Summary
Her leverer vi en detaljeret protokol til brug af en hurtig gitterfremstillingsenhed til både hurtig netfremstilling og til hurtig blanding og frysning for at udføre tidsfor løste eksperimenter.
Abstract
Feltet kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er i rivende udvikling med nye hardware- og behandlingsalgoritmer, der producerer strukturer med højere opløsning og information om mere udfordrende systemer. Prøveforberedelse til cryo-EM gennemgår en lignende revolution med nye tilgange, der udvikles for at erstatte de traditionelle blotting-systemer. Disse omfatter brug af piezo-elektriske dispensere, pin udskrivning og direkte sprøjtning. Som følge af denne udvikling går hastigheden af netforberedelse fra sekunder til millisekunder, hvilket giver nye muligheder, især inden for tidsforberedt kryo-EM, hvor proteiner og substrater hurtigt kan blandes før dykfrysning, fældefangst kortvarige mellemtilstande. Her beskriver vi i detaljer en standardprotokol til fremstilling af gitre på vores interne tidsforberedte EM-enhed både til standard hurtig gitterforberedelse og også til tidsforberedte eksperimenter. Protokollen kræver mindst ca. 50 μL-prøver i koncentrationer på ≥ 2 mg/mL til fremstilling af 4 gitre. Forsinkelsen mellem prøveudbringning og frysning kan være helt ned til 10 ms. En begrænsning er øget istykkelse ved hurtigere hastigheder og sammenlignet med blotting-metoden. Vi håber, at denne protokol vil hjælpe andre med at designe deres egne net gør enheder og dem interesseret i at designe tid-løst eksperimenter.
Introduction
Baggrund
Den seneste udvikling inden for kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har muliggjort strukturelle undersøgelser af stadig mere komplekse systemer med høj opløsning. Med få undtagelser har sådanne undersøgelser været begrænset til biologiske makromolekyler ved ligevægt1 eller relativt langsomme reaktioner2. Mange processer in vivo forekommer på en hurtigere tidshorisont (millisekunder), og der er stigende interesse for tid løst cryo-EM (TrEM) på disse tidshorisonter3. Det konventionelle kryo-EM-prøvepræparat ved blottingmetoden er imidlertid for langsomt til millisekunder TrEM.
Den blotting metode har andre begrænsninger end dårlig tid opløsning. Proteiner og proteinkomplekser kan lide af denaturering eller foretrukken orientering på gitre4. Det har vist sig at nedsætte eksponeringstiden for luft-vand-grænsefladen under prøveforberedelsen for at afbøde foretrukken orientering og proteindenaturering5,6. Således muliggør hurtig netforberedelse ikke kun millisekunder TrEM, men kan også forbedre gitterkvaliteten.
I øjeblikket er der tre forskellige tilgange til automatiseret gitterforberedelse. Den første tilgang bruger en pin eller kapillær, der holder en lille mængde prøve. Efter at have etableret kontakt mellem væsken og gitteroverfladen 'skrives' på gitteret7,8. Prøveansøgningsprocessen er relativt langsom og tager et par sekunder. En alternativ tilgang bruger kontrolleret dråbe generation af en piezo dispenser og selvtransporterende gitre9. Dette gør det muligt hurtigere dispensere at fryse gange, men er stadig begrænset af dråbe og wicking hastighed (i øjeblikket nå 54 ms). Den hidtil hurtigste tilgang er den direkte spraytilgang, hvor prøven forstøves i en sprøjtedyse og de små (~ 10 - 20 μm) og hurtige (> 5 m/s) dråber spredt ved kontakt med kryo-EM-gitteret. Prøvesprayen kan genereres på forskellige måder, såsom airblastforstøvere, overfladeakustiske bølger eller ultralydsfugtere10,11,12,13. Det er vores erfaring, at istykkelsen med den direkte sprøjtemetode er større, men direkte sprøjtning gør det muligt for dispenseren at fryse gange < 10 ms.
I denne protokol beskrives trin for trin, hvordan en tidstilsluttet EM-enhed (TED), der er udstyret med en mikrofluidisk sprøjtedyse, kan bruges til at forberede gitre på en hurtig tidsskala14,15. Enheden er blevet brugt til at forberede gitre med en forsinkelsestid på mindst 6 ms mellem prøveudbringning og frysning og til hurtigt at blande og fryse to prøver. Designet af TED er baseret på en tidligere version16 og ligner andre spraybaserede tidsfor løste cryo-EM-enheder17.
For det første beskrives de fire hoveddele i TED-opsætningen. Kernen i TED er den flydende håndteringsenhed, som er ansvarlig for prøve aspiration og dispensering. Et pneumatisk stempel flytter gitteret gennem sprayen ind i den flydende ethan. Generering af sprayen opnås med mikrofluidiske sprøjtedyser, og frysning sker i en flydende ethanbeholder, som beskrives kort. Endelig fremhæves de ekstra funktioner til styring af gittermiljøet, især fugtighed. Dette efterfølges af detaljerede protokoller for enhedens drift og for udførelse af TrEM-eksperimenter. Repræsentative resultater gives til hurtig netforberedelse og et simpelt TrEM-eksperiment.
