Summary
Her gir vi en detaljert protokoll for bruk av en rask grid-lage enhet for både rask grid-making og for rask blanding og frysing for å gjennomføre tidsavklarte eksperimenter.
Abstract
Feltet kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) utvikler seg raskt med nye maskinvare- og prosesseringsalgoritmer, og produserer strukturer og informasjon med høyere oppløsning på mer utfordrende systemer. Prøvepreparering for cryo-EM gjennomgår en lignende revolusjon med nye tilnærminger som utvikles for å erstatte de tradisjonelle blottingssystemene. Disse inkluderer bruk av piezo-elektriske dispensere, pintrykk og direkte sprøyting. Som et resultat av denne utviklingen går hastigheten på nettforberedelsene fra sekunder til millisekunder, noe som gir nye muligheter, spesielt innen tidsavsluttet kryo-EM der proteiner og substrater raskt kan blandes før dykkfrysing, fanger kortvarige mellomliggende tilstander. Her beskriver vi i detalj en standardprotokoll for å lage rutenett på vår interne tidsavklarte EM-enhet både for standard rask nettforberedelse og også for tids løste eksperimenter. Protokollen krever minimum ca. 50 μL prøve ved konsentrasjoner på ≥ 2 mg/ml for fremstilling av 4 gitter. Forsinkelsen mellom prøveprogram og frysing kan være så lav som 10 ms. En begrensning er økt istykkelse ved raskere hastigheter og sammenlignet med blottingsmetoden. Vi håper denne protokollen vil hjelpe andre med å designe sine egne grid making enheter og de som er interessert i å designe tidsavklarte eksperimenter.
Introduction
Bakgrunn
Den siste tidens utvikling innen kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) har gjort det mulig å studere stadig mer komplekse systemer med høy oppløsning. Med få unntak har slike studier vært begrenset til biologiske makromolekyler ved likevekt1 eller relativt langsomme reaksjoner2. Mange prosesser in vivo forekommer på en raskere tidsskala (millisekunder), og det er økende interesse for tidsløst kryo-EM (TrEM) på disse tidsskalaene3. Imidlertid er konvensjonell kryo-EM prøvepreparering ved blottingsmetoden for treg for millisekunder TrEM.
Blotting-metoden har andre begrensninger i tillegg til dårlig tidsoppløsning. Proteiner og proteinkomplekser kan lide av denaturering eller foretrukket orientering på rutenett4. Reduksjon av eksponeringstiden for luftvannsgrensesnittet under prøvepreparering har vist seg å redusere foretrukket orientering og protein denaturering5,6. Dermed muliggjør rask nettforberedelse ikke bare millisekunder TrEM, men kan også forbedre rutenettkvaliteten.
For tiden er det tre forskjellige tilnærminger til automatisert nettforberedelse. Den første tilnærmingen bruker en pinne eller kapillær som inneholder en liten mengde prøve. Etter å ha etablert kontakt mellom væsken og rutenettoverflaten, blir prøven "skrevet" på rutenettet7,8. Prøvesøknadsprosessen er relativt langsom og tar noen sekunder. En alternativ tilnærming bruker kontrollert dråpegenerering av en piezo dispenser og selvtransporterende rutenett9. Dette gjør det mulig å fryse raskere til frysetider, men er fortsatt begrenset av dråpe- og fukttransporterende hastighet (når for øyeblikket 54 ms). Den raskeste tilnærmingen så langt er den direkte spraytilnærmingen, der prøven forstøvnes i en sprøytedyse og de små (~ 10 - 20 μm) og raske (> 5 m / s) dråper spredt ved kontakt med kryo-EM-rutenettet. Prøvesprayen kan genereres på forskjellige måter som airblast forstøvere, overflate akustiske bølger eller ultralyd luftfuktere10,11,12,13. Etter vår erfaring er istykkelsen med direkte sprøytingstilnærming større, men direkte sprøyting gjør det mulig å dispensere til frysetider < 10 ms.
Denne protokollen beskriver trinn for trinn hvordan en tidsavklart EM-enhet (TED) utstyrt med en mikrofluidisk sprøytedyse kan brukes til å klargjøre gitter på en rask tidsskala14,15. Enheten har blitt brukt til å klargjøre rutenett med en minimum forsinkelsestid på 6 ms mellom prøveapplikasjon og frysing og for raskt å blande og fryse to prøver. Utformingen av TED er basert på en tidligere versjon16 og ligner på andre spraybaserte tids løste cryo-EM-enheter17.
Først beskrives de fire hoveddelene av TED-oppsettet. Kjernen i TED er væskehåndteringsenheten, som er ansvarlig for prøveaspirasjon og dispensering. Et pneumatisk stempel beveger gitteret gjennom sprayen inn i det flytende etanet. Generering av sprayen oppnås med mikrofluidiske sprøytedyser og frysing gjøres i en flytende etanbeholder, som er beskrevet kort. Til slutt er tilleggsfunksjonene for å kontrollere rutenettmiljøet, spesielt fuktighet, uthevet. Dette etterfølges av detaljerte protokoller for driften av enheten og for å utføre TrEM-eksperimenter. Representative resultater gis for rask nettforberedelse og et enkelt TrEM-eksperiment.
