Summary
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el uso de un dispositivo de fabricación de cuadrícula rápida tanto para la fabricación rápida de rejillas como para la mezcla y congelación rápidas para realizar experimentos resueltos en el tiempo.
Abstract
El campo de la microscopía crio-electrónica (crio-EM) se está desarrollando rápidamente con nuevo hardware y algoritmos de procesamiento, produciendo estructuras de mayor resolución e información sobre sistemas más desafiantes. La preparación de muestras para crio-EM está experimentando una revolución similar con nuevos enfoques que se están desarrollando para reemplazar los sistemas tradicionales de blotting. Estos incluyen el uso de dispensadores piezoeléctricos, impresión de pines y pulverización directa. Como resultado de estos desarrollos, la velocidad de preparación de la red está pasando de segundos a milisegundos, proporcionando nuevas oportunidades, especialmente en el campo de la crio-EM resuelta en el tiempo, donde las proteínas y los sustratos se pueden mezclar rápidamente antes de la congelación por inmersión, atrapando estados intermedios de corta duración. Aquí describimos, en detalle, un protocolo estándar para hacer cuadrículas en nuestro dispositivo EM interno resuelto en el tiempo, tanto para la preparación de la cuadrícula rápida estándar como para experimentos resueltos en el tiempo. El protocolo requiere un mínimo de aproximadamente 50 μL de muestra a concentraciones de ≥ 2 mg / ml para la preparación de 4 rejillas. El retraso entre la aplicación de la muestra y la congelación puede ser tan bajo como 10 ms. Una limitación es el aumento del espesor del hielo a velocidades más rápidas y en comparación con el método de borrado. Esperamos que este protocolo ayude a otros a diseñar sus propios dispositivos de fabricación de redes y a aquellos interesados en diseñar experimentos resueltos en el tiempo.
Introduction
Fondo
Los recientes desarrollos en crio-microscopía electrónica (cryo-EM) han permitido estudios estructurales de sistemas cada vez más complejos a alta resolución. Con pocas excepciones, tales estudios se han limitado a macromoléculas biológicas en equilibrio1 o reacciones relativamente lentas2. Muchos procesos in vivo ocurren en una escala de tiempo más rápida (milisegundos) y existe un creciente interés en la crio-EM resuelta en el tiempo (TrEM) en estas escalas de tiempo3. Sin embargo, la preparación convencional de muestras crio-EM por el método de borrado es demasiado lenta para TrEM de milisegundos.
El método de borrado tiene otras limitaciones además de la mala resolución del tiempo. Las proteínas y los complejos proteicos pueden sufrir desnaturalización u orientación preferida en las cuadrículas4. Se ha demostrado que la reducción del tiempo de exposición a la interfaz aire-agua durante la preparación de la muestra mitiga la orientación preferida y la desnaturalización deproteínas 5,6. Por lo tanto, la rápida preparación de la rejilla no solo permite trEM de milisegundos, sino que también puede mejorar la calidad de la red.
Actualmente, hay tres enfoques diferentes para la preparación automatizada de la red. El primer enfoque utiliza un alfiler o capilar que contiene una pequeña cantidad de muestra. Después de establecer el contacto entre el líquido y la superficie de la rejilla, la muestra se "escribe" en la rejilla7,8. El proceso de aplicación de muestra es relativamente lento y tarda unos segundos. Un enfoque alternativo utiliza la generación controlada de gotas mediante un dispensador piezoeléctrico y rejillas auto-absorbentes9. Esto permite una dispensación más rápida para congelar los tiempos, pero todavía está limitado por la caída y la velocidad de absorción (que actualmente alcanza los 54 ms). El enfoque más rápido hasta ahora es el enfoque de pulverización directa, en el que la muestra se atomiza en una boquilla de pulverización y las gotas pequeñas (~ 10 - 20 μm) y rápidas (> 5 m / s) se extienden al contacto con la rejilla crio-EM. La muestra pulverizada se puede generar a través de diferentes vías como atomizadores airblast, ondas acústicas superficiales o humidificadores ultrasónicos10,11, 12,13. En nuestra experiencia, el espesor del hielo con el enfoque de pulverización directa es mayor, pero la pulverización directa permite que la dispensación congele los tiempos de congelación < 10 ms.
Este protocolo describe paso a paso cómo se puede utilizar un dispositivo EM (TED) con respuesta al tiempo equipado con una boquilla de pulverización microfluídica para preparar rejillas en una escala de tiempo rápida14,15. El dispositivo se ha utilizado para preparar rejillas con un tiempo de retardo mínimo de 6 ms entre la aplicación de la muestra y la congelación y para mezclar y congelar rápidamente dos muestras. El diseño del TED se basa en una versión anterior16 y es similar a otros dispositivos crio-EM resueltos en el tiempo basados en pulverización17.
