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Biochemistry

Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62199
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1School of Biomedical Sciences, Faculty of Biological Sciences & Astbury Centre for Structural and Molecular Biology, University of Leeds, 2School of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences & Astbury Centre for Structural and Molecular Biology, University of Leeds, 3Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

Summary

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation d’un dispositif de fabrication de grille rapide pour la fabrication rapide de grilles et pour le mélange et la congélation rapides afin de mener des expériences résolues dans le temps.

Abstract

Le domaine de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) se développe rapidement avec de nouveaux équipements et algorithmes de traitement, produisant des structures à plus haute résolution et des informations sur des systèmes plus difficiles. La préparation des échantillons pour le cryo-EM connaît une révolution similaire avec de nouvelles approches en cours de développement pour remplacer les systèmes de transfert traditionnels. Il s’agit notamment de l’utilisation de distributeurs piézo-électriques, de l’impression d’épingles et de la pulvérisation directe. À la suite de ces développements, la vitesse de préparation de la grille passe de quelques secondes à quelques millisecondes, offrant de nouvelles opportunités, en particulier dans le domaine de la cryo-EM à résolution temporelle où les protéines et les substrats peuvent être rapidement mélangés avant la congélation en plongée, piégeant les états intermédiaires de courte durée. Nous décrivons ici, en détail, un protocole standard pour la fabrication de grilles sur notre dispositif EM interne à résolution temporelle à la fois pour la préparation rapide standard de la grille et également pour les expériences résolues dans le temps. Le protocole exige un échantillon d’environ 50 μL à des concentrations de ≥ 2 mg/mL pour la préparation de 4 grilles. Le délai entre l’application de l’échantillon et la congélation peut être aussi bas que 10 ms. L’une des limites est l’augmentation de l’épaisseur de la glace à des vitesses plus rapides et par rapport à la méthode de buvardage. Nous espérons que ce protocole aidera d’autres personnes à concevoir leurs propres dispositifs de fabrication de grilles et ceux qui s’intéressent à la conception d’expériences résolues dans le temps.

Introduction

Arrière-plan
Les développements récents en cryo-microscopie électronique (cryo-EM) ont permis des études structurelles de systèmes de plus en plus complexes à haute résolution. À quelques exceptions près, ces études ont été limitées à des macromolécules biologiques à l’équilibre1 ou à des réactions relativement lentes2. De nombreux processus in vivo se produisent sur une échelle de temps plus rapide (millisecondes) et il y a un intérêt croissant pour la cryo-EM résolue dans le temps (TrEM) sur ces échelles de temps3. Cependant, la préparation conventionnelle des échantillons cryo-EM par la méthode de buvardage est trop lente pour la milliseconde TrEM.

La méthode de transfert a d’autres limitations que la mauvaise résolution du temps. Les protéines et les complexes protéiques peuvent souffrir de dénaturation ou d’orientation préférée sur les grilles4. Il a été démontré que la réduction du temps d’exposition à l’interface air-eau pendant la préparation de l’échantillon atténue l’orientation préférée et la dénaturation des protéines5,6. Ainsi, la préparation rapide du réseau permet non seulement une trEM milliseconde, mais peut également améliorer la qualité du réseau.

Actuellement, il existe trois approches différentes pour la préparation automatisée du réseau. La première approche utilise une épingle ou un capillaire qui contient une petite quantité d’échantillon. Après avoir établi le contact entre le liquide et la surface de la grille, l’échantillon est « écrit » sur la grille7,8. Le processus d’application de l’exemple est relativement lent et prend quelques secondes. Une approche alternative utilise la génération contrôlée de gouttelettes par un distributeur piézoélectrique et des grilles à mèche automatique9. Cela permet une distribution plus rapide pour geler les temps, mais est toujours limité par la vitesse des gouttelettes et de l’évacuation (atteignant actuellement 54 ms). L’approche la plus rapide jusqu’à présent est l’approche par pulvérisation directe, dans laquelle l’échantillon est atomisé dans une buse de pulvérisation et les petites gouttelettes (~ 10 - 20 μm) et rapides (> 5 m / s) se propagent au contact de la grille cryo-EM. La pulvérisation d’échantillon peut être générée par différentes méthodes telles que des atomiseurs de souffle d’air, des ondes acoustiques de surface ou des humidificateurs à ultrasons10,11,12,13. D’après notre expérience, l’épaisseur de la glace avec l’approche de pulvérisation directe est plus grande, mais la pulvérisation directe permet aux distributeurs de geler des temps < 10 ms.

Ce protocole décrit étape par étape comment un dispositif EM à résolution temporelle (TED) équipé d’une buse de pulvérisation microfluidique peut être utilisé pour préparer des grilles sur une échelle de temps rapide14,15. L’appareil a été utilisé pour préparer des grilles avec un délai minimum de 6 ms entre l’application de l’échantillon et la congélation et pour mélanger et congeler rapidement deux échantillons. La conception du TED est basée sur une version précédente16 et est similaire à d’autres dispositifs cryo-EM à résolution temporelle basés sur la pulvérisation17.