Eksperimentelt oppsett
Væskehåndteringsenheten
Væskehåndteringssystemet til TED dannes av tre sprøytedrivpumper ('pumper 1 - 3'), hver utstyrt med en roterende ventil (figur 1). En strømforsyning gir pumper 1 - 3 med 24 V DC. Kommunikasjon med kontrollprogramvaren (skrevet i Visual Basic og C++) skjer via et RS232-grensesnitt for å pumpe 1. Kommandoene fordeles gjennom de serielle I/U-ekspansjonsportene fra pumpe 1 til pumpe 2-3. Pumper 1-3 er utstyrt med glasssprøyter ('sprøyter 1-3', vi bruker 250 μL / null døde volumsprøyter her). Hver ventil har to posisjoner, "last" og "dispenser". "Last"-posisjonen brukes til å aspirere prøven inn i sprøyten. Et kort stykke (~ 3 - 4 cm) av 1/16" O.D., 0.01′′ I.D. FEP-rør er koblet via ETFE/ETFE flensfrie beslag til 'last' posisjon av ventiler 1-3. Dette korte slangestykket når inn i prøvebeholderen (vanligvis et 1,5 ml eller 0,5 ml plastrør). "Dispenser"-posisjonen fører til sprøytedysen. Forbindelsen mellom "dispenser"-uttaket og sprøytedysen er laget av PE-rør (~ 20-30 cm lengde, 0,043" O.D., 0,015" I.D.), med et kort stykke ermerør (~ 0,5 cm) og ETFE/ETFE flensfrie beslag.
Det pneumatiske stempelet
TED bruker et pneumatisk stempel for å akselerere rutenettet og flytte det gjennom prøvesprayen inn i den flytende etanbeholderen. Pinsett med negativt trykk holder gitteret, skrudd inn i en hjemmebygd holder som er montert på en tostang pneumatisk sylinder (Figur 2A).
Trykket leveres fra en stor nitrogengassflaske (størrelse W), utstyrt med en flertrinnsregulator (0 - 10 bar, 'hovedtrykk'). Fleksible forsterkede PVC-rør (12 mm O.D.) kobler regulatoren til en 12-porters manifold der trykksatt nitrogen leveres til dysen og det pneumatiske stempelet. Gassstrømmen gjennom dysen er konstant, regulert direkte ved nitrogenflasken (hovedtrykket). Tilkoblingen til munnstykket er laget med PU-rør (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), et kort stykke PE-rør (~ 8 cm lengde, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) og passende kontakter. Trykket på det pneumatiske stempelet styres gjennom en magnetventil. PU-slangen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) kobler magnetventilen til en regulator og det pneumatiske stempelet, slik at det blir redusert dykktrykk (≤ hovedtrykk). Magnetventilen er datastyrt. En skjematisk oversikt over oppsettet er angitt i Figur 2B.
Vær oppmerksom på at med dette oppsettet er stupetrykket alltid like eller mindre enn sprøytegasstrykket (hovedtrykket). Oppsettet kan imidlertid enkelt endres ved å inkorporere en annen regulator oppstrøms spraydysen for å tillate høyere stupehastigheter ved lavt sprøytegasstrykk. Høyt trykk (>> 2 bar) kan skade PDMS-sprøytedysen.
FORSIKTIG: Dette er et trykksystem, og "hovedtrykket" skal alltid være < 7 bar.
Trykk mellom 0,5 og 2 bar brukes vanligvis til det pneumatiske stempelet og viser en omtrent lineær sammenheng mellom trykk og hastighet (i sprayens vertikale posisjon). Dykkhastigheter måles med et oscilloskop, koblet i tråd med et skyv potensiometer (10 kΩ) og parallelt med en 2 kΩ motstand (Figur 2C). En strømforsyning gir potensiometeret 9 V DC. Mens den omtrentlige stupehastigheten stilles inn før eksperimentet ved å stille inn stupetrykket, gir potensiometeret en presis avlesning av hastigheten etter eksperimentet.
Spraydyser og flytende etanbeholder
Fabrikasjon og drift av gass-dynamiske virtuelle dyser for spraybasert prøvelevering er beskrevet andre steder i detalj15. Som beskrevet ovenfor er "dispenser"-uttakene til ventilene 1-3 koblet til dysens flytende innløp (figur 3A). Trykkspraygassen er koblet til dysens gassinntak. Innløpene i PDMS-sprøytedysene er slik at 0,043" O.D. PE-rør kan brukes direkte uten behov for beslag. Vår dysedesign inneholder en "jet-in-jet" geometri for blanding av to prøver, som ligner på enheten beskrevet i ref.18. Et skjema av utformingen vises i figur 3B, et mikroskopisk bilde av en dyse vises i figur 3C. Utformingen av den mikrofluidiske enheten krever bruk av tre sprøyter for å blande to prøver. Sprøytemunnstykket er vanligvis plassert i 1-1,5 cm avstand fra gitteret (under prøvebruk).
