बराबर करें (बफर के बजाय नमूने का उपयोग करके 1.9.1 - 1.9.5 के बाद) । यदि उपलब्ध नमूना मात्रा कम है, तो ट्यूबिंग को केवल 1 मृत मात्रा के साथ समतुल्य किया जा सकता है।
  4. नियंत्रण सॉफ्टवेयर में सिरिंज 1 में एक रन के लिए आवश्यक नमूने की मात्रा को एस्पिरेट करें (विवरण के लिए अनुभाग 'द रन सीक्वेंस' देखें)। फिर वाल्व 1 को 'डिस्पेंस' स्थिति में स्विच करें।
  5. जांच करें कि सापेक्ष आर्द्रता वांछित मूल्य तक पहुंच गई है (हम आम तौर पर 60% सापेक्ष आर्द्रता या उससे अधिक पर ग्रिड तैयार करते हैं)। एक बार ≥ 60% आर्द्रता पहुंच जाती है, तो उच्च आर्द्रता बनाए रखने के लिए आर्द्रता कक्ष को केवल न्यूनतम समय के लिए खोलें।
  6. चिमटी रखें, एक चमक-छुट्टी ग्रिड पकड़े, वायवीय प्लंजर में और उन्हें ठीक करें। अपनी शुरुआत की स्थिति (शीर्ष पर) के लिए प्लंजर ले जाएँ।
  7. सुनिश्चित करें कि शक्तिशाली का स्लाइडर शुरुआत की स्थिति में है, माप के लिए तैयार है, इसे मैन्युअल रूप से प्लंजर से संपर्क करने के लिए ले जाकर। ऑसिलोस्कोप सॉफ्टवेयर में ऑसिलोस्कोप पर ट्रिगर सेट करें।
  8. तरल इथेन/नाइट्रोजन कंटेनर रखें।
  9. नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्क्रिप्ट चलाएं प्रेस करें। जब प्रेरित किया, नियंत्रण सॉफ्टवेयर में ठीक क्लिक करने के लिए रन शुरू करते हैं ।
    सावधानी: रन अनुक्रम समाप्त होने तक टेड से स्पष्ट रहें। चलती भागों चोट का कारण बन सकता है!
  10. एक बार 'रन सीक्वेंस' पूरा हो जाने के बाद, कंट्रोल सॉफ्टवेयर में ओके पर क्लिक करके वायवीय प्लंजर पर दबाव जारी करें।
  11. खुली आर्द्रता कक्ष, दूसरे के साथ चिमटी को सुरक्षित करते हुए एक हाथ से जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ और चिमटी के बीच संबंध ढीला। जब चिमटी मुक्त हो, तो ग्रिड को तरल इथेन में रखते हुए जल्दी से आगे बढ़नेवाला हाथ ऊपर ले जाएं। फिर ग्रिड को आसपास के तरल एन2में अपने भंडारण स्थान पर स्थानांतरित कर दें । ठंड लगने के बाद ग्रिड को हर समय लिक्विड एन2 टेम्परेचर पर रखने की जरूरत होती है।
  12. ऑसिलोस्कोप माप को सहेजें। मैन्युअल रूप से शक्तिशाली स्लाइडर और प्लंजर की स्थिति को बाद में रीसेट करें।
  13. दोहराने ग्रिड तैयार करने के लिए कदम 2.4-2.12 दोहराएं
  14. ग्रिड क्लिपिंग और डेटा संग्रह तक ग्रिड को दीर्घकालिक भंडारण में स्थानांतरित करें।
  15. चरण 1.9.1 - 1.9.5 के अनुसार, सिस्टम को बफर से धोएं। फिर चरण1.9.1- 1.9.5 के अनुसार, एच 2 ओ के साथ सिस्टम को धोएं।
  16. मुख्य नाइट्रोजन गैस रेगुलेटर बंद कर दें और बिजली बंद कर दें।
  17. एथेन/नाइट्रोजन कंटेनर को एक धुएं के हुड में रखें ताकि इसे गर्म किया जा सके और तरल इथेन और एन2 को वाष्पित होने दें ।