Tout d’abord, les quatre parties principales de la configuration TED sont décrites. Le cœur du TED est l’unité de manipulation des liquides, qui est responsable de l’aspiration et de la distribution des échantillons. Un piston pneumatique déplace la grille à travers la pulvérisation dans l’éthane liquide. La génération du spray est réalisée avec des buses de pulvérisation microfluidiques et la congélation est effectuée dans un récipient d’éthane liquide, qui sont décrits brièvement. Enfin, les fonctionnalités supplémentaires pour contrôler l’environnement du réseau, en particulier l’humidité, sont mises en évidence. Ceci est suivi de protocoles détaillés pour le fonctionnement de l’appareil et pour la réalisation d’expériences TrEM. Des résultats représentatifs sont donnés pour une préparation rapide de la grille et une expérience TrEM simple.

Configuration expérimentale

L’unité de manutention des liquides
Le système de traitement des liquides du TED est formé de trois pompes d’entraînement à seringue (« pompes 1 à 3 »), chacune équipée d’une vanne rotative(Figure 1). Une alimentation fournit des pompes 1 - 3 avec 24 V DC. La communication avec le logiciel de contrôle (écrit en Visual Basic et C++) se fait via une interface RS232 pour pomper 1. Les commandes sont distribuées via les ports d’extension d’E/S série de la pompe 1 à la pompe 2-3. Les pompes 1-3 sont équipées de seringues en verre (« seringues 1-3 », nous utilisons ici des seringues de 250 μL / zéro volume mort). Chaque vanne a deux positions, « charger » et « distribuer ». La position de « charge » est utilisée pour aspirer l’échantillon dans la seringue. Une pièce courte (~ 3 - 4 cm) de 1/16 » O.D., 0.01′′ I.D. FeP tube est connectée via des raccords sans bride ETFE / ETFE à la position de « charge » des vannes 1-3. Ce court morceau de tube atteint le réservoir d’échantillon (généralement un tube en plastique de 1,5 mL ou 0,5 mL). La position « distribuer » conduit à la buse de pulvérisation. La connexion entre la sortie de distribution et la buse de pulvérisation est réalisée par des tubes en PE (~ 20-30 cm de longueur, 0,043 « O.D., 0,015 » I.D.), avec un court morceau de tube à manchon (~ 0,5 cm) et des raccords sans bride ETFE / ETFE.

Le piston pneumatique
Le TED utilise un piston pneumatique pour accélérer la grille et la déplacer à travers le spray d’échantillon dans le récipient d’éthane liquide. Des pinces à pression négative maintiennent la grille, vissée dans un support construit à la maison qui est monté sur un cylindre pneumatique à double tige(Figure 2A).

La pression est fournie par une grande bouteille d’azote gazeux (taille W), équipée d’un régulateur à plusieurs étages (0 - 10 bar, « pression principale »). Un tube flexible en PVC renforcé (12 mm O.D.) relie le régulateur à un collecteur à 12 ports où l’azote sous pression est livré à la buse et au piston pneumatique. Le débit de gaz à travers la buse est constant, régulé directement au niveau de la bouteille d’azote (pression principale). La connexion à la buse est faite avec un tube en PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), un court morceau de tube PE (~ 8 cm de longueur, 0,043"O.D., 0,015 » I.D.) et des connecteurs appropriés. La pression sur le piston pneumatique est contrôlée par une électrovanne. Des tubes en PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) relient l’électrovanne à un régulateur et au piston pneumatique, pour permettre une pression de plongée réduite (≤ pression principale). L’électrovanne est contrôlée par ordinateur. Une vue d’ensemble schématique de la configuration est donnée à la figure 2B.

Notez qu’avec cette configuration, la pression de plongée est toujours égale ou inférieure à la pression du gaz de pulvérisation (pression principale). Cependant, la configuration peut facilement être modifiée en incorporant un deuxième régulateur en amont de la buse de pulvérisation pour permettre des vitesses de plongée plus élevées à faible pression de gaz de pulvérisation. Des pressions élevées (>> 2 bar) peuvent endommager la buse de pulvérisation PDMS.

ATTENTION: Il s’agit d’un système pressurisé et la « pression principale » doit toujours être < 7 bars.

Des pressions comprises entre 0,5 et 2 bars sont généralement utilisées pour le piston pneumatique et montrent une relation approximativement linéaire entre la pression et la vitesse (à la position verticale de la pulvérisation). Les vitesses de plongée sont mesurées à l’avec un oscilloscope, connecté en ligne avec un potentiomètre à glissière (10 kΩ) et en parallèle avec une résistance de 2 kΩ(Figure 2C). Une alimentation fournit le potentiomètre avec 9 V DC. Alors que la vitesse de plongée approximative est réglée avant l’expérience en réglant la pression de plongée, le potentiomètre donne une lecture précise de la vitesse après l’expérience.

Buses de pulvérisation et récipient d’éthane liquide
La fabrication et le fonctionnement de buses virtuelles dynamiques au gaz pour la distribution d’échantillons par pulvérisation ont été décrits ailleurs en détail15. Comme décrit ci-dessus, les sorties de distribution des vannes 1 à 3 sont connectées aux entrées de liquide de la buse (Figure 3A). Le gaz de pulvérisation sous pression est connecté à l’entrée de gaz de la buse. Les entrées dans les buses de pulvérisation PDMS sont telles que les tubes en PE O.D. de 0,043 " peuvent être utilisés directement sans avoir besoin de raccords. Notre conception de buse contient une géométrie « jet-in-jet » pour le mélange de deux échantillons, similaire au dispositif décrit à la réf.18. Un schéma de la conception est montré à la figure 3B, une image microscopique d’une buse est montrée à la figure 3C. La disposition du dispositif microfluidique nécessite l’utilisation de trois seringues pour mélanger deux échantillons. La buse de pulvérisation est généralement positionnée à une distance de 1 à 1,5 cm de la grille (pendant l’application de l’échantillon).