Eksperimentel opsætning
Væskehåndteringsenheden
TED's væskehåndteringssystem er dannet af tre sprøjtedrevpumper ('pumper 1 - 3'), der hver er udstyret med en roterende ventil (figur 1). En strømforsyning giver pumper 1 - 3 med 24 V DC. Kommunikation med kontrolsoftwaren (skrevet i Visual Basic og C++) sker via en RS232-grænseflade til pumpning 1. Kommandoer distribueres via de serielle I/O-udvidelsesporte fra pumpe 1 til pumper 2-3. Pumper 1-3 er udstyret med glassprøjter ('sprøjter 1-3', vi bruger 250 μL/zero dead volume sprøjter her). Hver ventil har to positioner, 'belastning' og 'dispensere'. Lastpositionen anvendes til at aspirere prøven i sprøjten. Et kort stykke (~ 3 - 4 cm) af 1/16 "OK, 0,01′′ ID FEP slanger er forbundet via ETFE / ETFE flangeløse fittings til 'belastning' position ventiler 1-3. Dette korte slangestykke når ind i prøvebeholderen (typisk et 1,5 mL eller 0,5 mL plastrør). Dispenseringspositionen fører til sprøjtedysen. Tilslutning mellem dispenserudtaget og sprøjtedysen er lavet af PE slange (~ 20-30 cm længde, 0,043" O.D., 0,015" ID), med et kort stykke ærmeslange (~ 0,5 cm) og ETFE/ETFE flangeløse fittings.
Det pneumatiske stempel
TED bruger et pneumatisk stempel til at accelerere gitteret og flytte det gennem prøvesprayen ind i væskedehanbeholderen. Tryk pincet holde nettet, skruet ind i en hjemmebygget holder, som er monteret på en dobbelt stang pneumatiske cylinder (Figur 2A).
Trykket leveres fra en stor nitrogengasflaske (størrelse W), der er udstyret med en multistage regulator (0 - 10 bar, 'hovedtryk'). Fleksibel forstærket PVC-slange (12 mm O.D.) forbinder regulatoren med en 12-port manifold, hvor tryk nitrogen leveres til dysen og det pneumatiske stempel. Gasstrømmen gennem dysen er konstant, reguleret direkte ved nitrogencylinderen (hovedtryk). Forbindelsen til dysen er lavet med PU slanger (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), et kort stykke PE slanger (~ 8 cm længde, 0,043" O.D., 0,015 "ID) og passende stik. Trykket på det pneumatiske stempel styres gennem en magnetventil. PU slange (4 mm O.D., 2,5 mm ID) forbinder magnetventilen med en regulator og det pneumatiske stempel for at muliggøre et reduceret dyktryk (≤ hovedtryk). Magnetventilen er computerstyret. Der gives en skematisk oversigt over opsætningen i figur 2B.
Bemærk, at med denne opsætning er dyktrykket altid lige eller mindre end sprøjtegastrykket (hovedtryk). Opsætningen kan dog nemt ændres ved at indarbejde en anden regulator opstrøms sprøjtedysen for at tillade højere dykhastigheder ved lavt sprøjtegastryk. Højt tryk (>> 2 bar) kan beskadige PDMS-sprøjtedysen.
FORSIGTIG: Dette er et tryksystem, og 'hovedtrykket' skal altid være < 7 bar.
Tryk mellem 0,5 og 2 bar bruges typisk til det pneumatiske stempel og viser en omtrent lineær sammenhæng mellem tryk og hastighed (ved sprayens lodrette position). Dykhastigheder måles med et oscilloskop, der er forbundet i overensstemmelse med et slide potentiometer (10 kΩ) og parallelt med en 2 kΩ modstand (Figur 2C). En strømforsyning giver potentiometeret med 9 V DC. Mens den omtrentlige dykhastighed indstilles før eksperimentet ved at indstille dyktrykket, giver potentiometeret en præcis udlæsning af hastigheden efter eksperimentet.
Sprøjtedyser og flydende ethanbeholder
Fremstilling og drift af gasdynamiske virtuelle dyser til spraybaseret prøvelevering er beskrevet andetsteds i detaljer15. Som beskrevet ovenfor er dispenserudtag af ventiler 1-3 forbundet med dysens flydende indløb (figur 3A). Den tryksatte sprøjtegas er forbundet med dysens gasindtag. Indløbene i PDMS sprøjtedyserne er således, at 0,043" O.D. PE slanger kan bruges direkte uden behov for fittings. Vores dyse design indeholder en 'jet-in-jet' geometri til blanding af to prøver, svarende til den i ref.18beskrevne anordning. Et skema over designet er vist i figur 3B, vises et mikroskopisk billede af en dyse i figur 3C. Layoutet af den mikrofluidiske enhed kræver brug af tre sprøjter til at blande to prøver. Sprøjtedysen er typisk placeret i 1-1,5 cm afstand fra gitteret (under prøveudbringning).