3. समय-हल क्रायो-ईएम

नोट: जब टेड के साथ समय-हल किए गए प्रयोग किए जाते हैं, तो विचार किए जाने वाले अतिरिक्त पहलुओं पर विचार किया जाता है, हालांकि मूल सेटअप और चर समान रहते हैं। यहां यह माना जाता है कि ग्रिड पर जमा किए गए अंतिम मिश्रण का उत्पादन करने के लिए 1:1 (v/v) अनुपात में दो समाधान मिलाए जाते हैं । '1' में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें। निम्नलिखित परिवर्तनों के साथ टेड के साथ फास्ट ग्रिड तैयारी:

  1. सरल स्प्रे प्रयोगों की तुलना में प्रयोगों को मिलाने के लिए उच्च स्टॉक सांद्रता का उपयोग करें। 1:1 (v/v) अनुपात में मिश्रण प्रत्येक घटक के 2x कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप होगा ।
  2. एक तेजी से मिश्रण प्रयोग के लिए, सिर्फ एक एक के बजाय सभी तीन सीरिंज का उपयोग करें ।
    1. 2-3 सिरिंज पंपों के लिए ट्यूबिंग संलग्न करें।
    2. स्प्रे नोजल के लिए सिरिंज पंप 2-3 से ट्यूबिंग संलग्न करें।
    3. तीनों सीरिंज को बफर और सैंपल में अलग-अलग समतुल्य करें। आमतौर पर, सिरिंज 1 नमूना ए से भरा जाता है और सीरिंज 2-3 नमूना बी(चित्रा 3)से भरे होते हैं।
  3. रन सीक्वेंस बदलें। तेजी से मिश्रण प्रयोग के लिए सभी 3 सीरिंज का उपयोग कर एक रन अनुक्रम के लिए एक उदाहरण चित्र 6में दिया गया है । विवरण के लिए अनुभाग 'द रन सीक्वेंस' भी देखें।
  4. अलग-अलग समय में देरी दो तरीकों से हासिल की जा सकती है:
    1. प्लंजर गति बदलें। प्लंजर गति को समायोजित करके, समय में देरी को अपेक्षाकृत संकीर्ण सीमा में बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, 2 सेमी की स्प्रे/एथेन दूरी के साथ, प्लंजर को क्रमशः 20 एमएस या 10 एमएस की समय देरी देने के लिए 1 मीटर या 2 मीटर पर ले जाया जा सकता है । यह चरण 1.15 में वर्णित किया गया है।
    2. स्प्रे नोजल की (ऊर्ध्वाधर) स्थिति को समायोजित करके स्प्रे/एथेन की स्थिति बदलें। यदि नोजल एथेन सतह से 5 सेमी की दूरी पर तैनात है, उदाहरण के लिए, 1 मीटर की डुबकी की गति 50 एमएस की समय देरी देती है। काफी लंबे समय में देरी को प्राप्त करने के सेटअप में और संशोधनों की आवश्यकता है ।
      नोट: नोजल के प्रवाह फोकसिंग क्षेत्र में लेमिनार प्रवाह के कारण, हम नोजल के इस हिस्से में महत्वपूर्ण मिश्रण की उम्मीद नहीं करते हैं। इसके बजाय, हम उम्मीद करते हैं कि मिश्रण स्प्रे उत्पादन के दौरान, ग्रिड के रास्ते में बूंदों में और ग्रिड पर फैलने वाली बूंदों के दौरान होता है। ग्रिड तक पहुंचने के लिए स्प्रे बूंदों के लिए उड़ान का समय 1 एमएस (≥ 10 मीटर की बूंद गति और 1 सेमी की नोजल-ग्रिड दूरी के लिए) के ≤ अनुमानित है। इस प्रकार, केवल बूंद लैंडिंग और विट्रीफिकेशन के बीच का समय 'समय देरी' माना जाता है।