Vi bruker flytende etan som kryogen, i en flytende etan/nitrogenbeholder som brukes til standard blotting-metoden. Vertikal posisjonering av væske etankoppen oppnås med en laboratorieløfteplattform.
Kontroll av spray- og rutenettmiljøet
Stempelet og sprøytemunnstykket finnes i en spesialbygd PMMA-boks (akrylglass) med en dobbel dør (figur 4A). Høy relativ luftfuktighet inne i esken oppnås ved et luftfuktingssystem på baksiden av TED (Figur 4B). Luft leveres av en pumpe og mates inn i en første 10" beholder (vanligvis brukt til rensing av synkevann). Beholderen er fylt med et lavt (~ 5-10 cm) vannnivå og huser også en luftfukterenhet. Nettstrømmen til luftfukteren styres av en digital fuktighets-/temperaturregulator og en fuktighets-/temperatursensor plassert inne i akrylglassboksen. Kontrolleren er satt til å slå av pumpen når den relative luftfuktigheten når ≥ 90 %. Fuktet luft fra den første beholderen pumpes gjennom en diffusor, nedsenket i vann i en annen 10" beholder og går deretter inn i akrylglassboksen.
FORSIKTIG: Fordi prøven er aerosolisert i sprøytedysen, er ikke farlige biologiske eller kjemiske prøver egnet som prøver.
Kjøresekvensen
Kjør skript-knappen i kontrollprogramvaren starter kjøresekvensen. Denne sekvensen med kommandoer kan forhåndsdeponeres i en skriptfil og endres gjennom programvaren. De viktigste variablene er forklart her:
Sprayhastighet: Sprayhastigheten bestemmer væskestrømningshastigheten som brukes av sprøytepumpen. Strømningshastigheten kan beregnes på følgende måte: Sprøytepumpemotorene som brukes her har en fast trinnstørrelse. Hele pumpens rekkevidde er delt inn i 48 000 trinn. Den andre viktige faktoren er sprøytevolumet. Vi bruker vanligvis 250 μL sprøyter. Sprayhastigheten i kontrollprogramvaren er angitt som antall trinn / sekund. En sprayhastighet på 1000 trinn/sekund tilsvarer:
Sprøytevolum: Sprayvolumet bestemmer det totale volumet som skal sprøytes. Dermed bestemmer det også varigheten av sprayen. Sprayvolumet i kontrollprogramvaren er angitt som en rekke trinn. Et sprøytevolum på 2000 trinn, med en sprayhastighet på 1000 trinn / sekund, fører til en sprayvarighet på 2 s og et totalt volum på 10,4 μL.
Pre-spray tid: Denne variabelen definerer tiden mellom initiering av spray og dykk. Det er viktig å velge forsinkelsestiden slik at sprayen har tilstrekkelig tid til å stabilisere seg før du stuper rutenettet. Vanligvis får sprayen 1,5 - 4 s for å stabilisere seg før gitteret stupes. Sprayen opprettholdes til gitteret har beveget seg gjennom. Vanligvis stoppes væskestrømmen (og derfor sprayen) 0,5 til 1 s etter at gitteret er stupt. Ved hjelp av en sprayhastighet på 1000 trinn / s og et sprøytevolum på 2000 trinn, er en typisk forspraytid for eksempel 1,5 s.
En eksemplarisk sekvens med kommandoer vises i Figur 5A, rutenettposisjonen over tid er illustrert i Figur 5B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av systemet
MERK: Følgende protokoll beskriver hvordan du klargjør rutenett for en enkelt prøve. Vanligvis forberedes minst 2 replikeringsrutenett for hver prøve eller betingelse. For raskere lave hastigheter (mindre enn ~ 20 ms tidsforsinkelse), er 3 eller 4 replikeringsgitter vanligvis forberedt på å ta hensyn til et redusert antall tynne isområder.
- Fortynn proteinprøven til målkonsentrasjonen i ønsket buffer. Vanligvis fungerer endelige konsentrasjoner ≥ 2 mg / ml godt for nettforberedelse med TED. Vær oppmerksom på at prøven kan holdes på is til trinn 10, fra trinn 10 og utover vil prøven bruke betydelig tid ved romtemperatur, da det tar omtrent 20 minutter å forberede 3-4 gitter.
- Slå på TED. Slå deretter på kontroll-PCen og start kontrollprogramvaren.
- Initialiser alle sprøytepumper ved å trykke på Initialize-knappen (nedre svart knapp) på hver sprøytepumpe.
- Slå på potensiometerets strømforsyning, sett den til 9 V og start oscilloskopkontrollprogramvaren.