Nous utilisons de l’éthane liquide comme cryogène, dans un récipient liquide éthane/azote tel qu’utilisé pour la méthode de buvard standard. Le positionnement vertical de la tasse d’éthane liquide est réalisé avec une plate-forme élévatrice de laboratoire.

Contrôle de l’environnement de pulvérisation et de grille
Le piston et la buse de pulvérisation sont contenus dans une boîte en PMMA (verre acrylique) construite sur mesure avec une double porte(Figure 4A). Une humidité relative élevée à l’intérieur de la boîte est obtenue par un système d’humidification de l’air à l’arrière du TED(Figure 4B). L’air est fourni par une pompe et introduit dans un premier bidon de 10 pouces (généralement utilisé pour la purification de l’eau sous l’évier). Le bidon est rempli d’un niveau d’eau bas (~ 5-10 cm) et abrite également un humidificateur. L’alimentation secteur de l’humidificateur est contrôlée par un régulateur numérique d’humidité / température et un capteur d’humidité / température situé à l’intérieur de la boîte en verre acrylique. Le contrôleur est réglé pour éteindre la pompe lorsque l’humidité relative atteint ≥ 90 %. L’air humidifié du premier bidon est pompé à travers un diffuseur, immergé dans l’eau dans un deuxième bidon de 10 pouces, puis pénètre dans la boîte en verre acrylique.

ATTENTION : Étant donné que l’échantillon est aérosolisé dans la buse de pulvérisation, les échantillons biologiques ou chimiques dangereux ne conviennent pas comme échantillons.

La séquence d’exécution
Le bouton Exécuter le script du logiciel de contrôle lance la séquence d’exécution. Cette séquence de commandes peut être prédéfinie dans un fichier de script et modifiée via le logiciel. Les variables les plus importantes sont expliquées ici :

Vitesse de pulvérisation: La vitesse de pulvérisation détermine le débit de liquide utilisé par la pompe à seringue. Le débit peut être calculé comme suit: Les moteurs de pompe à seringue utilisés ici ont une taille de pas fixe. La gamme complète de la pompe est divisée en 48 000 marches. Le deuxième facteur important est le volume de la seringue. Nous utilisons généralement des seringues de 250 μL. La vitesse de pulvérisation dans le logiciel de contrôle est définie comme nombre de pas/seconde. Une vitesse de pulvérisation de 1000 pas/seconde correspond à :

Equation 1

Volume de pulvérisation: Le volume de pulvérisation détermine le volume total à pulvériser. Ainsi, il détermine également la durée de la pulvérisation. Le volume de pulvérisation dans le logiciel de contrôle est défini en plusieurs étapes. Un volume de pulvérisation de 2000 pas, à une vitesse de pulvérisation de 1000 pas/seconde, conduit à une durée de pulvérisation de 2 s et un volume total de 10,4 μL.

Temps de pré-pulvérisation : Cette variable définit le temps entre le début de la pulvérisation et la plongée. Il est important de choisir le temps de retard de manière à ce que le spray ait suffisamment de temps pour se stabiliser avant de plonger dans la grille. Habituellement, le spray est donné 1,5 - 4 s pour se stabiliser avant que la grille ne soit plongée. Le spray est maintenu jusqu’à ce que la grille se soit déplacée. Habituellement, l’écoulement du liquide (et donc la pulvérisation) est arrêté 0,5 à 1 s après la plongée de la grille. En utilisant une vitesse de pulvérisation de 1000 pas / s et un volume de pulvérisation de 2000 pas, un temps de pré-pulvérisation typique est de 1,5 s, par exemple.

Une séquence exemplaire de commandes est illustrée à la figure 5A,la position de la grille dans le temps est illustrée à la figure 5B.

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Protocol

1. Préparation du système

Remarque : Le protocole suivant décrit comment préparer les grilles d’un seul échantillon. Habituellement, un minimum de 2 grilles de réplication sont préparées pour chaque échantillon ou condition. Pour des vitesses de plongée plus rapides (moins de ~ 20 ms de retard), 3 ou 4 grilles répliquées sont généralement préparées pour tenir compte d’un nombre réduit de zones de glace minces.