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Representative Results

टेड के साथ फास्ट ग्रिड तैयारी
फास्ट ग्रिड तैयारी के लिए एक परीक्षण नमूने के रूप में, हमने 30 एमएम एचईपीई, 150 एमएल एनएसीएल, पीएच 7.5 में 20 माइक्रोन पर घोड़े तिल्ली से एपोफेरिन का उपयोग किया है। 3.5 Å संकल्प पर एक पुनर्निर्माण 690 माइक्रोग्राफ से प्राप्त किया गया था के रूप में रेफरी में वर्णित है15 (चित्रा 7A). डेफोकस रेंज को चुना गया ताकि कच्चे चित्रों(चित्रा 7B)में कणों को आसानी से पहचाना जा सके। 10-40 एमएस के समय देरी के साथ तैयार एक विशिष्ट ग्रिड पतली बर्फ(चित्रा 7C)के पर्याप्त क्षेत्रों को दिखाता है ताकि > 1000 माइक्रोग्राफ के संग्रह के लिए अनुमति दी जा सके। परिणामस्वरूप संकल्प की संभावना बर्फ की मोटाई से सीमित है, विभिन्न ग्रिडों की एक संख्या के टोमोग्राफिक विश्लेषण 96 ± 33 एनएम बर्फकी मोटाई 6से पता चला।

समय-हल क्रायो-ईएम
टेड का उपयोग करके तेजी से मिश्रण और समय-संकल्प प्रदर्शित करने के लिए, हमने एटीपी के साथ एक मॉडल प्रतिक्रिया19के रूप में मिश्रण करके एक्टोमियोसिन कॉम्प्लेक्स के वियोजन का उपयोग किया है। यह विकल्प कच्चे माइक्रोग्राफ और प्रतिक्रिया की अच्छी तरह से समझ में कल्पित गतिज से actomyosin और मुक्त एफ-actin के बीच आसान अंतर पर आधारित था ।

निम्नलिखित में, एटीपी द्वारा एक्टोमायोसिन कॉम्प्लेक्स के विघटन के टीआरईएम के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। 19रेफरी में विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रियाएं और परिणाम प्रदान किए जाते हैं । संक्षेप में, एफ-ऐक्टिन और खरगोश कंकाल मायोसिन एस1 को 10 एमएम एमओपीएस, 50 एमएम केएसी, 2 एमएमएम एमजीसीएल2,0.1 एमएम ईजीटीए, पीएच 7 में 40 माइक्रोन की अंतिम मोनोमर सांद्रता में मिलाया गया ताकि एक्टोमायोसिन (एएम) परिसर तैयार किया जा सके। AM कॉम्प्लेक्स में भरी हुई थी सिरिंज 1 और 200 माइक्रोनएम एमजीएटीपी में एक ही बफर में सीरिंज 2 और 3 में लोड किया गया था। तैयार किए गए दो अलग-अलग टाइमपॉइंट्स के लिए प्रमुख प्रायोगिक पैरामीटर तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।

दोनों टाइमपॉइंट्स के लिए, परिणाम एएम कॉम्प्लेक्स और एमजीएटीपी का 1:1 v/v मिश्रण था, जो 20 माइक्रोएम एएम कॉम्प्लेक्स और 100 माइक्रोन एम एमजीएटीपी की अंतिम सांद्रता दे रहा था। ठंड के समय में मिश्रण की गणना 7 और 13 एमएस के रूप में तालिका 1में दिखाया गया था । नोजल और ग्रिड के बीच स्प्रे बूंदों के लिए उड़ान का अनुमानित समय 1 एमएस < था।

प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक छोटा क्रायो-ईएम डेटासेट (306 और 123 माइक्रोग्राफ) का अधिग्रहण किया गया था और मानक पेचिक प्रसंस्करण प्रक्रियाओं का उपयोग करके संसाधित संयुक्त डेटा20। परिणामस्वरूप आम सहमति पुनर्निर्माण (दोनों समय बिंदु संयुक्त) चित्रा 8Aमें दिखाया गया है । संयुक्त डेटा तो केंद्रित वर्गीकरण के अधीन किया गया था और एक AM-परिसर और एक एफ actin वर्ग(चित्रा 8B,सी)में विभाजित । फिर, प्रत्येक समय बिंदु के लिए एएम-कॉम्प्लेक्स या एफ-ऐक्टिन कणों के अंश की गणना की गई थी और इसे चित्र 8 डीमें दिखाया गया है।

एएम-कॉम्प्लेक्स वियोजन के लिए स्थिर दूसरा आदेश दर 1.5 · 106 एम-1 एस-1 21. इस धारणा के तहत कि