- Påse at regulatorventilen til N2-sylinderener lukket. Åpne sylinderventilen. Åpne deretter regulatorventilen langsomt og sett utløpstrykket til ønsket verdi for spraygasstrykket (vanligvis 1-2 bar). For PDMS-dysene som brukes her, må du ikke bruke trykk som er høyere enn ~ 2,5 bar for å unngå skade på dysen. Den kontinuerlig flytende gassen forhindrer væske i å dryppe og akkumuleres på dysespissen, noe som kan føre til uopprettelig sprøyting.
- Kontroller at alle sprøytepumpeventiler er i "last"-stilling. Dette kan gjøres ved å bytte alle ventiler til "dispenser" -posisjonen i kontrollprogramvaren og deretter tilbake til "last". La alle ventiler være byttet til "last". Sett alle sprøyter til null.
- Fjern eventuelle luftbobler som finnes i systemet på dette stadiet. For å gjøre dette kan det hende at sprøytene må skrus av, bobler fjernes manuelt og sprøytene monteres igjen når de ikke inneholder flere bobler.
- Væskehåndteringskomponentene lagres vanligvis i H2O. Før du laster inn prøveløsningen, likevekter væskesystemet med buffer ved å vaske slangen med et overskudd av buffer. Bruk en passende maksimal væskestrømningshastighet for å unngå overtrykk på sprøytedysen. Væskemengder > 10 μL/s kan forårsake skade på PDMS-dysene som er beskrevet her.
- Plasser et 1,5 ml rør som inneholder ≥ 200 μL buffer på sprøyte 1 (toppen må gjennombores for å festes til slangen).
- Kontroller at ventil 1 er i "last"-stilling. Bytt om nødvendig inn kontrollprogramvaren.
- Aspirer ønsket mengde (vanligvis 50-100 μL) buffer med sprøyte 1, gjennom kontrollprogramvaren.
- Bytt ventil 1 til "dispenser"-stilling gjennom kontrollprogramvaren.
- Dispenser all væsken i sprøyte 1, gjennom kontrollprogramvaren.
- Returner ventilen til 'last', tilbakestill sprøyteposisjonen til '0' i programmet og trykk på initialiser på sprøyte 1 for å klargjøre systemet for neste syklus.
MERK: Trinn 1.9.1 - 1.9.5 gjentas vanligvis tre ganger for å sikre grundig vasking av slangen.
- Last pinsett med et EM-rutenett (ingen krav til noen bestemt type) ved å løsne den dype armklemmen, plassere pinsettene i klemmen og stramme klemmen.
- Beveg stempelarmen manuelt slik at gitteret og dysen er i samme høyde ('prøveapplikasjonsposisjon'). Hvis munnstykket og gitteret er justert, vil væske akkumuleres på rutenettet etter sprøyting i en lengre periode. Juster om nødvendig dyseposisjonen.
- Juster posisjonen til den flytende etankoppen ved å flytte den dype armen manuelt med montert pinsett til endeposisjonen (nå inn i etankoppen). Når det er satt opp riktig, vil et rutenett holdt av pinsettene nå omtrent midten av den flytende etankoppen.
- Kontroller at kjør-skriptet vil bruke de ønskede flythastighetene, volumene og tidsberegningene. Se avsnittet «Løpesekvensen» ovenfor for mer informasjon.
- Pass på at ingenting hindrer stempelets vei. Aspirer buffervolumet som kreves for en enkelt innkjøring i sprøyte 1. Dette gjøres i kontrollprogramvaren, se avsnittet 'Kjøresekvensen' for typiske innstillinger og volumer. Kontroller deretter at ventil 1 er byttet til "dispenser"-stilling. Utfør en testkjøring ved å trykke Kjør skript i kontrollprogramvaren.
FORSIKTIG: Hold deg unna TED til løpesekvensen er ferdig. Bevegelige deler kan forårsake skade! - Når "løpesekvensen" er ferdig, setter du trykket på den stupte armen til ønsket verdi (vanligvis 1-2 bar). Trykk først på OK i kontrollprogramvaren for å frigjøre trykket fra den stupe armen. Hvis "løpesekvensen" eller trykket på stempelarmen må justeres, kan disse innstillingene endres på dette stadiet og trinn 1,13 - 1,15 gjentas.
2. Rask nettforberedelse
- Fyll den flytende etan-/nitrogenbeholderen først med flytende nitrogen. Når det er tilstrekkelig kaldt og fritt for flytende nitrogen, fyll koppen med flytende etan. Unngå størkning av det flytende etanet. Dette trinnet er det samme som for konvensjonelle nettforberedelser.
MERK: For å minimere etanforurensning må du sørge for at trinn 2.2 - 2.13 utføres så raskt som mulig
FORSIKTIG: Flytende etan er et kryoogent og brannfarlig. Det må utvises forsiktighet ved håndtering. - Forbered kryo-EM-gitter for glødutladning. Vi bruker vanligvis hullholdige karbongitter og glødeutslipp i 90 s, ved 0,1 mbar lufttrykk og 10 mA. Vanligvis er ikke mer enn 4 rutenett glød utladet om gangen. Gitteret brukes innen 30 minutter etter glødutladning.