  1. Diluer l’échantillon de protéines à la concentration cible dans le tampon souhaité. En règle générale, les concentrations finales ≥ 2 mg / mL fonctionnent bien pour la préparation de la grille avec le TED. Notez que l’échantillon peut être conservé sur la glace jusqu’à l’étape 10, à partir de l’étape 10, l’échantillon passera beaucoup de temps à température ambiante car il faut environ 20 minutes pour préparer 3-4 grilles.
  2. Activez le TED. Allumez ensuite le PC de contrôle et démarrez le logiciel de contrôle.
  3. Initialisez toutes les pompes à seringue en appuyant sur le bouton Initialiser (bouton noir inférieur) de chaque pompe à seringue.
  4. Allumez l’alimentation du potentiomètre, réglez-la sur 9 V et démarrez le logiciel de contrôle de l’oscilloscope.
  5. Assurez-vous que la soupape de régulation du cylindre N2est fermée. Ouvrez la soupape du cylindre. Ensuite, ouvrez lentement la vanne du régulateur en réglant la pression de sortie à la valeur souhaitée pour la pression du gaz de pulvérisation (généralement 1-2 bar). Pour les buses PDMS utilisées ici, n’utilisez pas de pressions supérieures à ~ 2,5 bar pour éviter d’endommager la buse. Le gaz qui s’écoule continuellement empêche le liquide de s’égouttre et de s’accumuler à l’extrémité de la buse, ce qui peut entraîner une pulvérisation irreproductible.
  6. Assurez-vous que toutes les vannes de la pompe à seringue sont en position de « charge ». Cela peut être fait en basculant toutes les vannes à la position « distribution » dans le logiciel de commande, puis en revenant à « charge ». Laissez toutes les vannes sur « charge ». Réglez toutes les seringues à zéro.
  7. Éliminez toutes les bulles d’air présentes dans le système à ce stade. Pour ce faire, les seringues devront peut-être être dévissées, les bulles enlevées manuellement et les seringues remontées lorsqu’elles ne contiennent plus de bulles.
  8. Les composants de manipulation des liquides sont généralement stockés dans H2O. Avant de charger la solution d’échantillon, équilibrez le système liquide avec un tampon en lavant le tube avec un excès de tampon. Utilisez un débit de liquide maximal approprié pour éviter la surpression sur la buse de pulvérisation. Des débits de liquide > 10 μL/s peuvent endommager les buses PDMS décrites ici.
  9. Placer un tube de 1,5 mL contenant ≥ tampon de 200 μL sur la seringue 1 (le dessus doit être percé pour se fixer au tube).
    1. Assurez-vous que la vanne 1 est en position de « charge ». Basculez dans le logiciel de contrôle, si nécessaire.
    2. Aspirer la quantité souhaitée (généralement 50-100 μL) de tampon avec la seringue 1, via le logiciel de contrôle.
    3. Basculez la vanne 1 en position « distribution », via le logiciel de commande.
    4. Distribuer tout le liquide dans la seringue 1, via le logiciel de contrôle.
    5. Soupape de retour pour « charger », réinitialiser la position de la seringue à « 0 » dans le programme et appuyer sur initialiser sur la seringue 1, pour préparer le système pour le cycle suivant.
      REMARQUE: Les étapes 1.9.1 à 1.9.5 sont généralement répétées trois fois pour assurer un lavage en profondeur du tube.
  10. Chargez les pinces à épilation avec une grille EM (aucune exigence pour un type spécifique) en desserrant la pince à bras plongeant, en plaçant la pince à épiler dans la pince et en resserrant la pince.
  11. Déplacez manuellement le bras plongeant de sorte que la grille et la buse soient à la même hauteur (position « application de l’échantillon »). Si la buse et la grille sont alignées, le liquide s’accumulera sur la grille après la pulvérisation pendant une période prolongée. Si nécessaire, ajustez la position de la buse.
  12. Ajustez la position de la tasse d’éthane liquide en déplaçant manuellement le bras plongeant avec une pince à épiler montée à sa position finale (atteignant la tasse d’éthane). Lorsqu’elle est correctement mise en place, une grille maintenue par la pince à épileuse atteindra approximativement le centre de la tasse d’éthane liquide.
  13. Vérifiez que le 'script d’exécution' utilisera les débits, volumes et minutages souhaités. Voir la section « La séquence d’exécution » ci-dessus pour plus de détails.
  14. Assurez-vous que rien n’obstrue le chemin du piston. Aspirer le volume de tampon nécessaire pour une seule course dans la seringue 1. Cela se fait dans le logiciel de contrôle, voir la section 'La séquence d’exécution' pour les paramètres et les volumes typiques. Ensuite, assurez-vous que la vanne 1 est commutée en position « distribution ». Effectuez une exécution de test en appuyant sur Exécuter le script dans le logiciel de contrôle.
    ATTENTION : Restez à l’écart du TED jusqu’à ce que la séquence d’exécution soit terminée. Les pièces mobiles pourraient causer des blessures!
  15. Lorsque la « séquence d’exécution » est terminée, réglez la pression sur le bras plongeant à la valeur souhaitée (généralement 1-2 bar). Ce n’est qu’alors que vous appuyez sur OK dans le logiciel de contrôle pour relâcher la pression du bras plongeant. Si la « séquence de course » ou la pression sur le bras plongeant doit être ajustée, ces réglages peuvent être modifiés à ce stade et les étapes 1.13 à 1.15 répétées.