Equation 2

एकीकृत दर कानून का अनुमान लगाया जा सकता है:

Equation 3

जहां [AM-जटिल] AM-जटिल का समय-निर्भर एकाग्रता है, [AM-जटिल]0 प्रारंभिक एकाग्रता है, कश्मीर दूसरा आदेश दर स्थिर है और [एटीपी]0 (प्रारंभिक) एटीपी एकाग्रता है ।

इस समीकरण का उपयोग करते हुए, एएम-कॉम्प्लेक्स वियोजन की काइनेटिक्स मॉडलिंग की गई। मॉडल प्रयोगात्मक TrEM डेटा के साथ काफी अच्छी तरह से सहमत हैं । चित्रा 8 डीमें दिखाया गया है कि प्रति-माइक्रोग्राफ भिन्नता महत्वपूर्ण है।

Figure 1
चित्रा 1:समय-हल ईएम डिवाइस (टेड) (ए)टेड का अवलोकन। (ख)पंपों के साथ लिक्विड हैंडलिंग यूनिट 1-3 । इस काम में बाईं ओर के चौथे पंप का उपयोग नहीं किया जाता है। लोड और डिस्पेंस पोजिशन वाल्व 1 के लिए इंगित किए जाते हैं, जैसा कि नमूना जलाशय ('नमूना 1') है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:वायवीय प्लंजर और रैखिक शक्तिशाली। (ए)महत्वपूर्ण घटकों के साथ टेड के वायवीय प्लंजर का विवरण। (ख)टेड की वायवीय प्रणाली का योजनाबद्ध। संख्या एन 2 सिलेंडर(1), मुख्य दबाव नियामक (2), स्प्रे नोजल (3), सोनालिका वाल्व (4), डुबकी गति नियामक (5) और दोहरी रॉड वायवीय सिलेंडर (6) के अनुरूप है । (ग)शक्तिशाली के लिए सर्किट की योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:मिश्रण और छिड़काव के लिए गैस-गतिशील आभासी नोजल। (A)4 इनलेट ट्यूबों के साथ एक नोजल, नमूनों (ए और बी) और एन2 गैस को आपूर्ति करने के लिए । (ख)पीडीएमएस स्प्रे नोजल के केंद्रीय खंड की योजनाबद्ध डबल फ्लो फोकसिंग ज्यामिति के साथ प्रवाह फोकसिंग (डाउनस्ट्रीम मिक्सिंग के लिए) और गैस फोकसिंग या एटमाइजेशन को प्राप्त करने के लिए । नमूना बी पीले और नमूना ए में बैंगनी रंग में दिखाया गया है। (ग)माइक्रोफ्लुइडिक नोजल के मिश्रण और परमाणु वर्गों की सूक्ष्म छवि। रेफरी से छवि15। स्केल बार 100 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:एक्रेलिक ग्लास बॉक्स में ग्रिड और स्प्रे का पर्यावरण नियंत्रण। (ए)सामने से देखें और(बी)टेड के किनारे से । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:रन अनुक्रम। (A)एक उदाहरण रन अनुक्रम शीर्ष पर चर दिखाता है और नीचे की कमानों का अनुक्रम । कुछ प्रमुख आदेश लाल रंग में एनोटेट किए जाते हैं। (ख)एक काले ठोस रेखा के रूप में दिखाए गए 'रन अनुक्रम' के समय के दौरान ग्रिड की स्थिति। ग्रिड की शुरुआत की स्थिति 0 सेमी पर है। स्प्रे 2 एस के लिए टी = 0 एस पर शुरू किया जाता है, स्प्रे और तरल इथेन के बीच की दूरी ~ 2 सेमी है। 1.5 एस पर, ग्रिड स्प्रे के माध्यम से और तरल इथेन में 2 मीटर के साथ आगे बढ़ना शुरू होता है। 2 एस के बाद स्प्रे बंद हो जाता है के रूप में अनुक्रम समाप्त होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:उदाहरण के लिए एक तेजी से मिश्रण प्रयोग के लिए अनुक्रम चलाते हैं । चित्रा 5 ए के लिए महत्वपूर्ण अंतर लाल रंग में एनोटेट किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:एक साधारण स्प्रे प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम। (A)3.5 Å एक ग्रिड से घोड़े एपोफेरिटिन का पुनर्निर्माण छिड़काव और विट्रीफिकेशन (ईएमडी-10533) के बीच 36 एमएस में तैयार किया गया। (ख)एक ही एपोफेरिन सैंपल की कच्ची छवि। (ग)ग्रिड का कम आवर्धन दृश्य, पतली बर्फ युक्त एक अनुकरणीय ग्रिड-स्क्वायर को धराशायी नीले आयत द्वारा हाइलाइट किया जाता है, इस ग्रिड-स्क्वायर के भीतर पतली बर्फ का क्षेत्र नीले तीर द्वारा इंगित किया जाता है। मोटी बर्फ या संदूषण के क्षेत्रों को तारक के साथ इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8:एक मिश्रण प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम । (A)एक उच्च सीमा (रंगीन) और कम दहलीज (पारदर्शी) पर दिखाए गए AM-परिसर का आम सहमति पुनर्निर्माण । एक मायोसिन-घनत्व को लेबल किया जाता है और एक धराशायी रेखा के साथ हाइलाइट किया जाता है। पुनर्निर्माण दोनों टाइमपॉइंट्स संयुक्त से डेटा से उत्पन्न किया गया था। (ख)एफ-ऐक्टिन क्लास में कोई मायोसिन बाउंड नहीं दिखा । (ग)एएम-कॉम्प्लेक्स क्लास मायोसिन बाउंड (ग्रे में मायोसिन, मुख्य रूप से हल्के लाल ऐक्टिन सबयूनिट से बंधे) दिखा रहा है । (घ)गतिज मॉडल और प्रायोगिक TrEM डेटा के बीच तुलना । दिखाया गया है कि प्रारंभिक एकाग्रता के सापेक्ष एएम-कॉम्प्लेक्स का अंश है। बड़े ठोस काले डॉट्स औसत TrEM डेटा का संकेत देते हैं, छोटे डॉट्स प्रति माइक्रोग्राफ TrEM डेटा दिखाते हैं । बैंगनी धराशायी रेखा गतिज मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फ्लिकेट (μL/s) स्प्रे/इथेन दूरी (सेमी) डुबकी गति (मेसर्स) समय-देरी (एमएस)
सिरिंज 1 सिरिंज 2 सिरिंज 3
(AM) (एटीपी) (एटीपी)
7 एमएस 2.08 1.04 1.04 1.4 2 7
13 एमएस 1.04 0.52 0.52 2 1.6 13