- Likevekt slangen med prøve (ved å følge trinn 1.9.1 - 1.9.5, ved hjelp av prøve i stedet for buffer). Hvis det tilgjengelige prøvevolumet er lavt, kan slangen likevektes med bare 1 dødt volum.
- Aspirer mengden prøve som er nødvendig for en enkelt sprøyte 1 i kontrollprogramvaren (se avsnittet 'Løpesekvensen' for detaljer). Sett deretter ventil 1 i "dispenser"-stilling.
- Kontroller at den relative luftfuktigheten har nådd ønsket verdi (vi forbereder vanligvis gitter ved 60 % relativ fuktighet eller høyere). Når ≥ 60 % fuktighet er nådd, åpner du fuktighetskammeret bare i minimal tid for å opprettholde høy luftfuktighet.
- Plasser pinsettene, hold et glødutladet rutenett, i det pneumatiske stempelet og fest dem. Flytt stempelet til startposisjonen (øverst).
- Pass på at glidebryteren til potensiometeret er i startposisjon, klar for målingen, ved å flytte den manuelt for å kontakte stempelet. Sett avtrekkeren på oscilloskopet i oscilloskopprogramvaren.
- Plasser den flytende etan-/nitrogenbeholderen.
- Trykk Kjør skript i kontrollprogramvaren. Når du blir bedt om det, klikker du OK i kontrollprogramvaren for å starte kjøringen.
FORSIKTIG: Hold deg unna TED til løpesekvensen er ferdig. Bevegelige deler kan forårsake skade! - Når "kjøresekvensen" er fullført, slipper du trykket på det pneumatiske stempelet ved å klikke OK i kontrollprogramvaren.
- Åpne fuktighetskammeret, løsne forbindelsen mellom stupearm og pinsett med den ene hånden mens du fester pinsettene med den andre. Når pinsettene er frie, flytt den stupende armen opp mens du holder rutenettet i det flytende etanet. Overfør deretter nettet til lagringsplassen i den omkringliggende væsken N2. Etter frysing må gitteret holdes ved flytende N2-temperatur til enhver tid.
- Lagre oscilloskopmålingen. Tilbakestill posisjonen til potensiometerglidebryteren og stempelet manuelt etterpå.
- Gjenta trinn 2.4-2.12 for å klargjøre replikering av rutenett
- Overfør rutenettene til langtidslagring til rutenettutklipp og datainnsamling.
- Vask systemet med buffer, i henhold til trinn 1.9.1 - 1.9.5. Vask deretter systemet med H2O, i henhold til trinn 1.9.1 - 1.9.5.
- Slå av hovedregulatoren for nitrogengass og slå av strømmen.
- Plasser etan-/nitrogenbeholderen i en avtrekkshette for å la den varme opp og la væskeet etan og N2 fordampe.
3. Tidsavklart kryo-EM
MERK: Når tids løste eksperimenter utføres med TED, er det flere aspekter som må vurderes, selv om det grunnleggende oppsettet og variablene forblir de samme. Det antas her at to løsninger blandes i et 1: 1 (v / v) forhold for å produsere den endelige blandingen som er avsatt på rutenettet. Følg protokollen som er beskrevet i '1. Rask nettforberedelse med TED', med følgende endringer:
- Bruk høyere lagerkonsentrasjoner for blanding av eksperimenter enn for enkle sprayeksperimenter. Blanding i forholdet 1:1 (v/v) vil resultere i en 2x fortynning av hver komponent.
- For et raskt blandeeksperiment, bruk alle tre sprøytene i stedet for bare en enkelt.
- Fest slangen til sprøytepumpene 2-3.
- Fest slangen fra sprøytepumpene 2-3 til sprøytedysen.
- Likevekt alle tre sprøytene i buffer og prøve separat. Sprøyte 1 er vanligvis fylt med prøve A og sprøyter 2-3 er fylt med prøve B (figur 3).
- Endre kjøresekvensen. Et eksempel på en løpesekvens som bruker alle de 3 sprøytene til et hurtigblandingseksperiment, er angitt i figur 6. Se også avsnittet «Løpesekvensen» for mer informasjon.
- Ulike tidsforsinkelser kan oppnås på to måter:
- Endre stempelhastigheten. Ved å justere stempelhastigheten kan tidsforsinkelsen endres i et relativt smalt område. For eksempel, med en spray / etanavstand på 2 cm, kan stempelet flyttes ved henholdsvis 1 m / s eller 2 m / s for å gi en tidsforsinkelse på henholdsvis 20 ms eller 10 ms. Dette gjøres som beskrevet i trinn 1.15.
- Endre spray-/etanposisjonen ved å justere (vertikal) posisjonen til sprøytemunnstykket. Hvis dysen er plassert i en 5 cm avstand fra etanoverflaten, for eksempel, gir en dykkhastighet på 1 m / s en tidsforsinkelse på 50 ms. Å oppnå betydelig lengre tidsforsinkelser krever ytterligere endringer i oppsettet.