2. Préparation rapide de la grille

  1. Remplissez d’abord le récipient d’éthane/azote liquide avec de l’azote liquide. Lorsqu’elle est suffisamment froide et exempte d’azote liquide, remplissez la tasse d’éthane liquide. Éviter la solidification de l’éthane liquide. Cette étape est la même que pour la préparation conventionnelle du réseau.
    REMARQUE : Pour minimiser la contamination par l’éthane, assurez-vous que les étapes 2.2 à 2.13 sont effectuées le plus rapidement possible.
    ATTENTION : L’éthane liquide est un cryogène et inflammable. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation.
  2. Préparez des grilles cryo-EM pour la décharge incandescente. Nous utilisons généralement des grilles de carbone troué et une décharge incandescente pendant 90 s, à une pression d’air de 0,1 mbar et à 10 mA. Habituellement, pas plus de 4 grilles sont déchargées à la fois. Les grilles sont utilisées dans les 30 minutes suivant la décharge de lueur.
  3. Équilibrez le tube avec l’échantillon (en suivant les étapes 1.9.1 à 1.9.5, en utilisant l’échantillon au lieu du tampon). Si le volume d’échantillon disponible est faible, le tube peut être équilibré avec seulement 1 volume mort.
  4. Aspirer la quantité d’échantillon nécessaire pour une seule course dans la seringue 1 dans le logiciel de contrôle (voir la section « La séquence d’exécution » pour plus de détails). Ensuite, basculez la vanne 1 à la position « distributeur ».
  5. Vérifiez que l’humidité relative a atteint la valeur souhaitée (nous préparons généralement des grilles à 60 % d’humidité relative ou plus). Une fois que ≥ 60 % d’humidité est atteinte, n’ouvrez la chambre d’humidité que pendant un temps minimal, afin de maintenir une humidité élevée.
  6. Placez la pince à épiler, en tenant une grille luminescente, dans le piston pneumatique et fixez-les. Déplacez le piston jusqu’à sa position de départ (en haut).
  7. Assurez-vous que le curseur du potentiomètre est en position de départ, prêt pour la mesure, en le déplaçant manuellement pour entrer en contact avec le piston. Réglez la gâchette de l’oscilloscope dans le logiciel de l’oscilloscope.
  8. Placez le récipient liquide éthane/azote.
  9. Appuyez sur Exécuter le script dans le logiciel de contrôle. Lorsque vous y êtes invité, cliquez sur OK dans le logiciel de contrôle pour démarrer l’exécution.
    ATTENTION : Restez à l’écart du TED jusqu’à ce que la séquence d’exécution soit terminée. Les pièces mobiles pourraient causer des blessures!
  10. Une fois la séquence de course terminée, relâchez la pression sur le piston pneumatique en cliquant sur OK dans le logiciel de contrôle.
  11. Ouvrez la chambre d’humidité, desserrez la connexion entre le bras plongeant et la pince à épiler d’une main tout en sécurisant la pince à épile de l’autre. Lorsque la pince à épilez est libre, déplacez le bras plongeant vers le haut tout en gardant la grille dans l’éthane liquide. Transférez ensuite la grille dans son espace de stockage dans le liquide environnantN2. Après la congélation, la grille doit être maintenue à la température du liquide N2 en tout temps.
  12. Enregistrez la mesure de l’oscilloscope. Réinitialisez manuellement la position du curseur du potentiomètre et du piston par la suite.
  13. Répétez les étapes 2.4 à 2.12 pour préparer les grilles de réplication
  14. Transférez les grilles dans un stockage à long terme jusqu’à l’écrêtage de la grille et la collecte de données.
  15. Lavez le système avec un tampon, conformément aux étapes 1.9.1 - 1.9.5. Ensuite, lavez le système avec H2O, conformément aux étapes 1.9.1 - 1.9.5.
  16. Éteignez le régulateur principal d’azote gazeux et coupez l’alimentation.
  17. Placez le récipient d’éthane/azote dans une hotte pour le laisser se réchauffer et laisser l’éthane liquide et leN2 s’évaporer.

3. Cryo-EM à résolution temporelle

REMARQUE: Lorsque des expériences résolues dans le temps sont menées avec le TED, il y a d’autres aspects à prendre en compte, bien que la configuration de base et les variables restent les mêmes. On suppose ici que deux solutions sont mélangées dans un rapport de 1:1 (v/v) pour produire le mélange final qui se dépose sur la grille. Suivez le protocole décrit dans '1. Préparation rapide de la grille avec le TED', avec les changements suivants:

  1. Utilisez des concentrations de stock plus élevées pour les expériences de mélange que pour les expériences de pulvérisation simples. Le mélange dans un rapport de 1:1 (v/v) entraînera une dilution 2x de chaque composant.
  2. Pour une expérience de mélange rapide, utilisez les trois seringues plutôt qu’une seule.
    1. Fixez le tube aux pompes à seringues 2-3.
    2. Fixez les tubes des pompes à seringue 2-3 à la buse de pulvérisation.
    3. Équilibrez les trois seringues dans un tampon et échantillonnez séparément. En règle générale, la seringue 1 est remplie de l’échantillon A et les seringues 2 à 3 sont remplies de l’échantillon B(figure 3).
  3. Modifiez la séquence d’exécution. Un exemple de séquence d’exécution utilisant les 3 seringues pour une expérience de mélange rapide est donné à la figure 6. Voir aussi la section 'La séquence d’exécution' pour plus de détails.
  4. Différents délais peuvent être obtenus de deux manières:
    1. Modifiez la vitesse du piston. En ajustant la vitesse du piston, le délai peut être modifié dans une plage relativement étroite. Par exemple, avec une distance de pulvérisation/éthane de 2 cm, le piston peut être déplacé à 1 m/s ou 2 m/s pour donner un délai de 20 ms ou 10 ms, respectivement. Ceci est fait comme décrit à l’étape 1.15.
    2. Modifiez la position de pulvérisation/éthane en ajustant la position (verticale) de la buse de pulvérisation. Si la buse est positionnée à une distance de 5 cm de la surface de l’éthane, par exemple, une vitesse de plongée de 1 m/s donne un délai de 50 ms. L’obtention de délais beaucoup plus longs nécessite d’autres modifications de la configuration.
      REMARQUE: En raison de l’écoulement laminaire dans la région de focalisation de l’écoulement de la buse, nous ne nous attendons pas à un mélange important dans cette partie de la buse. Au lieu de cela, nous nous attendons à ce que le mélange se produise pendant la génération de pulvérisation, dans les gouttelettes en route vers le réseau et pendant l’épandage de gouttelettes sur le réseau. Le temps de vol pour que les gouttelettes de pulvérisation atteignent la grille est estimé ≤ 1 ms (pour une vitesse de gouttelette de ≥ 10 m/s et une distance buse-grille de 1 cm). Ainsi, seul le temps entre l’atterrissage des gouttelettes et la vitrification est considéré comme le « délai ».