तालिका 1: एटीपी द्वारा एएम कॉम्प्लेक्स वियोजन के टीआरईएम के लिए प्रायोगिक सेटिंग्स

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Discussion

इस काम में प्रोटोकॉल का उपयोग सीधे छिड़काव और टीआरईएम प्रयोगों द्वारा तेजी से ग्रिड तैयार करने के लिए किया जा सकता है। फास्ट ग्रिड तैयारी का उपयोग वायु जल इंटरफेस5के साथ कणों की बातचीत को कम करने के लिए किया जा सकता है। मुख्य सीमाएं ग्रिड पर उपलब्ध नमूना एकाग्रता और बर्फ की मोटाई हैं। इन सीमाओं के भीतर और बशर्ते कि नमूना गुणवत्ता अच्छी हो, प्रोटोकॉल उच्च रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम के लिए उपयुक्त ग्रिड का उत्पादन करता है।

समस्या निवारण
लिक्विड फ्लोरेट और ग्रिड की गति ग्रिड पर जमा तरल की मात्रा निर्धारित करते हैं। ऊपर दिए गए उदाहरण सेटिंग्स (लिक्विड फ्लोरेट 5 माइक्रोन/एस और डुबकी गति 1-2 मीटर/ यदि नोजल को अच्छी तरह से गठबंधन नहीं किया गया था (इसलिए स्प्रे ड्रॉपलेट ग्रिड को याद करते हैं), तो जमे हुए ग्रिड बहुत कम या कोई बूंद नहीं दिखाते हैं।