Vi bruger flydende ethan som en cryogen, i en flydende ethan / nitrogenbeholder som anvendes til standard blotting metode. Lodret positionering af den flydende ethanbæger opnås med en laboratorieløftplatform.
Kontrol af sprøjte- og gittermiljøet
Stemplet og spraydysen er indeholdt i en specialbygget PMMA -boks (akrylglas) med en dobbeltdør (Figur 4A). Høj relativ luftfugtighed inde i kassen opnås ved hjælp af et luftbefugtningssystem bag på TED (Figur 4B). Luft leveres af en pumpe og føres ind i en første 10" beholder (typisk anvendes til under vask vandrensning). Beholderen er fyldt med et lavt (~ 5-10 cm) vandniveau og huser også en luftfugterenhed. Lysnettet til luftfugteren styres af en digital fugtigheds-/temperaturregulator og en fugtigheds-/temperatursensor placeret inde i akrylglaskassen. Controlleren er indstillet til at slukke for pumpen, når den relative luftfugtighed når ≥ 90 %. Luftet luft fra den første beholder pumpes gennem en diffusor, nedsænket i vand i en anden 10 "beholder og derefter kommer ind i akryl glas boks.
FORSIGTIG: Da prøven er aerosoliseret i sprøjtedysen, er farlig biologisk eller kemisk prøve ikke egnet som prøver.
Kørselssekvensen
Knappen Kør script i kontrolsoftwaren starter kørselssekvensen. Denne sekvens af kommandoer kan foruddefineres i en scriptfil og ændres via softwaren. De vigtigste variabler er forklaret her:
Sprøjtehastighed: Sprøjtehastigheden bestemmer den væskestrøm, der bruges af sprøjtepumpen. Flowraten kan beregnes på følgende måde: Sprøjtepumpemotorerne, der anvendes her, har en fast trinstørrelse. Hele spektret af pumpen er opdelt i 48.000 trin. Den anden vigtige faktor er sprøjtevolumen. Vi bruger typisk 250 μL sprøjter. Sprøjtehastigheden i kontrolsoftwaren er indstillet som antal trin/sekund. En sprøjtehastighed på 1000 trin/sekund svarer til:
Sprayvolumen: Sprøjtevolumen bestemmer det samlede volumen, der skal sprøjtes. Således bestemmer det også varigheden af sprayen. Sprøjtevolumen i kontrolsoftwaren er indstillet som en række trin. Et sprøjtevolumen på 2000 trin med en sprøjtehastighed på 1000 trin/sekund fører til en sprayvarighed på 2 s og et samlet volumen på 10,4 μL.
Pre-spray tid: Denne variabel definerer tiden mellem indledningen af spray og springet. Det er vigtigt at vælge forsinkelsestiden, så sprayen har tilstrækkelig tid til at stabilisere sig, før du kaster gitteret. Normalt gives sprayen 1,5 - 4 s for at stabilisere, før gitteret kastes. Sprayen opretholdes, indtil gitteret er flyttet igennem. Normalt stoppes væskestrømmen (og dermed sprayen) 0,5 til 1 s efter gitteret er blevet kastet. Ved hjælp af en sprøjtehastighed på 1000 trin /s og en sprayvolumen på 2000 trin er en typisk pre-spray tid 1,5 s, for eksempel.
En eksemplarisk sekvens af kommandoer vises i figur 5A, gitterpositionen over tid er illustreret i figur 5B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af systemet
BEMÆRK: I følgende protokol beskrives, hvordan du forbereder gitre af et enkelt eksempel. Normalt fremstilles der mindst 2 replikerede gitre for hver prøve eller betingelse. For hurtigere dyk hastigheder (mindre end ~ 20 ms tidsforsinkelse), 3 eller 4 replikere gitre er typisk parat til at tegne sig for et reduceret antal tynde is områder.
- Fortynd proteinprøven til målkoncentrationen i den ønskede buffer. Typisk, endelige koncentrationer ≥ 2 mg/mL fungerer godt for gitter forberedelse med TED. Bemærk, at prøven kan opbevares på is indtil trin 10, fra trin 10 og fremefter vil prøven bruge lang tid ved stuetemperatur, da det tager ca. 20 minutter at forberede 3-4 gitre.
- Tænd for TED' en. Tænd derefter kontrol-pc'en, og start kontrolsoftwaren.
- Initialiser alle sprøjtepumper ved at trykke på initialisere knappen (lavere sort knap) på hver sprøjtepumpe.
- Tænd for potentiometer strømforsyningen, sæt den til 9 V og starte oscilloskop kontrol software.