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Representative Results

Préparation rapide de la grille avec le TED
En tant qu’échantillon d’essai pour la préparation rapide de la grille, nous avons utilisé l’apoferritine de la rate équine à 20 μM dans 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Une reconstruction à une résolution de 3,5 Å a été obtenue à partir de 690 micrographies comme décrit à la réf.15 (Figure 7A). La plage de mise au point a été choisie de manière à ce que les particules puissent être facilement identifiées dans les images brutes (Figure 7B). Une grille typique préparée avec un délai de 10 à 40 ms montre suffisamment de surfaces de glace mince(figure 7C)pour permettre la collecte de > 1000 micrographies. La résolution résultante est probablement limitée par l’épaisseur de la glace, l’analyse tomographique d’un certain nombre de grilles différentes a montré une épaisseur de glace de 96 ± 33 nm6.

Cryo-EM à résolution temporelle
Afin de démontrer le mélange rapide et la résolution temporelle à l’aide du TED, nous avons utilisé la dissociation du complexe actomyosine par mélange avec de l’ATP comme réaction modèle19. Ce choix était basé sur la distinction facile entre l’actomyosine et la F-actine libre à partir de micrographies brutes et sur la cinétique bien comprise de la réaction.

Dans ce qui suit, les résultats représentatifs pour TrEM de la dissociation du complexe actomyosine par l’ATP sont montrés. Les procédures expérimentales détaillées et les résultats sont fournis à la réf.19. En bref, la F-actine et la myosine S1 squelettique de lapin ont été mélangées dans 10 mM MOPS, 50 mM KAc, 2 mM MgCl2,0,1 mM EGTA, pH 7 à des concentrations finales de monomères de 40 μM pour préparer le complexe actomyosine (AM). Le complexe AM a été chargé dans la seringue 1 et 200 μM MgATP dans le même tampon ont été chargés dans les seringues 2 et 3. Les principaux paramètres expérimentaux pour les deux points temporels différents préparés sont énumérés dans le tableau 1.

Pour les deux points temporels, le résultat a été un mélange 1:1 v/v de complexe AM et de MgATP, donnant des concentrations finales de 20 μM de complexe AM et de 100 μM MgATP. Les temps de mélange à congélation calculés étaient de 7 et 13 ms, comme le montre le tableau 1. Le temps de vol estimé pour les gouttelettes de pulvérisation entre la buse et la grille était de < 1 ms.

Un petit ensemble de données cryo-EM (306 et 123 micrographies) a été acquis pour chaque point temporel et les données combinées traitées à l’aide de procédures de traitement hélicoïdal standard20. La reconstruction consensuelle qui en résulte (les deux points temporels combinés) est illustrée à la figure 8A. Les données combinées ont ensuite été soumises à une classification ciblée et divisées en un complexe AM et une classe F-actine (Figure 8B, C). Ensuite, la fraction de particules de complexe AM ou de F-actine pour chaque point temporel a été calculée et est illustrée à la figure 8D.

La constante de taux du deuxième ordre pour la dissociation du complexe AM est de 1,5 · 106 M-1 s-1 21. En supposant que :

Equation 2

la loi sur les taux intégrés peut être approchée comme :

Equation 3

Où [complexe AM] est la concentration dépendante du temps du complexe AM, [complexe AM]0 est la concentration initiale, k est la constante de vitesse du deuxième ordre et [ATP]0 est la concentration (initiale) d’ATP.

À l’aide de cette équation, la cinétique de la dissociation complexe AM a été modélisée. Le modèle est raisonnablement bien d’accord avec les données expérimentales de TrEM. Il existe une variation significative par micrographie, comme le montre la figure 8D.