ग्रिडों के संदूषण को पूरी तरह से टाला नहीं जा सकता है (चित्रा 7Cदेखें) लेकिन तरल इथेन के जोखिम समय को आर्द्र वातावरण में कम करके कम किया जा सकता है। यह जितनी जल्दी हो सके दोहराने ग्रिड तैयार करके हासिल किया जाता है (4 ग्रिड के लिए 20 मिनट ≤)। हम आम तौर पर तरल इथेन को बदलने से पहले 4 ग्रिड तैयार करते हैं।

ग्रिड पर विट्रियस बर्फ (आंशिक रूप से) क्रिस्टलाइज हो सकती है यदि तरल इथेन में प्रारंभिक ठंडा बहुत धीमा है। पिछले अध्ययन22के साथ समझौते में, हम कम डुबकी गति (< ०.५ m/s) क्रिस्टलीय बर्फ की वृद्धि करने के लिए नेतृत्व पाया है । बहुत मोटी बर्फ (≥ 200 एनएम) के क्षेत्र आमतौर पर स्वाभाविक रूप से धीमी ठंडक के कारण क्रिस्टलीय बर्फ दिखाते हैं। यदि ग्रिड तैयारी के बाद किसी भी चरण के दौरान ग्रिड गर्म हो जाता है (तरल इथेन से तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करना, भंडारण में स्थानांतरित करना, आदि)क्रिस्टलीय बर्फ भी हो सकती है।

टेड तैयार ग्रिड के लिए डेटा अधिग्रहण
टेड द्वारा उत्पादित औसत बर्फ की मोटाई एक मानक ब्लॉटिंग सिस्टम पर तैयार "आदर्श" क्रायो-ईएम ग्रिड की तुलना में मोटा है। अधिग्रहण क्षेत्रों के बीच बर्फ की मोटाई भी भिन्न हो सकती है। इसका मतलब यह है कि अधिग्रहण क्षेत्रों के लिए ध्यान से चयनित करने के लिए सबसे पतला संभव बर्फ देने की जरूरत है । डिफोकस रेंज को उच्च विपरीत छवियों को प्राप्त करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। जब बर्फ मोटी होती है और कणों के विपरीत कम होते हैं, तो हम बहुत उच्च डेफोकस मूल्यों (3 - 5 माइक्रोन) का उपयोग करके एक प्रारंभिक पायलट डेटा अधिग्रहण का सुझाव देते हैं। हाल के कार्य से पता चलता है कि ऐसे उच्च डिफोटसमूल्योंका उपयोग करके उच्च संकल्प अभी भी प्राप्त किया जा सकता है ।

पारंपरिक क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के लिए, एक संपूर्ण डेटासेट अक्सर एक ग्रिड से एकत्र किया जाता है। हालांकि, हमने कई छोटे डेटासेट का संग्रह और इन डेटासेट के विलय को उपयोगी पाया है। इस तरह, सीमित माइक्रोस्कोप समय के भीतर कई टाइमपॉइंट दर्ज किए जा सकते हैं और ब्याज के टाइमपॉइंट की पहचान की जा सकती है।

टीआरईएम डेटा का प्रसंस्करण और विश्लेषण
डेटासेट का विलय नियमित रूप से सबसे आम क्रायो-ईएम डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में किया जा सकता है। जैसा कि ऊपर और दूसरों के काम में वर्णित है, अलग-अलग टाइमपॉइंट से डेटासेट का विलय उपयोगी हो सकता है17। यह महत्वपूर्ण है कि कणों को पूरे प्रसंस्करण में अपने मूल सबसेट (टाइमपॉइंट) पर वापस खोजा जा सकता है।

पारंपरिक गतिज माप (उदाहरण के लिए प्रकाश बिखरने या फ्लोरेसेंस का उपयोग करके) ट्राईएम प्रयोगों के लिए एक मूल्यवान अतिरिक्त हो सकता है। जैव रासायनिक मापन से दर स्थिरांक का उपयोग मध्यवर्ती ब्याज की स्थिति के जीवन काल की भविष्यवाणी करने के लिए या TrEM द्वारा मनाए गए काइनेटिक्स की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। रिएक्शन काइनेटिक्स और समय-हल संरचनात्मक अध्ययनों के लिए उनके संबंध के लिए एक बुनियादी परिचय के लिए, रेफरीदेखें।