- Sørg for, at N2-cylinderensregulatorventil er lukket. Åbn cylinderventilen. Åbn derefter langsomt regulatorventilen, der indstiller udløbstrykket til den ønskede værdi for sprøjtegastrykket (typisk 1-2 bar). For de PDMS dyser, der anvendes her, må du ikke bruge tryk højere end ~ 2,5 bar for at undgå skader på dysen. Den kontinuerligt flydende gas forhindrer væske i at dryppe og akkumulere ved dysespidsen, hvilket kan føre til uudslettelig sprøjtning.
- Sørg for, at alle sprøjtepumpeventiler er i lastpositionen. Dette kan gøres ved at skifte alle ventiler til 'dispensere' position i kontrolsoftwaren og derefter tilbage til 'belastning'. Lad alle ventiler skifte til 'belastning'. Sæt alle sprøjter til nul.
- Fjern eventuelle luftbobler, der er til stede i systemet på dette stadium. For at gøre dette skal sprøjterne muligvis skrues af, bobler fjernes manuelt, og sprøjterne monteres igen, når de ikke indeholder flere bobler.
- Væskehåndteringskomponenterne opbevares normalt i H2O. Før prøveopløsningen skal du ekvilibrere væskesystemet med buffer ved at vaske slangen med et overskud af buffer. Brug en passende maksimal væskestrøm for at undgå overtryk på sprøjtedysen. Flydende flowrates > 10 μL/s kan forårsage skade på de PDMS dyser, der er beskrevet her.
- Anbring et 1,5 mL rør, der indeholder ≥ 200 μL buffer, på sprøjte 1 (toppen skal gennembores for at fastgøres til slange).
- Sørg for, at ventil 1 er i 'belastning' position. Skift om nødvendigt kontrolsoftwaren ind.
- Aspirere den ønskede mængde (typisk 50-100 μL) buffer med sprøjte 1, gennem kontrolsoftwaren.
- Skift ventil 1 til 'dispensere' position, gennem kontrolsoftwaren.
- Dispenser al væsken i sprøjte 1, gennem kontrolsoftwaren.
- Returner ventilen til 'belastning', nulstil sprøjtepositionen til '0' i programmet og tryk initialisere på sprøjte 1 for at forberede systemet til næste cyklus.
BEMÆRK: Trin 1.9.1 - 1.9.5 gentages normalt tre gange for at sikre grundig vask af slangen.
- Læg pincet med et EM-gitter (intet krav til nogen bestemt type) ved at løsne den faldende armklemme, placere pincet i klemmen og stramme klemmen.
- Flyt den faldende arm manuelt, så gitteret og dysen er i samme højde (prøveapplikationspositionen). Hvis dysen og gitteret er justeret, akkumuleres væsken på gitteret efter sprøjtning i en længere periode. Hvis det er nødvendigt, skal dysepositionen justeres.
- Juster placeringen af den flydende ethan kop ved manuelt at flytte den faldende arm med monteret pincet til sin slutposition (nå ind i ethan kop). Når det er konfigureret korrekt, vil et gitter, der holdes af pincet, nå omtrent midten af den flydende ethankop.
- Kontroller, at 'run script' bruger de ønskede flowrates, mængder og tider. Se afsnittet 'Kørselssekvensen' ovenfor for at få flere oplysninger.
- Sørg for, at intet hindrer stemplets vej. Aspirere mængden af buffer, der kræves for en enkelt køre ind i sprøjte 1. Dette gøres i kontrolsoftwaren, se afsnittet 'Kørselssekvensen' for typisk indstilling og diskenheder. Sørg derefter for, at ventil 1 er skiftet til 'dispenser'-positionen. Udfør en testkørsel ved at trykke på Kør script i kontrolsoftwaren.
FORSIGTIG: Hold dig væk fra TED, indtil kørselssekvensen er færdig. Bevægelige dele kan forårsage skade! - Når 'run sequence' er færdig, skal du indstille trykket på den faldende arm til den ønskede værdi (typisk 1-2 bar). Tryk først derefter på OK i kontrolsoftwaren for at frigøre tryk fra den faldende arm. Hvis 'løbesekvensen' eller trykket på den faldende arm skal justeres, kan disse indstillinger ændres på dette stadium, og trin 1.13 - 1.15 gentages.
2. Hurtig gitterforberedelse
- Fyld først væskeehan/nitrogenbeholderen med flydende nitrogen. Når det er tilstrækkeligt koldt og fri for flydende nitrogen, fyldes koppen med flydende ethan. Undgå størkning af den flydende ethan. Dette trin er det samme som for konventionel gitterforberedelse.
BEMÆRK: For at minimere ethanforurening skal du sikre dig, at trin 2.2 - 2.13 udføres så hurtigt som muligt
FORSIGTIG: Flydende ethan er en kryogen og brandfarlig. Der skal udvises forsigtighed ved håndtering. - Forbered cryo-EM gitre til glød-udledning. Vi bruger typisk holey carbon grids og glow-udledning til 90 s, ved 0,1 mbar lufttryk og 10 mA. Normalt er ikke mere end 4 gitre er glød udledes ad gangen. Gitrene anvendes inden for 30 min af glow-losning.