Figure 1
Figure 1: Le dispositif EM à résolution temporelle (TED). (A) Vue d’ensemble du TED. (B) L’unité de traitement des liquides avec pompes 1-3. La quatrième pompe à gauche n’est pas utilisée dans ce travail. Les positions de charge et de distribution sont indiquées pour la vanne 1, tout comme le réservoir d’échantillon (« échantillon 1 »). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Piston pneumatique et potentiomètre linéaire. (A) Détails du piston pneumatique du TED avec les composants importants étiquetés. (B) Schéma du système pneumatique du TED. Les chiffres correspondent au cylindre N2 (1), au régulateur de pression principal (2), à la buse de pulvérisation (3), à l’électrovanne (4), au régulateur de vitesse de plongée (5) et au cylindre pneumatique à double tige (6). (C) Schéma du circuit du potentiomètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Buses virtuelles dynamiques au gaz pour le mélange et la pulvérisation. (A) Une buse avec 4 tubes d’entrée connectés, pour alimenter les échantillons (A et B) et le gaz N2. (B) Schéma de la section centrale des buses de pulvérisation PDMS avec géométrie de focalisation à double flux pour obtenir une focalisation en flux (pour le mélange en aval) et une focalisation ou une atomisation des gaz. L’échantillon B est représenté en jaune et l’échantillon A en violet. (C) Image microscopique des sections de mélange et d’atomisation de la buse microfluidique. Image de la réf.15. Barre d’échelle 100 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Contrôle environnemental de la grille et de la pulvérisation dans la boîte en verre acrylique. (A) Vue de l’avant et (B) du côté du TED. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Séquence d’exécution. (A) Exemple de séquence d’exécution montrant les variables en haut et la séquence de commandes en bas. Certaines des commandes clés sont annotées en rouge. (B) Position de la grille sur le cours temporel d’une « séquence d’exécution » représentée par une ligne continue noire. La position de départ de la grille est à 0 cm. La pulvérisation est initiée à t = 0 s pendant 2 s, la distance entre la pulvérisation et l’éthane liquide est d’environ 2 cm. À 1,5 s, la grille commence à se déplacer avec 2 m/s, à travers la pulvérisation et dans l’éthane liquide. La séquence se termine lorsque la pulvérisation s’arrête après 2 s. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Exemple de séquence d’exécution pour une expérience de mélange rapide. Les différences importantes par rapport à la figure 5 A sont annotées en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Résultats représentatifs d’une simple expérience de pulvérisation. (A) 3.5 Å reconstruction de l’apoferritine équine à partir d’une grille préparée en 36 ms entre la pulvérisation et la vitrification (EMD- 10533). (B) Image brute du même échantillon d’apoferritine. (C) Vue à faible grossissement de la grille, un carré de grille exemplaire contenant de la glace mince est mis en évidence par le rectangle bleu pointillé, la zone de glace mince dans ce carré de grille est indiquée par la flèche bleue. Les zones de glace épaisse ou de contamination sont indiquées par des astérisques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Résultats représentatifs d’une expérience de mélange. (A) Reconstruction consensuelle du complexe AM montré à un seuil élevé (coloré) et à un seuil bas (transparent). Une densité de myosine est étiquetée et mise en évidence par une ligne pointillée. La reconstruction a été générée à partir des données des deux points temporels combinés. (B) Classe F-actine ne montrant aucune liaison à la myosine. (C) Classe complexe AM montrant la myosine liée (myosine en gris, liée principalement à la sous-unité d’actine rouge clair). (D) Comparaison entre le modèle cinétique et les données expérimentales TrEM. La fraction du complexe AM par rapport à la concentration initiale est montrée. De grands points noirs pleins indiquent des données TrEM moyennes, de petits points indiquent des données TrEM par micrographie. La ligne pointillée violette représente le modèle cinétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

débit (μL/s) distance pulvérisation/éthane (cm) vitesse de plongée (m/s) délai (ms)
seringue 1 seringue 2 seringue 3
(AM) (ATP) (ATP)
7 ms 2.08 1.04 1.04 1.4 2 7
13 ms 1.04 0.52 0.52 2 1.6 13

Tableau 1 : Paramètres expérimentaux pour trEM de dissociation complexe AM par ATP

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Discussion

Les protocoles de ce travail peuvent être utilisés pour une préparation rapide de la grille par pulvérisation directe et expériences TrEM. La préparation rapide de la grille peut être utilisée pour réduire les interactions des particules avec l’interface air-eau5. Les principales limites sont la concentration d’échantillon disponible et l’épaisseur de glace sur la grille. Dans ces limites et à condition que la qualité de l’échantillon soit bonne, le protocole produit des grilles adaptées à la cryo-EM haute résolution.

Dépannage
Le débit de liquide et la vitesse du réseau déterminent la quantité de liquide déposée sur le réseau. Avec les réglages d’exemple donnés ci-dessus (débit de liquide 5 μL/s et vitesse de plongée 1-2 m/s), une bonne couverture de la grille avec des gouttelettes est attendue. Si la buse n’était pas bien alignée (de sorte que les gouttelettes de pulvérisation manquent la grille), les grilles gelées montrent très peu ou pas de gouttelettes.

La contamination des grilles ne peut être entièrement évitée (voir la figure 7C),mais peut être réduite en minimisant le temps d’exposition de l’éthane liquide à un environnement humide. Ceci est réalisé en préparant les grilles répliquées le plus rapidement possible (≤ 20 min pour 4 grilles). Nous préparons généralement 4 grilles avant de remplacer l’éthane liquide.

La glace vitreuse sur les grilles peut (partiellement) cristalliser si le refroidissement initial dans l’éthane liquide est trop lent. En accord avec une étude précédente22,nous avons constaté que de faibles vitesses de plongée (< 0,5 m/s) entraînent une augmentation de la glace cristalline. Les zones de glace très épaisse (≥ 200 nm) présentent généralement de la glace cristalline en raison d’un refroidissement intrinsèquement plus lent. Si la grille se réchauffe au cours de l’une des étapes suivant la préparation de la grille (transfert de l’éthane liquide à l’azote liquide, transfert au stockage, etc.),de la glace cristalline peut également se produire.