En primer lugar, se describen las cuatro partes principales de la configuración de TED. El núcleo del TED es la unidad de manejo de líquidos, que es responsable de la aspiración y dispensación de muestras. Un émbolo neumático mueve la rejilla a través del aerosol hacia el etano líquido. La generación del spray se logra con boquillas de pulverización microfluídica y la congelación se realiza en un recipiente de etano líquido, que se describen brevemente. Por último, se destacan las características adicionales para controlar el entorno de la red, especialmente la humedad. Esto es seguido por protocolos detallados para el funcionamiento del dispositivo y para la realización de experimentos TrEM. Se dan resultados representativos para una rápida preparación de la cuadrícula y un simple experimento TrEM.
Configuración experimental
La unidad de manipulación de líquidos
El sistema de manipulación de líquidos del TED está formado por tres bombas de accionamiento de jeringas («bombas 1 - 3»), cada una equipada con una válvula rotativa (Figura 1). Una fuente de alimentación proporciona bombas 1 - 3 con 24 V DC. La comunicación con el software de control (escrito en Visual Basic y C++) es a través de una interfaz RS232 para bombear 1. Los comandos se distribuyen a través de los puertos de expansión de E/S serie desde la bomba 1 hasta las bombas 2-3. Las bombas 1-3 están equipadas con jeringas de vidrio ('jeringas 1-3', aquí usamos jeringas de volumen muerto de 250 μL/cero). Cada válvula tiene dos posiciones, 'cargar' y 'dispensar'. La posición de "carga" se utiliza para aspirar la muestra en la jeringa. Una pieza corta (~ 3 - 4 cm) de tubo sin bridas ETFE/ETFE de 1/16" O.D., 0.01′′ I.D. se conecta a través de accesorios sin bridas ETFE/ETFE a la posición de "carga" de las válvulas 1-3. Esta pieza corta de tubo llega al depósito de muestra (generalmente un tubo de plástico de 1.5 ml o 0.5 ml). La posición de "dispensación" conduce a la boquilla de pulverización. La conexión entre la salida de "dispensación" y la boquilla de pulverización se realiza mediante tubos de PE (~ 20-30 cm de longitud, 0.043 "O.D., 0.015" I.D.), con una pieza corta de tubo de manga (~ 0.5 cm) y accesorios sin brida ETFE / ETFE.
El émbolo neumático
El TED utiliza un émbolo neumático para acelerar la rejilla y moverla a través del aerosol de muestra hacia el recipiente de etano líquido. Las pinzas de presión negativa sujetan la rejilla, atornilladas en un soporte casero que está montado en un cilindro neumático de doble varilla(Figura 2A).
La presión se suministra desde un gran cilindro de gas nitrógeno (tamaño W), equipado con un regulador multietapa (0 - 10 bar, 'presión principal'). Los tubos flexibles de PVC reforzado (12 mm O.D.) conectan el regulador a un colector de 12 puertos donde se entrega nitrógeno presurizado a la boquilla y al émbolo neumático. El flujo de gas a través de la boquilla es constante, regulado directamente en el cilindro de nitrógeno (presión principal). La conexión a la boquilla se realiza con tubos de PU (4 mm O.D., 2.5 mm I.D.), una pieza corta de tubo de PE (~ 8 cm de longitud, 0.043" O.D., 0.015" I.D.) y conectores apropiados. La presión sobre el émbolo neumático se controla a través de una válvula solenoide. Los tubos de PU (4 mm O.D., 2.5 mm I.D.) conectan la válvula solenoide con un regulador y el émbolo neumático, para permitir una presión de inmersión reducida (≤ presión principal). La válvula solenoide está controlada por computadora. En la figura 2Bse ofrece una descripción general esquemática de la configuración.
Tenga en cuenta que con esta configuración la presión de inmersión es siempre igual o menor que la presión del gas de pulverización (presión principal). Sin embargo, la configuración se puede cambiar fácilmente incorporando un segundo regulador aguas arriba de la boquilla de pulverización para permitir velocidades de inmersión más altas a baja presión de gas de pulverización. Las altas presiones (>> 2 bar) pueden dañar la boquilla de pulverización PDMS.
PRECAUCIÓN: Este es un sistema presurizado y la "presión principal" siempre debe ser de < 7 bar.
Las presiones entre 0,5 y 2 bar se utilizan típicamente para el émbolo neumático y muestran una relación aproximadamente lineal entre la presión y la velocidad (en la posición vertical de la pulverización). Las velocidades de inmersión se miden con un osciloscopio, conectado en línea con un potenciómetro deslizante (10 kΩ) y en paralelo con una resistencia de 2 kΩ(Figura 2C). Una fuente de alimentación proporciona al potenciómetro 9 V DC. Mientras que la velocidad de inmersión aproximada se establece antes del experimento estableciendo la presión de inmersión, el potenciómetro proporciona una lectura precisa de la velocidad después del experimento.