MERK: På grunn av laminær strømning i dysens strømningsfokusområde, forventer vi ikke betydelig blanding i denne delen av dysen. I stedet forventer vi at blanding skjer under sprøytegenerering, i dråper på vei til rutenettet og under dråpespredning på rutenettet. Flytiden for spraydråper for å nå rutenettet er estimert ≤ 1 ms (for en dråpehastighet på ≥ 10 m / s og en dyse-rutenettavstand på 1 cm). Dermed er bare tiden mellom dråpelanding og vitrifisering ansett som "tidsforsinkelsen".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rask nettforberedelse med TED
Som en testprøve for rask nettforberedelse har vi brukt apoferritin fra heste milt ved 20 μM i 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. En rekonstruksjon ved 3.5 Å resolusjon ble innhentet fra 690 mikrografer som beskrevet i ref.15 (Figur 7A). Defokusområdet ble valgt slik at partikler lett kan identifiseres i raw-bildene (Figur 7B). Et typisk rutenett utarbeidet med en tidsforsinkelse på 10-40 ms viser tilstrekkelige områder med tynn is (figur 7C) for å tillate innsamling av > 1000 mikrografer. Den resulterende oppløsningen er sannsynligvis begrenset av istykkelse, tomografisk analyse av en rekke forskjellige rutenett viste 96 ± 33 nm istykkelse6.
Tidsavklart kryo-EM
For å demonstrere rask blanding og tidsoppløsning ved hjelp av TED, har vi brukt dissosiasjon av actomyosin-komplekset ved å blande med ATP som en modellreaksjon19. Dette valget var basert på det enkle skillet mellom actomyosin og fri F-aktin fra rå mikrografer og reaksjonens godt forståtte kinetikk.
I det følgende vises de representative resultatene for TrEM for dissosiasjon av actomyosin-komplekset av ATP. Detaljerte eksperimentelle prosedyrer og resultater er gitt i ref.19. Kort sagt, F-aktin og kanin skjelett myosin S1 ble blandet i 10 mM MOPS, 50 mM KAc, 2 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, pH 7 ved endelige monomerkonsentrasjoner på 40 μM for å forberede actomyosin (AM) komplekset. AM-komplekset ble lastet inn i sprøyte 1 og 200 μM MgATP i samme buffer ble lastet inn i sprøyter 2 og 3. De viktigste eksperimentelle parameterne for de to ulike tidspunktene som er utarbeidet, er oppført i tabell 1.
For begge tidspunktene var resultatet en 1:1 v/v-blanding av AM-kompleks og MgATP, noe som ga endelige konsentrasjoner på 20 μM AM-kompleks og 100 μM MgATP. Beregnet blanding til frysetider var 7 og 13 ms som vist i tabell 1. Den estimerte flytiden for sprøytedråpene mellom dyse og rutenett ble < 1 ms.
Et lite cryo-EM-datasett (306 og 123 mikrografer) ble anskaffet for hvert tidspunkt og de kombinerte dataene behandlet ved hjelp av standard spiralformede prosesseringsprosedyrer20. Den resulterende konsensusrekonstruksjonen (begge tidspunktene til sammen) er vist i figur 8A. De kombinerte dataene ble deretter utsatt for fokusert klassifisering og delt inn i en AM-kompleks og en F-aktinklasse (Figur 8B, C). Deretter ble brøkdelen av AM-komplekse eller F-aktinpartikler for hvert tidspunkt beregnet og vises i figur 8D.
Den andre ordresatsen konstant for AM-kompleks dissosiasjon er 1,5 · 106 M-1 s-1 21. Under forutsetning av at
den integrerte takstloven kan tilnærmes til:
Der [AM-kompleks] er den tidsavhengige konsentrasjonen av AM-kompleks, [AM-kompleks]0 er den første konsentrasjonen, er k den andre ordrehastigheten konstant og [ATP]0 er den (første) ATP-konsentrasjonen.
Ved hjelp av denne ligningen ble kinetikken til AM-kompleks dissosiasjon modellert. Modellen er rimelig enig med de eksperimentelle TrEM-dataene. Det er signifikant variasjon per mikrograf som vist i figur 8D.