- Ekvilibrere slangen med prøve (efter trin 1.9.1 - 1.9.5 ved hjælp af prøve i stedet for buffer). Hvis den tilgængelige prøvevolumen er lav, kan slangen ekvilibreres med kun 1 død volumen.
- Aspirere mængden af prøve, der er nødvendig for en enkelt køre ind i sprøjte 1 i kontrolsoftwaren (se afsnittet 'Køresekvensen' for detaljer). Skift derefter ventil 1 til 'dispenser'-positionen.
- Kontroller, at den relative luftfugtighed har nået den ønskede værdi (vi forbereder typisk gitre ved 60 % relativ luftfugtighed eller højere). Når ≥ 60 % fugtighed er nået, skal du kun åbne fugtighedskammeret i minimal tid for at opretholde høj luftfugtighed.
- Placer pincet, holder en glød-udledt gitter, i pneumatiske stemplet og fastsætte dem. Flyt stemplet til startpositionen (øverst).
- Sørg for, at skyderen på potentiometeret er i startpositionen, klar til målingen, ved at flytte den manuelt for at kontakte stemplet. Indstil aftrækkeren på oscilloskopet i oscilloskopsoftwaren.
- Placer væske ethan/nitrogenbeholderen.
- Tryk på Kør script i kontrolsoftwaren. Når du bliver bedt om det, skal du klikke på OK i kontrolsoftwaren for at starte kørslen.
FORSIGTIG: Hold dig væk fra TED, indtil kørselssekvensen er færdig. Bevægelige dele kan forårsage skade! - Når 'run sequence' er afsluttet, slip trykket på det pneumatiske stempel ved at klikke på OK i kontrolsoftwaren.
- Åben fugtighed kammer, løsne forbindelsen mellem kaster arm og pincet med den ene hånd, mens sikring pincet med den anden. Når pincet er fri, skal du flytte den faldende arm op, mens du holder gitteret i den flydende ethan. Overfør derefter nettet til dets opbevaringsplads i den omgivende væske N2. Efter frysning skal nettet til enhver tid holdes ved flydende N2-temperatur.
- Gem oscilloskopmålingen. Nulstil manuelt placeringen af potentiometer skyderen og stemplet bagefter.
- Gentag trin 2.4-2.12 for at forberede replikerede gitre
- Overfør gitrene til langtidslager, indtil gitterklip og dataindsamling.
- Vask systemet med buffer i henhold til trin 1.9.1 - 1.9.5. Vask derefter systemet med H2O i henhold til trin 1.9.1 - 1.9.5.
- Sluk for den vigtigste nitrogengasregulator, og sluk for strømmen.
- Anbring ethan/nitrogenbeholderen i en røghætte, så den kan varme op, og lad den flydende ethan og N2 fordampe.
3. Tid-løst cryo-EM
BEMÆRK: Når tid-løst eksperimenter udføres med TED, der er yderligere aspekter, der skal overvejes, selv om den grundlæggende opsætning og variabler forbliver de samme. Det antages her, at to opløsninger blandes i et 1:1 (v/v) forhold for at producere den endelige blanding, der deponeres på nettet. Følg protokollen beskrevet i '1. Hurtig gitterforberedelse med TED', med følgende ændringer:
- Brug højere lagerkoncentrationer til blanding af eksperimenter end til simple sprayforsøg. Blanding i et 1:1 (v/v) forhold vil resultere i en 2x fortynding af hver komponent.
- For en hurtig blanding eksperiment, bruge alle tre sprøjter i stedet for blot en enkelt.
- Fastgør slanger til sprøjtepumper 2-3.
- Fastgør slanger fra sprøjtepumper 2-3 til sprøjtedysen.
- Ekvilibrere alle tre sprøjter i buffer og prøve separat. Sprøjte 1 fyldes typisk med prøve A, og sprøjter 2-3 fyldes med prøve B (figur 3).
- Rediger kørselssekvensen. Et eksempel på en køresekvens ved hjælp af alle 3 sprøjter til et hurtigt blandingseksperiment er angivet i figur 6. Se også afsnittet 'Kørselssekvensen' for at få flere oplysninger.
- Forskellige tidsforsinkelser kan opnås på to måder:
- Skift stempelhastigheden. Ved at justere stempelhastigheden kan tidsforsinkelsen ændres i et relativt smalt område. For eksempel kan stemplet med en spray/ethanafstand på 2 cm flyttes ved henholdsvis 1 m/s eller 2 m/s for at give en tidsforsinkelse på henholdsvis 20 ms eller 10 ms. Dette gøres som beskrevet i trin 1.15.
- Skift spray/ethanposition ved at justere spraydysens (lodrette) position. Hvis dysen er placeret i en 5 cm afstand fra ethanoverfladen, giver en dykhastighed på 1 m/s en tidsforsinkelse på 50 ms. At opnå betydeligt længere tidsforsinkelser kræver yderligere ændringer af opsætningen.