Boquillas de pulverización y recipiente de etano líquido
La fabricación y el funcionamiento de boquillas virtuales dinámicas de gas para la entrega de muestras a base de pulverización se ha descrito en otra parte en detalle15. Como se describió anteriormente, las salidas de "dispensación" de las válvulas 1-3 están conectadas a las entradas de líquido de la boquilla(Figura 3A). El gas de pulverización presurizado está conectado a la entrada de gas de la boquilla. Las entradas en las boquillas de pulverización PDMS son tales que los tubos de PE O.D. de 0.043 "se pueden usar directamente sin la necesidad de accesorios. Nuestro diseño de boquilla contiene una geometría 'jet-in-jet' para la mezcla de dos muestras, similar al dispositivo descrito en la ref.18. Un esquema del diseño se muestra en la Figura 3B,una imagen microscópica de una boquilla se muestra en la Figura 3C. El diseño del dispositivo microfluídico requiere el uso de tres jeringas para mezclar dos muestras. La boquilla de pulverización se coloca típicamente a una distancia de 1-1.5 cm de la rejilla (durante la aplicación de la muestra).
Utilizamos etano líquido como criógeno, en un recipiente líquido de etano / nitrógeno como se utiliza para el método de borrado estándar. El posicionamiento vertical de la copa de etano líquido se logra con una plataforma elevadora de laboratorio.
Control del entorno de pulverización y rejilla
El émbolo y la boquilla de pulverización están contenidos dentro de una caja de PMMA (vidrio acrílico) hecha a medida con una puerta doble(Figura 4A). La alta humedad relativa dentro de la caja se logra mediante un sistema de humidificación de aire en la parte posterior del TED(Figura 4B). El aire es suministrado por una bomba y alimentado a un primer recipiente de 10"(normalmente utilizado para la purificación de agua debajo del fregadero). El recipiente está lleno de un nivel bajo (~ 5-10 cm) de agua y también alberga una unidad humidificadora. La alimentación de red del humidificador está controlada por un controlador digital de humedad / temperatura y un sensor de humedad / temperatura ubicado dentro de la caja de vidrio acrílico. El controlador está configurado para apagar la bomba cuando la humedad relativa alcanza ≥ 90 %. El aire humidificado del primer recipiente se bombea a través de un difusor, se sumerge en agua en un segundo recipiente de 10"y luego entra en la caja de vidrio acrílico.
PRECAUCIÓN: Debido a que la muestra está aerosolizada en la boquilla de pulverización, las muestras biológicas o químicas peligrosas no son adecuadas como muestras.
La secuencia de ejecución
El botón Ejecutar script del software de control inicia la secuencia de ejecución. Esta secuencia de comandos puede ser predefinido en un archivo de script y alterado a través del software. Las variables más importantes se explican aquí:
Velocidad de pulverización: La velocidad de pulverización determina el caudal de líquido utilizado por la bomba de jeringa. El caudal se puede calcular de la siguiente manera: Los motores de la bomba de jeringa utilizados aquí tienen un tamaño de paso fijo. El rango completo de la bomba se divide en 48,000 pasos. El segundo factor importante es el volumen de la jeringa. Normalmente utilizamos jeringas de 250 μL. La velocidad de pulverización en el software de control se establece como número de pasos/segundo. Una velocidad de pulverización de 1000 pasos/segundo corresponde a:
Volumen de pulverización: El volumen de pulverización determina el volumen total a rociar. Por lo tanto, también determina la duración del aerosol. El volumen de pulverización en el software de control se establece como una serie de pasos. Un volumen de pulverización de 2000 pasos, a una velocidad de pulverización de 1000 pasos / segundo, conduce a una duración de pulverización de 2 s y un volumen total de 10,4 μL.
Tiempo de pre-pulverización: Esta variable define el tiempo entre el inicio de la pulverización y la inmersión. Es importante elegir el tiempo de retardo de modo que el spray tenga tiempo suficiente para estabilizarse antes de sumergir la rejilla. Por lo general, el aerosol se administra de 1.5 a 4 s para estabilizarse antes de que la rejilla se hunda. El spray se mantiene hasta que la rejilla se ha movido. Por lo general, el flujo de líquido (y por lo tanto el aerosol) se detiene de 0,5 a 1 s después de que la rejilla se ha hundido. Usando una velocidad de pulverización de 1000 pasos / s y un volumen de pulverización de 2000 pasos, un tiempo típico de pre-pulverización es de 1.5 s, por ejemplo.
Una secuencia ejemplar de comandos se muestra en la Figura 5A,la posición de la cuadrícula a lo largo del tiempo se ilustra en la Figura 5B.
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Protocol
1. Preparación del sistema
Nota : el siguiente protocolo describe cómo preparar cuadrículas de una sola muestra. Por lo general, se preparan un mínimo de 2 rejillas replicadas para cada muestra o condición. Para velocidades de inmersión más rápidas (menos de ~ 20 ms de retraso de tiempo), 3 o 4 rejillas de replicación generalmente están preparadas para tener en cuenta un número reducido de áreas de hielo delgado.
- Diluya la muestra de proteína a la concentración objetivo en el tampón deseado. Por lo general, las concentraciones finales ≥ 2 mg / ml funcionan bien para la preparación de la rejilla con el TED. Tenga en cuenta que la muestra se puede mantener en hielo hasta el paso 10, a partir del paso 10 en adelante, la muestra pasará un tiempo considerable a temperatura ambiente, ya que se tarda aproximadamente 20 minutos en preparar 3-4 rejillas.