टीआरईएम और पारंपरिक गतिज प्रयोगों के बीच मतभेदों के कई संभावित कारण हैं। जैसा कि चित्रा 8Dमें दिखाया गया है, टीआरईएम डेटा प्रति माइक्रोग्राफ में महत्वपूर्ण भिन्नताएं दिखा सकता है। हम यह भी ध्यान दें कि प्रारंभिक डेटा दोहराने ग्रिड के बीच सापेक्ष कण संख्या में कम से 5% परिवर्तनशीलता पता चलता है । कण वर्गीकरण (वर्ग असाइनमेंट) अपूर्ण हो सकता है, खासकर यदि राज्य संरचनात्मक रूप से समान हैं या यदि कोई संरचना अत्यधिक लचीली है। कण, और इस प्रकार टीआरईएम व्युत्पन्न गतिज, हवा-पानी इंटरफ़ेस के साथ कण इंटरैक्शन से भी प्रभावित हो सकते हैं क्योंकि ऐसी बातचीत कम हो जाती है लेकिन तेज गति से समाप्त नहीं होती है।

यह काम TrEM के लिए कुछ दिशानिर्देश प्रदान करता है, लेकिन हम ध्यान दें कि यह अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है, और हम भविष्य में और अधिक प्रगति की उम्मीद है । जबकि टीआरईएम प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक प्रयास की आवश्यकता होती है, वे मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों की गतिशीलता में उच्च रिज़ॉल्यूशन अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

हम मौली एस.C Gravett सहायक चर्चा और क्रायो-EM डेटा संग्रह के साथ मदद के लिए ABSL सुविधा कर्मचारियों के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । डेविड पी Klebl लीड्स विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित Astbury केंद्र में वेलकम ट्रस्ट 4 साल के पीएचडी कार्यक्रम पर पीएचडी के छात्र हैं । FEI टाइटन Krios माइक्रोस्कोप लीड्स विश्वविद्यालय (UoL ABSL पुरस्कार) और वेलकम ट्रस्ट (108466/Z/15/Z) द्वारा वित्त पोषित किया गया । इस काम को स्टीफन पी Muench (BB/P026397/1) के लिए एक BBSRC अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (AMR21-236078) और हावर्ड डी व्हाइट और Vitold Galkin से अमेरिका के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (171261) से हावर्ड डी व्हाइट को अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Time resolved device
acrylic glass box USA scientific
digital humidity/temperature controller THE20 digital humidity/temperature controller
dual rod pneumatic cylinder dual rod pneumatic cylinder TN 10x70
FEP tubing Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing
flangeless fittings Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings
flexible reinforced PVC tubing 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing
glass syringes Kloehn 250 µL zero-dead volume
humidifier pump Interpret Aqua Air AP3
liquid ethane container from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
multistage regulator GASARC class 3 multistage regulator
negative pressure tweezers Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers
oscilloscope Hantek 6022BE oscilloscope
PE tubing Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing
power supply Mean Well GSM160A24-R7B
power supply Wanptek KPS305D power supply
PU tubing SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing
regulator Norgren R72G-2GK-RMN
slide potentiometer PS100 slide potentiometer
solenoid valve SMC NVJ314M solenoid valve
syringe drive pumps Kloehn V6 48K model
Reagents & Materials
apoferritin from equine spleen Sigma-Aldrich, A3660
ATP Sigma-Aldrich, A2383
cryo-EM grids Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA Sigma Aldrich E3889
F-actin Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)
glow-discharger Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit
HEPES Sigma-Aldrich, H7006
KAc Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2 Sigma-Aldrich, M8266
MOPS Sigma-Aldrich, M1254
NaCl Sigma-Aldrich, S9888
Skeletal muscle myosin S1 Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)
Ref 1 Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).
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DOWNLOAD MATERIALS LIST

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बायोकेमिस्ट्री अंक 177 क्रायो-ईएम नमूना तैयारी समय-हल
समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी
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Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (177), e62199, doi:10.3791/62199 (2021).

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