BEMÆRK: På grund af laminar flow i flowfokuserende del af dysen forventer vi ikke signifikant blanding i denne del af dysen. I stedet forventer vi, at blanding sker under spraygenerering, i dråber på vej til nettet og under dråbespredning på nettet. Flyvetiden for sprøjtedråber for at nå nettet anslås ≤ 1 ms (for en dråbehastighed på ≥ 10 m /s og en dysegitterafstand på 1 cm). Det er således kun tiden mellem landing af dråbe og vitrificering, der betragtes som »tidsforsinkelsen«.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hurtig gitterforberedelse med TED
Som testprøve til hurtig gitterforberedelse har vi brugt apoferritin fra heste milt ved 20 μM i 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. En rekonstruktion ved 3,5 Å opløsning blev opnået fra 690 mikrografer som beskrevet i ref.15 (figur 7A). Defokusområdet blev valgt, så partikler let kan identificeres i de rå billeder (Figur 7B). Et typisk gitter, der er udarbejdet med en tidsforsinkelse på 10-40 ms, viser tilstrækkelige områder med tynd is (Figur 7C) til at muliggøre indsamling af > 1000 mikrografer. Den resulterende opløsning er sandsynligvis begrænset af istykkelse, tomografisk analyse af en række forskellige gitre viste 96 ± 33 nm istykkelse6.
Tid løst cryo-EM
For at demonstrere hurtig blanding og tidsopløsning ved hjælp af TED har vi brugt dissociation af actomyosin-komplekset ved at blande med ATP som en modelreaktion19. Dette valg var baseret på den nemme skelnen mellem actomyosin og gratis F-actin fra rå mikrografer og de godt forstået kinetikere af reaktionen.
I det følgende fremgår det af TrEM's repræsentative resultater af ATP's dissociation af actomyosin-komplekset. Nærmere forsøgsprocedurer og resultater findes i ref.19. Kort sagt blev F-actin og kanin skelet myosin S1 blandet i 10 mM MOPS, 50 mM KAc, 2 mM MgCl2,0,1 mM EGTA, pH 7 ved endelige monomerkoncentrationer på 40 μM for at forberede actomyosin (AM) komplekset. AM-komplekset blev lagt i sprøjte 1 og 200 μM MgATP i samme buffer blev lagt i sprøjter 2 og 3. De vigtigste eksperimentelle parametre for de to forskellige tidsintervaller , der er udarbejdet, er angivet i tabel 1.
For begge tidszoner var resultatet en 1:1 v/v blanding af AM-kompleks og MgATP, hvilket gav endelige koncentrationer på 20 μM AM-kompleks og 100 μM MgATP. Beregnet blanding til frysetider var 7 og 13 ms som vist i tabel 1. Den anslåede flyvetid for sprøjtedråberne mellem dyse og gitter var < 1 ms.
Et lille kryo-EM datasæt (306 og 123 mikrografer) blev erhvervet for hvert timepoint og de kombinerede data, der behandles ved hjælp af standard spiralformede behandlingsprocedurer20. Den deraf følgende konsensusgenopbygning (begge tidsfrister kombineret) er vist i figur 8A. De kombinerede data blev derefter underkastet fokuseret klassificering og opdelt i en AM-kompleks og en F-actin-klasse (Figur 8B, C). Derefter blev fraktionen af AM-komplekse eller F-actin partikler for hvert timepunkt beregnet og er vist i figur 8D.
Den anden ordresats konstant for AM-kompleks dissociation er 1,5 · 106 M-1 s-1 21. Under forudsætning af, at
den integrerede sats lov kan tilnærmes til:
Hvis [AM-kompleks] er den tidsafhængige koncentration af AM-kompleks, [AM-kompleks]0 er den oprindelige koncentration, k er den anden ordresats konstant og [ATP]0 er den (oprindelige) ATP koncentration.
Ved hjælp af denne ligning blev kinetikken i AM-kompleks dissociation modelleret. Modellen er rimelig godt enig i de eksperimentelle TrEM-data. Der er betydelig variation pr. mikrograf som vist i figur 8D.