- Encienda el TED. Luego encienda la PC de control e inicie el software de control.
- Inicialice todas las bombas de jeringa presionando el botón Inicializar (botón negro inferior) en cada bomba de jeringa.
- Encienda la fuente de alimentación del potenciómetro, configálelo a 9 V e inicie el software de control del osciloscopio.
- Asegúrese de que la válvula reguladora del cilindroN 2esté cerrada. Abra la válvula del cilindro. Luego, abra lentamente la válvula reguladora que establece la presión de salida al valor deseado para la presión del gas de pulverización (generalmente 1-2 bar). Para las boquillas PDMS utilizadas aquí, no use presiones superiores a ~ 2.5 bar para evitar daños en la boquilla. El gas que fluye continuamente evita que el líquido gotea y se acumule en la punta de la boquilla, lo que puede conducir a una pulverización irreproducible.
- Asegúrese de que todas las válvulas de la bomba de jeringa estén en la posición de "carga". Esto se puede hacer cambiando todas las válvulas a la posición de "dispensación" en el software de control y luego de nuevo a "carga". Deje todas las válvulas cambiadas a 'carga'. Ajuste todas las jeringas a cero.
- Elimine las burbujas de aire presentes en el sistema en esta etapa. Para hacer esto, las jeringas pueden tener que ser desenroscados, las burbujas retiradas manualmente y las jeringas montadas de nuevo cuando no contienen más burbujas.
- Los componentes de manejo de líquidos generalmente se almacenan en H2O. Antes de cargar la solución de muestra, equilibre el sistema líquido con tampón lavando el tubo con un exceso de tampón. Use un caudal máximo de líquido apropiado para evitar la sobrepresión en la boquilla de pulverización. Los caudales de líquido > 10 μL/s pueden causar daños en las boquillas PDMS descritas aquí.
- Coloque un tubo de 1,5 ml que contenga ≥ tampón de 200 μL sobre la jeringa 1 (la parte superior debe perforarse para fijarse al tubo).
- Asegúrese de que la válvula 1 esté en posición de "carga". Cambie el software de control, si es necesario.
- Aspire la cantidad deseada (típicamente 50-100 μL) de tampón con la jeringa 1, a través del software de control.
- Cambie la válvula 1 a la posición de 'dispensación', a través del software de control.
- Dispense todo el líquido en la jeringa 1, a través del software de control.
- Vuelva a 'cargar' la válvula, restablezca la posición de la jeringa a '0' en el programa y presione inicializar en la jeringa 1, para preparar el sistema para el siguiente ciclo.
NOTA: Los pasos 1.9.1 - 1.9.5 generalmente se repiten tres veces para garantizar un lavado completo del tubo.
- Cargue las pinzas con una rejilla EM (sin requisito para ningún tipo específico) aflojando la abrazadera del brazo de hundimiento, colocando las pinzas en la abrazadera y apretando la abrazadera.
- Mueva manualmente el brazo de inmersión para que la rejilla y la boquilla estén a la misma altura (la posición de "aplicación de muestra"). Si la boquilla y la rejilla están alineadas, el líquido se acumulará en la rejilla después de la pulverización durante un período prolongado. Si es necesario, ajuste la posición de la boquilla.
- Ajuste la posición de la copa de etano líquido moviendo manualmente el brazo de inmersión con pinzas montadas a su posición final (llegando a la copa de etano). Cuando se configura correctamente, una rejilla sostenida por las pinzas alcanzará aproximadamente el centro de la copa de etano líquido.
- Compruebe que el 'script de ejecución' utilizará los caudales, volúmenes y tiempos deseados. Consulte la sección "La secuencia de ejecución" anterior para obtener más detalles.
- Asegúrese de que nada obstruya el camino del émbolo. Aspire el volumen de tampón requerido para una sola tirada en la jeringa 1. Esto se hace en el software de control, consulte la sección 'La secuencia de ejecución' para la configuración y los volúmenes típicos. Luego, asegúrese de que la válvula 1 esté cambiada a la posición de "dispensación". Realice una ejecución de prueba presionando Ejecutar script en el software de control.
PRECAUCIÓN: Manténgase alejado del TED hasta que finalice la secuencia de ejecución. ¡Las partes móviles podrían causar lesiones! - Cuando termine la "secuencia de ejecución", ajuste la presión sobre el brazo de inmersión al valor deseado (generalmente 1-2 bar). Solo entonces presione OK en el software de control para liberar la presión del brazo que se hunde. Si es necesario ajustar la "secuencia de carrera" o la presión sobre el brazo de inmersión, estos ajustes pueden cambiarse en esta etapa y repetirse los pasos 1.13 a 1.15.
2. Preparación rápida de la rejilla
- Llene primero el recipiente líquido de etano/nitrógeno con nitrógeno líquido. Cuando esté lo suficientemente frío y libre de nitrógeno líquido, llene la taza con etano líquido. Evite la solidificación del etano líquido. Este paso es el mismo que para la preparación de la rejilla convencional.