Figur 1: Den tidsavklarte EM-enheten (TED). (A) Oversikt over TED. (B) Væskehåndteringsenheten med pumper 1-3. Den fjerde pumpen til venstre brukes ikke i dette arbeidet. Last- og dispenseringsposisjoner er angitt for ventil 1, og det samme er prøvereservoaret ('prøve 1'). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Pneumatisk stempel og lineært potensiometer. (A) Detaljer om det pneumatiske stempelet på TED med viktige komponenter merket. (B) Skjematisk for det pneumatiske systemet til TED. Tallene tilsvarer N2-sylinderen (1), hovedtrykkregulatoren (2), sprøytedysen (3), magnetventilen (4), stempelhastighetsregulatoren (5) og den doble stangpneumatiske sylinderen (6). (C) Skjematisk for kretsen for potensiometeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gass-dynamiske virtuelle dyser for blanding og sprøyting. (A) En dyse med 4 innløpsrør tilkoblet, for å levere til prøver (A og B) og N2 gass. (B) Skjematisk for den sentrale delen av PDMS-sprøytedysene med dobbel strømningsfokuseringsgeometri for å oppnå strømningsfokus (for nedstrøms blanding) og gassfokusering eller forstøvning. Prøve B vises i gult og prøve A i lilla. (C) Mikroskopisk bilde av blandings- og forstøvningsdelene i mikrofluiddysen. Bilde fra ref.15. Vektstang 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Miljøkontroll av gitter og spray i akrylglassboksen. (A) Utsikt fra forsiden og (B) fra siden av TED. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Løpesekvensen. (A) En eksempelsekvens som viser variabler øverst og kommandosekvensen nederst. Noen av tastekommandoene er kommentert med rødt. (B) Rutenettposisjon over tidsforløpet for en "løpesekvens" vist som en svart heltrukket linje. Startposisjonen til rutenettet er på 0 cm. Spray startes ved t = 0 s i 2 s, avstanden mellom spray og flytende etan er ~ 2 cm. Ved 1,5 s begynner rutenettet å bevege seg med 2 m / s, gjennom sprayen og inn i væskeet etan. Sekvensen slutter når sprayen stopper etter 2 s. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempel på løpesekvens for et hurtigblandingseksperiment. Viktige forskjeller i figur 5 A er kommentert i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representativt resultat fra et enkelt sprayeksperiment. (A) 3.5 Å rekonstruksjon av hesteaperritin fra et gitter fremstilt i 36 ms mellom sprøyting og vitrifisering (EMD- 10533). (B) Rå bilde av samme apferritinprøve. (C) Lav forstørrelsesvisning av rutenettet, en eksemplarisk rutenett-firkant som inneholder tynn is er uthevet av det stiplede blå rektangelet, området med tynn is i denne rutenettplassen er indikert med den blå pilen. Områder med tykk is eller forurensning er indikert med stjerner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Representative resultater fra et blandingseksperiment. (A) Konsensusrekonstruksjon av AM-komplekset vist ved høy terskel (farget) og lav terskel (gjennomsiktig). En myosintetthet er merket og uthevet med en stiplet linje. Rekonstruksjonen ble generert fra data fra begge tidspunktene til sammen. (B) F-aktin klasse som viser ingen myosin bundet. (C) AM-kompleks klasse som viser myosin bundet (myosin i grått, hovedsakelig bundet til den lyse røde aktinunderenheten). (D) Sammenligning mellom kinetisk modell og eksperimentelle TrEM-data. Vist er brøkdelen av AM-kompleks i forhold til den opprinnelige konsentrasjonen. Store heldekkende svarte prikker angir gjennomsnittlige TrEM-data, små prikker viser TrEM-data per mikrograf. Den lilla stiplede linjen representerer den kinetiske modellen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| strømningshastighet (μL/s) | spray/etanavstand (cm) | dykkhastighet (m/s) | tidsforsinkelse (ms) | |||
| sprøyte 1 | sprøyte 2 | sprøyte 3 | ||||
| (AM) | (ATP) | (ATP) | ||||
| 7 ms | 2.08 | 1.04 | 1.04 | 1.4 | 2 | 7 |
| 13 ms | 1.04 | 0.52 | 0.52 | 2 | 1.6 | 13 |
Tabell 1: Eksperimentelle innstillinger for TrEM av AM kompleks dissosiasjon av ATP
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene i dette arbeidet kan brukes til rask nettforberedelse ved direkte sprøyting og TrEM-eksperimenter. Rask nettforberedelse kan brukes til å redusere partikkelinteraksjoner med luftvanngrensesnittet5. Hovedbegrensningene er tilgjengelig prøvekonsentrasjon og istykkelse på rutenettet. Innenfor disse grensene og forutsatt at prøvekvaliteten er god, produserer protokollen rutenett som passer for høyoppløselig kryo-EM.
Feilsøking
Flytende strømningshastighet og netthastighet bestemmer mengden væske som avsettes på nettet. Med eksempelinnstillingene gitt ovenfor (flytende strømningshastighet 5 μL / s og stupehastighet 1-2 m / s), forventes en god dekning av rutenettet med dråper. Hvis dysen ikke var justert godt (så spraydråper savner rutenettet), viser frosne rutenett svært få eller ingen dråper.
Kontaminering av gitter kan ikke unngås helt (se figur 7C), men kan reduseres ved å minimere eksponeringstiden for flytende etan til fuktige omgivelser. Dette oppnås ved å forberede replikeringsgitter så raskt som mulig (≤ 20 min for 4 rutenett). Vi tilbereder vanligvis 4 gitter før vi bytter ut det flytende etanet.