Figur 1: Den tidsforberedte EM-enhed (TED). (A) Oversigt over TED. (B) Væskehåndteringsenheden med pumper 1-3. Den fjerde pumpe til venstre bruges ikke i dette arbejde. Belastnings- og dispenserpositioner er angivet for ventil 1, og det samme gælder prøvebeholderen (»prøve 1«). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Pneumatisk stempel og lineær potentiometer. (A) Detaljer om TED'ens pneumatiske stempel med vigtige mærkede komponenter. (B) Skematisk for TED's pneumatiske system. Numrene svarer til N2-cylinderen (1), hovedtrykregulatoren (2), sprøjtedysen (3), magnetventilen (4), stempelhastighedsregulatoren (5) og den dobbelte stangpneumatiske cylinder (6). (C) Skematisk af kredsløbet for potentiometeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Gasdynamiske virtuelle dyser til blanding og sprøjtning. (A) En dyse med 4 indløbsrør tilsluttet, til levering til prøver (A og B) og N2 gas. (B) Skematisk for den centrale del af PDMS-sprøjtedyserne med dobbelt flowfokuserende geometri for at opnå flowfokusering (til downstream-blanding) og gasfokusering eller forstøvning. Prøve B vises i gul og prøve A i lilla. (C) Mikroskopisk billede af blandings- og forstøvningsafsnittene i mikrofluidisk dyse. Billede fra ref.15. Skalastang 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Miljøkontrol af gitter og spray i akrylglaskassen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kørselssekvensen. (A) Et eksempel kører sekvens, der viser variabler øverst og rækkefølgen af kommandoer nederst. Nogle af nøglekommandoerne kommenteres med rødt. (B) Gitterposition i løbet af en 'run sequence', der vises som en sort streg. Gitterets startposition er på 0 cm. Spray er initieret ved t = 0 s for 2 s, afstanden mellem spray og flydende ethan er ~ 2 cm. Ved 1,5 s begynder gitteret at bevæge sig med 2 m / s, gennem sprayen og ind i den flydende ethan. Sekvensen slutter som spray stopper efter 2 s. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Eksempel køre sekvens for en hurtig blanding eksperiment. Vigtige forskelle til figur 5 A kommenteres med rødt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Repræsentative resultater af et simpelt sprayforsøg. (A) 3.5 Å rekonstruktion af hesteapbudritin fra et gitter fremstillet i 36 ms mellem sprøjtning og vitrifikation (EMD- 10533). (B) Rå billede af den samme apoferritin-prøve. (C) Lav forstørrelsesvisning af gitteret, en eksemplarisk gittertorv indeholdende tynd is fremhæves af det stiplede blå rektangel, det område af tynd is i denne gitter-firkant er angivet med den blå pil. Områder med tyk is eller forurening er angivet med stjerner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Repræsentanten er resultatet afet blandingsforsøg. (A) Konsensusrekonstruktion af AM-komplekset, der er vist ved en høj tærskel (farvet) og lav tærskel (gennemsigtig). En myosin-tæthed er mærket og fremhævet med en stiplet linje. Rekonstruktionen blev genereret fra data fra begge tidszoner tilsammen. (B) F-actin klasse viser ingen myosin bundet. (C) AM-kompleks klasse, der viser myosin bundet (myosin i grå, primært bundet til den lyse røde actin underenhed). (D) Sammenligning mellem kinetisk model og eksperimentelle TrEM-data. Vist er den del af AM-kompleks i forhold til den oprindelige koncentration. Store sorte prikker angiver gennemsnitlige TrEM-data, små prikker viser TrEM-data pr. mikrograf. Den lilla stiplede linje repræsenterer den kinetiske model. Klik her for at se en større version af dette tal.
| flowrate (μL/s) | spray/ethanafstand (cm) | dykhastighed (m/s) | tidsforsinkelse (ms) | |||
| sprøjte 1 | sprøjte 2 | sprøjte 3 | ||||
| (AM) | (ATP) | (ATP) | ||||
| 7 ms | 2.08 | 1.04 | 1.04 | 1.4 | 2 | 7 |
| 13 ms | 1.04 | 0.52 | 0.52 | 2 | 1.6 | 13 |
Tabel 1: Eksperimentelle indstillinger for TrEM af AM-kompleks dissociation af ATP
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollerne i dette arbejde kan bruges til hurtig gitterforberedelse ved direkte sprøjtning og TrEM-eksperimenter. Hurtig gitterforberedelse kan bruges til at reducere partikelinteraktioner med luftvandsgrænsefladen5. De vigtigste begrænsninger er den tilgængelige prøvekoncentration og istykkelse på nettet. Inden for disse grænser og forudsat at prøvekvaliteten er god, producerer protokollen gitre, der er egnede til høj opløsning kryo-EM.
Fejlfinding
Væskestrømning og gitterhastighed bestemmer mængden af væske, der deponeres på nettet. Med ovenstående eksempelindstillinger (flydende flowrate 5 μL/s og dykhastighed 1-2 m/s) forventes en god dækning af nettet med dråber. Hvis dysen ikke var justeret godt (så spraydråber savner gitteret), viser frosne gitre meget få eller ingen dråber.
Kontaminering af net kan ikke helt undgås (se figur 7C), men kan reduceres ved at minimere eksponeringstiden for flydende ethan til et fugtigt miljø. Dette opnås ved at forberede replikeringsgitre så hurtigt som muligt (≤ 20 min for 4 gitre). Vi forbereder typisk 4 gitre, før vi udskifter den flydende ethan.