NOTA: Para minimizar la contaminación por etano, asegúrese de que los pasos 2.2 a 2.13 se realicen lo más rápido posible
PRECAUCIÓN: El etano líquido es un criógeno e inflamable. Se debe tener cuidado al manipular. - Prepare rejillas crio-EM para la descarga de resplandor. Por lo general, utilizamos rejillas de carbono perforadas y descarga de resplandor durante 90 s, a una presión de aire de 0,1 mbar y 10 mA. Por lo general, no se descargan más de 4 rejillas de resplandor a la vez. Las rejillas se utilizan dentro de los 30 minutos posteriores a la descarga de resplandor.
- Equilibre el tubo con la muestra (siguiendo los pasos 1.9.1 a 1.9.5, utilizando la muestra en lugar del búfer). Si el volumen de muestra disponible es bajo, el tubo puede equilibrarse con solo 1 volumen muerto.
- Aspire la cantidad de muestra que se necesita para una sola ejecución en la jeringa 1 en el software de control (consulte la sección "La secuencia de ejecución" para obtener más información). A continuación, cambie la válvula 1 a la posición de "dispensación".
- Compruebe que la humedad relativa ha alcanzado el valor deseado (normalmente preparamos rejillas al 60 % de humedad relativa o superior). Una vez que se alcance ≥ 60 % de humedad, abra la cámara de humedad solo por un período de tiempo mínimo, para mantener una humedad alta.
- Coloque las pinzas, sosteniendo una rejilla de descarga brillante, en el émbolo neumático y colóquelas. Mueva el émbolo a su posición inicial (en la parte superior).
- Asegúrese de que el control deslizante del potenciómetro esté en la posición de inicio, listo para la medición, moviéndolo manualmente para contactar con el émbolo. Configure el disparador en el osciloscopio en el software del osciloscopio.
- Coloque el recipiente líquido de etano/nitrógeno.
- Presione Ejecutar script en el software de control. Cuando se le solicite, haga clic en Aceptar en el software de control para iniciar la ejecución.
PRECAUCIÓN: Manténgase alejado del TED hasta que finalice la secuencia de ejecución. ¡Las partes móviles podrían causar lesiones! - Una vez completada la 'secuencia de ejecución', suelte la presión sobre el émbolo neumático haciendo clic en Aceptar en el software de control.
- Abra la cámara de humedad, afloje la conexión entre el brazo de inmersión y las pinzas con una mano mientras asegura las pinzas con la otra. Cuando las pinzas estén libres, mueva el brazo hundido hacia arriba mientras mantiene la rejilla en el etano líquido. A continuación, transfiera la rejilla a su espacio de almacenamiento en el líquido circundante N2. Después de la congelación, la rejilla debe mantenerse a temperatura líquida N2 en todo momento.
- Guarde la medición del osciloscopio. Restablezca manualmente la posición del control deslizante y el émbolo del potenciómetro después.
- Repita los pasos 2.4 a 2.12 para preparar cuadrículas de réplica
- Transfiera las cuadrículas al almacenamiento a largo plazo hasta el recorte de la cuadrícula y la recopilación de datos.
- Lave el sistema con búfer, de acuerdo con los pasos 1.9.1 - 1.9.5. Luego lave el sistema con H2O, de acuerdo con los pasos 1.9.1 - 1.9.5.
- Apague el regulador principal de gas nitrógeno y apague la alimentación.
- Coloque el recipiente de etano/nitrógeno en una campana extractora de humos para dejar que se caliente y deje que el etano líquido y el N2 se evaporen.
3. Crio-EM resuelto en el tiempo
NOTA: Cuando se realizan experimentos resueltos en el tiempo con el TED, hay aspectos adicionales a considerar, aunque la configuración básica y las variables siguen siendo las mismas. Se supone aquí que dos soluciones se mezclan en una proporción de 1:1 (v/v) para producir la mezcla final que se deposita en la rejilla. Siga el protocolo descrito en '1. Preparación rápida de la parrilla con el TED', con los siguientes cambios:
- Use concentraciones de stock más altas para los experimentos de mezcla que para los experimentos de pulverización simples. La mezcla en una proporción de 1: 1 (v / v) dará como resultado una dilución de 2x de cada componente.
- Para un experimento de mezcla rápida, use las tres jeringas en lugar de una sola.
- Conecte los tubos a las bombas de jeringa 2-3.
- Conecte los tubos de las bombas de jeringa 2-3 a la boquilla de pulverización.
- Equilibre las tres jeringas en tampón y muestree por separado. Por lo general, la jeringa 1 se llena con la muestra A y las jeringas 2-3 se llenan con la muestra B(Figura 3).
- Cambie la secuencia de ejecución. Un ejemplo para una secuencia de ejecución utilizando las 3 jeringas para un experimento de mezcla rápida se da en la Figura 6. Consulte también la sección "La secuencia de ejecución" para obtener más información.