Glassaktig is på gitter kan (delvis) krystalliseres hvis den første kjølingen i flytende etan er for langsom. I samråd med en tidligere studie22har vi funnet lave fallhastigheter (< 0,5 m/s) som fører til en økning av krystallinsk is. Områder med veldig tykk is (≥ 200 nm) viser vanligvis krystallinsk is på grunn av iboende langsommere kjøling. Hvis gitteret varmes opp under noen av trinnene etter nettforberedelse (overføring fra flytende etan til flytende nitrogen, overføring til lagring, etc.) kan det også oppstå krystallinsk is.
Datainnsamling for TED-forberedte nett
Den gjennomsnittlige istykkelsen produsert av TED er tykkere enn det "ideelle" cryo-EM-rutenettet tilberedt på et standard blottingssystem. Istykkelsen kan også variere mellom oppkjøpsområder. Dette betyr at oppkjøpsområder må velges nøye for å gi den tynneste mulige isen. Defokusområdet må kanskje justeres for å få bilder med høy kontrast. Når isen er tykk og partiklene har lav kontrast, foreslår vi en innledende pilotdatainnhenting ved hjelp av svært høye defokusverdier (3 - 5 μm). Nyere arbeid tyder på at høy oppløsning fortsatt kan oppnås ved hjelp av så høye defokusverdier23.
For konvensjonell kryo-EM-datainnsamling samles et helt datasett ofte inn fra et enkelt rutenett. Vi har imidlertid funnet samlingen av flere små datasett og sammenslåing av disse datasettene nyttige. På denne måten kan flere tidspunkter registreres innen begrenset mikroskoptid, og tidspunkter av interesse kan identifiseres.
Behandling og analyse av TrEM-data
Sammenslåing av datasett kan rutinemessig gjøres i de vanligste cryo-EM-databehandlingsprogramvarene. Som beskrevet ovenfor og i andres arbeid, kan sammenslåing av datasett fra separate tidspunkter være nyttig17. Det er viktig at partikler kan spores tilbake til sitt opprinnelige delsett (tidspunkt) gjennom hele behandlingen.
Konvensjonelle kinetiske målinger (for eksempel ved hjelp av lysspredning eller fluorescens) kan være et verdifullt tillegg til TrEM-eksperimenter. Ratekonstanter fra biokjemiske målinger kan brukes til å forutsi levetiden til mellomliggende interessetilstand, eller for å bekrefte kinetikken observert av TrEM. For en grunnleggende innføring i reaksjonskinetikk og deres forhold til tidsavklarte strukturelle studier, se ref.24.
Det er en rekke mulige årsaker til forskjeller mellom TrEM og konvensjonelle kinetiske eksperimenter. Som vist i figur 8Dkan TrEM-data vise signifikante variasjoner per mikrograf. Vi merker også at foreløpige data antyder minst 5% variasjon i relative partikkeltall mellom replikeringsgitter. Partikkelklassifisering (klasseoppgave) kan være ufullkommen, spesielt hvis tilstandene er strukturelt like eller hvis en struktur er svært fleksibel. Partikler, og dermed TrEM-avledede kinetikker, kan også påvirkes av partikkelinteraksjoner med luftvannsgrensesnittet fordi slike interaksjoner reduseres, men ikke elimineres ved høye hastigheter.
Dette arbeidet gir noen retningslinjer for TrEM, men vi merker oss at dette er et aktivt forskningsområde, og vi forventer ytterligere fremskritt i fremtiden. Mens TrEM-eksperimenter krever betydelig eksperimentell innsats, kan de tilby høyoppløselig innsikt i dynamikken i makromolekylære komplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vil takke Molly S.C. Gravett for nyttige diskusjoner og ABSL-anleggets ansatte for hjelp med cryo-EM-datainnsamling. David P. Klebl er stipendiat ved Wellcome Trust 4-årig ph.d.-program i Astbury-senteret finansiert av University of Leeds. FEI Titan Krios mikroskoper ble finansiert av University of Leeds (UoL ABSL award) og Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Dette arbeidet ble finansiert av et BBSRC-tilskudd til Stephen P. Muench (BB/P026397/1) og støttet av forskningsstipend til Howard D. White fra American Heart Association (AMR21-236078) og Howard D. White og Vitold Galkin fra U.S. National Institutes of Health (171261).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10x70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
References
- Murphy, B. J., et al. Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling. Science. 364, (2019).
- Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH. Nature. , 1-4 (2020).
- Dance, A. Molecular motion on ice. Nature Methods. , 1-5 (2020).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15, 793-795 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales. BioRxiv. , (2020).
- Ravelli, R. B., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11, 1-9 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM. Structure. 25, 663-670 (2017).
- Ashtiani, D., et al. Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation. Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11, 1-14 (2020).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, (2019).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).
- White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Protein Complex Assembly. , Springer. 59-71 (2018).
- Trebbin, M., et al. Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions. Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).
- Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).
- He, S., Scheres, S. H. Helical reconstruction in RELION. Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).
- Millar, N. C., Geeves, M. A. The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1. FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).
- Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging. Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).
- Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading. bioRxiv. , (2020).
- Bagshaw, C. A beginner's guide to flow kinetics. The Biochemist. 42, (2020).