Acquisition de données pour les grilles préparées par TED
L’épaisseur moyenne de la glace produite par le TED est plus épaisse que la grille cryo-EM « idéale » préparée sur un système de buvard standard. L’épaisseur de la glace peut également varier d’une zone d’acquisition à l’autre. Cela signifie que les zones d’acquisition doivent être sélectionnées avec soin pour donner la glace la plus mince possible. La plage de mise au point peut devoir être ajustée pour obtenir des images à contraste élevé. Lorsque la glace est épaisse et que les particules ont un faible contraste, nous suggérons une acquisition initiale de données pilotes en utilisant des valeurs de défocalisation très élevées (3 à 5 μm). Des travaux récents suggèrent qu’une haute résolution peut encore être atteinte en utilisant des valeurs de défocalisation aussi élevées23.

Pour la collecte de données cryo-EM conventionnelle, un ensemble de données complet est souvent collecté à partir d’une seule grille. Cependant, nous avons trouvé utile la collecte de plusieurs petits ensembles de données et la fusion de ces ensembles de données. De cette façon, plusieurs points temporels peuvent être enregistrés dans un temps de microscope limité et les points temporels d’intérêt peuvent être identifiés.

Traitement et analyse des données TrEM
La fusion des ensembles de données peut être effectuée régulièrement dans la plupart des logiciels de traitement de données cryo-EM courants. Comme décrit ci-dessus et dans le travail d’autres personnes, la fusion d’ensembles de données à partir de points temporels distincts peut être utile17. Il est important que les particules puissent être retracées jusqu’à leur sous-ensemble d’origine (point temporel) tout au long du traitement.

Les mesures cinétiques conventionnelles (par exemple en utilisant la diffusion de la lumière ou la fluorescence) peuvent être un ajout précieux aux expériences TrEM. Les constantes de vitesse des mesures biochimiques peuvent être utilisées pour prédire les durées de vie de l’état d’intérêt intermédiaire ou pour confirmer la cinétique observée par TrEM. Pour une introduction de base à la cinétique de réaction et à leur relation avec les études structurales résolues dans le temps, voir réf.24.

Il existe un certain nombre de raisons possibles pour les différences entre TrEM et les expériences cinétiques conventionnelles. Comme le montre la figure 8D,les données TrEM peuvent montrer des variations significatives par micrographie. Nous notons également que les données préliminaires suggèrent une variabilité d’au moins 5% du nombre relatif de particules entre les grilles répliquées. La classification des particules (affectation de classe) peut être imparfaite, en particulier si les états sont structurellement similaires ou si une structure est très flexible. Les particules, et donc la cinétique dérivée de TrEM, pourraient également être influencées par les interactions des particules avec l’interface air-eau, car ces interactions sont réduites mais pas éliminées à des vitesses rapides.

Ce travail fournit quelques lignes directrices pour TrEM, mais nous notons qu’il s’agit d’un domaine de recherche actif, et nous prévoyons d’autres progrès à l’avenir. Bien que les expériences TrEM nécessitent un effort expérimental important, elles peuvent offrir un aperçu à haute résolution de la dynamique des complexes macromoléculaires.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Molly S.C. Gravett pour ses discussions utiles et le personnel de l’installation ABSL pour son aide à la collecte de données cryo-EM. David P. Klebl est doctorant dans le cadre du programme de doctorat de 4 ans du Wellcome Trust au Astbury Centre financé par l’Université de Leeds. Les microscopes FEI Titan Krios ont été financés par l’Université de Leeds (prix UoL ABSL) et Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Ce travail a été financé par une subvention du BBSRC à Stephen P. Muench (BB / P026397/1) et soutenu par des subventions de recherche à Howard D. White de l’American Heart Association (AMR21-236078) et Howard D. White et Vitold Galkin des National Institutes of Health des États-Unis (171261).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Time resolved device
acrylic glass box USA scientific
digital humidity/temperature controller THE20 digital humidity/temperature controller
dual rod pneumatic cylinder dual rod pneumatic cylinder TN 10x70
FEP tubing Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing
flangeless fittings Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings
flexible reinforced PVC tubing 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing
glass syringes Kloehn 250 µL zero-dead volume
humidifier pump Interpret Aqua Air AP3
liquid ethane container from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
multistage regulator GASARC class 3 multistage regulator
negative pressure tweezers Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers
oscilloscope Hantek 6022BE oscilloscope
PE tubing Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing
power supply Mean Well GSM160A24-R7B
power supply Wanptek KPS305D power supply
PU tubing SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing
regulator Norgren R72G-2GK-RMN
slide potentiometer PS100 slide potentiometer
solenoid valve SMC NVJ314M solenoid valve
syringe drive pumps Kloehn V6 48K model
Reagents & Materials
apoferritin from equine spleen Sigma-Aldrich, A3660
ATP Sigma-Aldrich, A2383
cryo-EM grids Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA Sigma Aldrich E3889
F-actin Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)
glow-discharger Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit
HEPES Sigma-Aldrich, H7006
KAc Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2 Sigma-Aldrich, M8266
MOPS Sigma-Aldrich, M1254
NaCl Sigma-Aldrich, S9888
Skeletal muscle myosin S1 Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)
Ref 1 Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).
Ref 2 White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  3. Dance, A. Molecular motion on ice. Nature Methods. , 1-5 (2020).
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  23. Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading. bioRxiv. , (2020).
  24. Bagshaw, C. A beginner's guide to flow kinetics. The Biochemist. 42, (2020).

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Biochimie numéro 177 cryo-EM préparation des échantillons résolution temporelle
Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle
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Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (177), e62199, doi:10.3791/62199 (2021).

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