- Se pueden lograr diferentes retrasos de tiempo de dos maneras:
- Cambie la velocidad del émbolo. Al ajustar la velocidad del émbolo, el retardo de tiempo se puede cambiar en un rango relativamente estrecho. Por ejemplo, con una distancia de pulverización/etano de 2 cm, el émbolo se puede mover a 1 m/s o 2 m/s para dar un retardo de tiempo de 20 ms o 10 ms, respectivamente. Esto se hace como se describe en el paso 1.15.
- Cambie la posición de pulverización/etano ajustando la posición (vertical) de la boquilla de pulverización. Si la boquilla se coloca a una distancia de 5 cm de la superficie de etano, por ejemplo, una velocidad de inmersión de 1 m / s da un retraso de tiempo de 50 ms. Lograr retrasos de tiempo significativamente más largos requiere más modificaciones en la configuración.
NOTA: Debido al flujo laminar en la región de enfoque de flujo de la boquilla, no esperamos una mezcla significativa en esta parte de la boquilla. En cambio, esperamos que la mezcla ocurra durante la generación de pulverización, en gotas en ruta a la rejilla y durante la propagación de gotas en la rejilla. El tiempo de vuelo para que las gotas de pulverización alcancen la rejilla se estima ≤ 1 ms (para una velocidad de gotas de ≥ 10 m / s y una distancia de boquilla-rejilla de 1 cm). Por lo tanto, solo el tiempo entre el aterrizaje de gotas y la vitrificación se considera el "retraso de tiempo".
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Representative Results
Preparación rápida de la rejilla con el TED
Como muestra de prueba para la preparación rápida de la rejilla, hemos utilizado apoferritina del bazo equino a 20 μM en 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5. Se obtuvo una reconstrucción a una resolución de 3,5 Å a partir de 690 micrografías como se describe en la ref.15 (Figura 7A). Se eligió el rango de desenfoque para que las partículas puedan identificarse fácilmente en las imágenes en bruto(Figura 7B). Una cuadrícula típica preparada con un retardo de tiempo de 10-40 ms muestra suficientes áreas de hielo delgado(Figura 7C)para permitir la recolección de > 1000 micrografías. La resolución resultante probablemente esté limitada por el espesor del hielo, el análisis tomográfico de varias rejillas diferentes mostró un espesor de hielo de 96 ± 33 nm6.
Crio-EM resuelto en el tiempo
Con el fin de demostrar una mezcla rápida y una resolución de tiempo utilizando el TED, hemos utilizado la disociación del complejo actomiosina mezclándolo con ATP como reacción modelo19. Esta elección se basó en la fácil distinción entre actomiosina y F-actina libre de micrografías crudas y la cinética bien entendida de la reacción.
A continuación, se muestran los resultados representativos para TrEM de disociación del complejo actomiosina por ATP. Los procedimientos experimentales detallados y los resultados se proporcionan en la ref.19. En resumen, la F-actina y la miosina esquelética de conejo S1 se mezclaron en 10 mM MOPS, 50 mM KAc, 2 mM MgCl2,0,1 mM EGTA, pH 7 a concentraciones finales de monómero de 40 μM para preparar el complejo actomiosina (AM). El complejo AM se cargó en la jeringa 1 y 200 μM MgATP en el mismo tampón se cargó en las jeringas 2 y 3. Los parámetros experimentales clave para los dos puntos de tiempo diferentes preparados se enumeran en la Tabla 1.
Para ambos puntos de tiempo, el resultado fue una mezcla de 1:1 v/v de complejo AM y MgATP, dando concentraciones finales de 20 μM de complejo AM y 100 μM MgATP. Los tiempos calculados de mezcla a congelación fueron de 7 y 13 ms como se muestra en la Tabla 1. El tiempo estimado de vuelo para las gotas de pulverización entre la boquilla y la rejilla fue de < 1 ms.
Se adquirió un pequeño conjunto de datos crio-EM (306 y 123 micrografías) para cada punto de tiempo y los datos combinados procesados utilizando procedimientos estándar de procesamiento helicoidal20. La reconstrucción consensuada resultante (ambos puntos de tiempo combinados) se muestra en la Figura 8A. Los datos combinados se sometieron a una clasificación enfocada y se dividieron en un complejo AM y una clase de actina F(Figura 8B,C). Luego, se calculó la fracción de partículas del complejo AM o F-actina para cada punto de tiempo y se muestra en la Figura 8D.
La constante de tasa de segundo orden para la disociación del complejo AM es 1.5 · 106 M-1 s-1 21. Bajo el supuesto de que
la ley de tasas integradas puede aproximarse a:
Donde [COMPLEJO AM] es la concentración dependiente del tiempo del complejo AM, [complejo AM]0 es la concentración inicial, k es la constante de tasa de segundo orden y [ATP]0 es la concentración (inicial) de ATP.
Usando esta ecuación, se modeló la cinética de la disociación del complejo AM. El modelo concueerda razonablemente bien con los datos experimentales de TrEM. Hay una variación significativa por micrografía como se muestra en la Figura 8D.