Glasagtig is på gitre(delvist) kan krystallisere, hvis den oprindelige afkøling i flydende ethan er for langsom. Efter en tidligere undersøgelse22har vi fundet lave dykhastigheder (< 0,5 m / s) fører til en stigning i krystallinsk is. Områder med meget tyk is (≥ 200 nm) viser typisk krystallinsk is på grund af i sagens natur langsommere afkøling. Hvis gitteret opvarmes under et af trinene efter netforberedelse (overførsel fra flydende ethan til flydende nitrogen, overførsel til opbevaring osv.),kan der også forekomme krystallinsk is.
Dataindsamling for TED-forberedte net
Den gennemsnitlige istykkelse produceret af TED er tykkere end det "ideelle" kryo-EM gitter forberedt på et standard blotting system. Istykkelse kan også variere mellem anskaffelsesområder. Det betyder, at anskaffelsesområder skal udvælges omhyggeligt for at give den tyndeste mulige is. Defokuseringsområdet skal muligvis justeres for at opnå billeder med høj kontrast. Når isen er tyk og partikler har lav kontrast, foreslår vi en indledende pilot dataindsamling ved hjælp af meget høje defokuserede værdier (3 - 5 μm). Nyere arbejde tyder på , at høj opløsning stadig kan opnås ved hjælp af så høje defokuserede værdier23.
Til konventionel kryo-EM-dataindsamling indsamles et helt datasæt ofte fra et enkelt gitter. Vi har dog fundet indsamlingen af flere små datasæt og sammenlægning af disse datasæt nyttig. På denne måde kan flere tidspunkter registreres inden for begrænset mikroskop tid og timepoints af interesse kan identificeres.
Behandling og analyse af TrEM-data
Sammenlægning af datasæt kan rutinemæssigt ske i de mest almindelige cryo-EM databehandling software. Som beskrevet ovenfor og i andres arbejde kan det være nyttigt at flette datasæt fra separate tidszoner17. Det er vigtigt, at partikler kan spores tilbage til deres oprindelige delmængde (timepoint) under hele behandlingen.
Konventionelle kinetiske målinger (for eksempel ved hjælp af lysspredning eller fluorescens) kan være en værdifuld tilføjelse til TrEM-eksperimenter. Rate konstanter fra biokemiske målinger kan bruges til at forudsige levetiden af den mellemliggende tilstand af interesse, eller til at bekræfte kinetika observeret af TrEM. For en grundlæggende introduktion til reaktionskinetik og deres forhold til tidsforholdte strukturelle undersøgelser henvises til ref.24.
Der er en række mulige årsager til forskelle mellem TrEM og konventionelle kinetiske eksperimenter. Som vist i figur 8Dkan TrEM-data vise betydelige variationer pr. mikrograf. Vi bemærker også, at foreløbige data tyder på mindst 5% variation i relative partikeltal mellem replikerede gitre. Partikelklassifikation (klassetildeling) kan være ufuldkommen, især hvis staterne er strukturelt ens, eller hvis en struktur er meget fleksibel. Partikler, og dermed TrEM afledt kinetik, kan også blive påvirket af partikelinteraktioner med luft-vand interface, fordi sådanne interaktioner er reduceret, men ikke elimineret ved hurtige hastigheder.
Dette arbejde giver nogle retningslinjer for TrEM, men vi bemærker, at dette er et aktivt forskningsområde, og vi forventer yderligere fremskridt i fremtiden. Mens TrEM-eksperimenter kræver en betydelig eksperimentel indsats, kan de tilbyde indsigt i makromolekylær kompleksitet i høj opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Molly S.C. Gravett for nyttige diskussioner og ABSL facilitet personale for hjælp med cryo-EM dataindsamling. David P. Klebl er ph.d.-studerende på Wellcome Trust 4-årig ph.d.-program i Astbury Center finansieret af The University of Leeds. FEI Titan Krios mikroskoper blev finansieret af University of Leeds (UoL ABSL award) og Wellcome Trust (108466 / Z / 15 / Z). Dette arbejde blev finansieret af en BBSRC tilskud til Stephen P. Muench (BB / P026397/1) og støttet af forskningsbevillinger til Howard D. White fra American Heart Association (AMR21-236078) og Howard D. White og Vitold Galkin fra US National Institutes of Health (171261).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10x70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
References
- Murphy, B. J., et al. Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling. Science. 364, (2019).
- Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH. Nature. , 1-4 (2020).
- Dance, A. Molecular motion on ice. Nature Methods. , 1-5 (2020).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15, 793-795 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales. BioRxiv. , (2020).
- Ravelli, R. B., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11, 1-9 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM. Structure. 25, 663-670 (2017).
- Ashtiani, D., et al. Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation. Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11, 1-14 (2020).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, (2019).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).
- White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Protein Complex Assembly. , Springer. 59-71 (2018).
- Trebbin, M., et al. Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions. Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).
- Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).
- He, S., Scheres, S. H. Helical reconstruction in RELION. Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).
- Millar, N. C., Geeves, M. A. The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1. FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).
- Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging. Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).
- Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading. bioRxiv. , (2020).
- Bagshaw, C. A beginner's guide to flow kinetics. The Biochemist. 42, (2020).