Figura 1: El dispositivo EM resuelto en el tiempo (TED). (A) Descripción general del TED. (B) La unidad de manipulación de líquidos con bombas 1-3. La cuarta bomba de la izquierda no se utiliza en este trabajo. Las posiciones de carga y dispensación están indicadas para la válvula 1, al igual que el depósito de muestra («muestra 1»). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Émbolo neumático y potenciómetro lineal. (A) Detalles del émbolo neumático del TED con componentes importantes etiquetados. (B) Esquema del sistema neumático del TED. Los números corresponden al cilindroN 2 (1), el regulador de presión principal (2), la boquilla de pulverización (3), la válvula solenoide (4), el regulador de velocidad de inmersión (5) y el cilindro neumático de doble varilla (6). (C) Esquema del circuito para el potenciómetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Boquillas virtuales gasodinás dinámicas para mezclar y pulverizar. (A) Una boquilla con 4 tubos de entrada conectados, para suministrar a las muestras (A y B) y gas N2. (B) Esquema de la sección central de las boquillas de pulverización PDMS con geometría de enfoque de doble flujo para lograr el enfoque de flujo (para mezcla aguas abajo) y el enfoque o atomización de gas. La muestra B se muestra en amarillo y la muestra A en púrpura. (C) Imagen microscópica de las secciones de mezcla y atomización de la boquilla microfluídica. Imagen de la ref.15. Barra de escala 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Control ambiental de la rejilla y el spray en la caja devidrio acrílico. (A) Vista desde el frente y (B) desde el lado del TED. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La secuencia de ejecución. (A) Una secuencia de ejecución de ejemplo que muestra las variables en la parte superior y la secuencia de comandos en la parte inferior. Algunos de los comandos clave están anotados en rojo. (B) Posición de la cuadrícula a lo largo del curso temporal de una «secuencia de ejecución» que se muestra como una línea sólida negra. La posición de inicio de la rejilla es de 0 cm. La pulverización se inicia a t = 0 s durante 2 s, la distancia entre la pulverización y el etano líquido es de ~ 2 cm. A 1,5 s, la rejilla comienza a moverse con 2 m/s, a través de la pulverización y en el etano líquido. La secuencia termina cuando el spray se detiene después de 2 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ejemplo de secuencia de ejecución para un experimento de mezcla rápida. Las diferencias importantes con la Figura 5 A están anotadas en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Resultados representativos de un experimento de pulverización simple. (A) 3.5 Å reconstrucción de apoferritina equina a partir de una rejilla preparada en 36 ms entre pulverización y vitrificación (EMD- 10533). (B) Imagen en bruto de la misma muestra de apoferritina. (C) Vista de bajo aumento de la cuadrícula, un cuadrado de cuadrícula ejemplar que contiene hielo delgado está resaltado por el rectángulo azul discontinuo, el área de hielo delgado dentro de este cuadrado de cuadrícula se indica con la flecha azul. Las áreas de hielo grueso o contaminación se indican con asteriscos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Resultados representativos de un experimento de mezcla. (A) Reconstrucción consensuada del complejo AM mostrado en un umbral alto (coloreado) y bajo umbral (transparente). Una densidad de miosina está etiquetada y resaltada con una línea discontinua. La reconstrucción se generó a partir de datos de ambos puntos de tiempo combinados. (B) Clase de F-actina que no muestra unida a miosina. (C) Clase del complejo AM que muestra unida a la miosina (miosina en gris, unida principalmente a la subunidad de actina roja clara). (D) Comparación entre el modelo cinético y los datos experimentales de TrEM. Se muestra la fracción de complejo AM en relación con la concentración inicial. Los puntos negros sólidos grandes indican datos TrEM promediados, los puntos pequeños muestran datos TrEM por micrografía. La línea discontinua púrpura representa el modelo cinético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| caudal (μL/s) | distancia de pulverización/etano (cm) | velocidad de inmersión (m/s) | retardo de tiempo (ms) | |||
| jeringa 1 | jeringa 2 | jeringa 3 | ||||
| (AM) | (ATP) | (ATP) | ||||
| 7 ms | 2.08 | 1.04 | 1.04 | 1.4 | 2 | 7 |
| 13 ms | 1.04 | 0.52 | 0.52 | 2 | 1.6 | 13 |
Tabla 1: Ajustes experimentales para TrEM de disociación compleja AM por ATP
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Discussion
Los protocolos en este trabajo se pueden utilizar para la preparación rápida de la rejilla mediante pulverización directa y experimentos TrEM. La preparación rápida de la rejilla se puede utilizar para reducir las interacciones de partículas con la interfaz aire-agua5. Las principales limitaciones son la concentración de muestra disponible y el espesor del hielo en la rejilla. Dentro de estos límites y siempre que la calidad de la muestra sea buena, el protocolo produce rejillas adecuadas para crio-EM de alta resolución.
Solución de problemas
El caudal de líquido y la velocidad de la red determinan la cantidad de líquido depositado en la red. Con los ajustes de ejemplo dados anteriormente (caudal de líquido 5 μL/ s y velocidad de inmersión 1-2 m / s), se espera una buena cobertura de la red con gotas. Si la boquilla no estaba bien alineada (por lo que las gotas de pulverización pierden la rejilla), las rejillas congeladas muestran muy pocas o ninguna gota.
La contaminación de las rejillas no se puede evitar por completo (véase la Figura 7C),pero se puede reducir minimizando el tiempo de exposición del etano líquido a un ambiente húmedo. Esto se logra preparando rejillas replicadas lo más rápido posible (≤ 20 min para 4 rejillas). Por lo general, preparamos 4 rejillas antes de reemplazar el etano líquido.
El hielo vítreo en las rejillas puede cristalizar (parcialmente) si el enfriamiento inicial en el etano líquido es demasiado lento. De acuerdo con un estudio previo22,hemos encontrado que las bajas velocidades de inmersión (< 0,5 m / s) conducen a un aumento del hielo cristalino. Las áreas de hielo muy grueso (≥ 200 nm) generalmente muestran hielo cristalino debido a un enfriamiento inherentemente más lento. Si la rejilla se calienta durante cualquiera de los pasos posteriores a la preparación de la rejilla (transferencia de etano líquido a nitrógeno líquido, transferencia al almacenamiento, etc.),también puede ocurrir hielo cristalino.
Adquisición de datos para redes preparadas por TED
El espesor promedio de hielo producido por el TED es más grueso que la rejilla crio-EM "ideal" preparada en un sistema de borrado estándar. El espesor del hielo también puede variar entre las áreas de adquisición. Esto significa que las áreas de adquisición deben seleccionarse cuidadosamente para dar el hielo más delgado posible. Es posible que sea necesario ajustar el rango de desenfoque para obtener imágenes de alto contraste. Cuando el hielo es grueso y las partículas tienen bajo contraste, sugerimos una adquisición inicial de datos piloto utilizando valores de desenfoque muy altos (3 - 5 μm). Trabajos recientes sugieren que todavía se puede lograr una alta resolución utilizando valores de desenfoque tan altos23.
Para la recopilación de datos crio-EM convencionales, a menudo se recopila un conjunto de datos completo de una sola cuadrícula. Sin embargo, hemos encontrado útil la recopilación de múltiples conjuntos de datos pequeños y la fusión de estos conjuntos de datos. De esta manera, se pueden registrar múltiples puntos de tiempo dentro de un tiempo limitado del microscopio y se pueden identificar puntos de tiempo de interés.
Tratamiento y análisis de datos TrEM
La fusión de conjuntos de datos se puede realizar de forma rutinaria en el software de procesamiento de datos cryo-EM más común. Como se describió anteriormente y en el trabajo de otros, la fusión de conjuntos de datos desde puntos de tiempo separados puede ser útil17. Es importante que las partículas se puedan rastrear hasta su subconjunto original (punto de tiempo) a lo largo del procesamiento.
Las mediciones cinéticas convencionales (por ejemplo, utilizando dispersión de luz o fluorescencia) pueden ser una valiosa adición a los experimentos trEM. Las constantes de tasa de las mediciones bioquímicas se pueden utilizar para predecir la vida útil del estado intermedio de interés, o para confirmar la cinética observada por TrEM. Para una introducción básica a la cinética de reacción y su relación con los estudios estructurales resueltos en el tiempo, véase la ref.24.
Hay una serie de posibles razones para las diferencias entre TrEM y los experimentos cinéticos convencionales. Como se muestra en la Figura 8D,los datos de TrEM pueden mostrar variaciones significativas por micrografía. También observamos que los datos preliminares sugieren al menos un 5% de variabilidad en el número relativo de partículas entre las cuadrículas replicadas. La clasificación de partículas (asignación de clases) podría ser imperfecta, particularmente si los estados son estructuralmente similares o si una estructura es altamente flexible. Las partículas, y por lo tanto la cinética derivada de TrEM, también podrían verse influenciadas por las interacciones de las partículas con la interfaz aire-agua porque tales interacciones se reducen pero no se eliminan a velocidades rápidas.
Este trabajo proporciona algunas pautas para TrEM, pero observamos que esta es un área activa de investigación, y esperamos más avances en el futuro. Si bien los experimentos TrEM requieren un esfuerzo experimental significativo, pueden ofrecer información de alta resolución sobre la dinámica de los complejos macromoleculares.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Molly S.C. Gravett por las útiles discusiones y al personal de las instalaciones de ABSL por su ayuda con la recopilación de datos de crio-EM. David P. Klebl es un estudiante de doctorado en el programa de doctorado de 4 años de Wellcome Trust en The Astbury Centre financiado por la Universidad de Leeds. Los microscopios FEI Titan Krios fueron financiados por la Universidad de Leeds (premio UoL ABSL) y Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Este trabajo fue financiado por una subvención de BBSRC a Stephen P. Muench (BB / P026397 / 1) y apoyado por subvenciones de investigación a Howard D. White de la Asociación Americana del Corazón (AMR21-236078) y Howard D. White y Vitold Galkin de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (171261).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10x70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
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