Summary
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'uso di un dispositivo di creazione rapida della griglia sia per la creazione rapida della griglia che per la miscelazione e il congelamento rapidi per condurre esperimenti risolti nel tempo.
Abstract
Il campo della microscopia crioeletletnica (cryo-EM) si sta rapidamente sviluppando con nuovi hardware e algoritmi di elaborazione, producendo strutture a risoluzione più elevata e informazioni su sistemi più impegnativi. La preparazione dei campioni per la crio-EM sta subendo una rivoluzione simile con nuovi approcci in fase di sviluppo per sostituire i tradizionali sistemi di blotting. Questi includono l'uso di distributori piezoelettrici, la stampa a spillo e la spruzzatura diretta. Come risultato di questi sviluppi, la velocità di preparazione della griglia sta passando da secondi a millisecondi, offrendo nuove opportunità, specialmente nel campo della crio-EM risolta nel tempo in cui proteine e substrati possono essere rapidamente miscelati prima del congelamento a immersione, intrappolando stati intermedi di breve durata. Qui descriviamo, in dettaglio, un protocollo standard per la realizzazione di griglie sul nostro dispositivo EM interno con risoluzione temporale sia per la preparazione della griglia veloce standard che per gli esperimenti risolti nel tempo. Il protocollo richiede un minimo di circa 50 μL di campione a concentrazioni di ≥ 2 mg/mL per la preparazione di 4 griglie. Il ritardo tra l'applicazione del campione e il congelamento può essere di appena 10 ms. Una limitazione è l'aumento dello spessore del ghiaccio a velocità più elevate e rispetto al metodo di blotting. Speriamo che questo protocollo aiuti gli altri a progettare i propri dispositivi per la creazione di griglie e coloro che sono interessati a progettare esperimenti risolti nel tempo.
Introduction
Sfondo
I recenti sviluppi della microscopia crioeletletnica (cryo-EM) hanno permesso studi strutturali di sistemi sempre più complessi ad alta risoluzione. Con poche eccezioni, tali studi sono stati limitati a macromolecole biologiche all'equilibrio1 o reazioni relativamente lente2. Molti processi in vivo avvengono su una scala temporale più veloce (millisecondi) e c'è un crescente interesse per la crio-EM risolta nel tempo (TrEM) su queste scale temporali3. Tuttavia, la preparazione convenzionale del campione crio-EM con il metodo di blotting è troppo lenta per il millisecondo TrEM.
Il metodo di blotting ha altre limitazioni oltre alla scarsa risoluzione temporale. Le proteine e i complessi proteici possono soffrire di denaturazione o orientamento preferito sulle griglie4. La riduzione del tempo di esposizione all'interfaccia aria-acqua durante la preparazione del campione ha dimostrato di mitigare l'orientamento preferito e la denaturazione delle proteine5,6. Pertanto, la preparazione rapida della griglia non solo consente un trEM al millisecondo, ma può anche migliorare la qualità della griglia.
Attualmente, ci sono tre diversi approcci alla preparazione automatizzata della rete. Il primo approccio utilizza un perno o capillare che contiene una piccola quantità di campione. Dopo aver stabilito il contatto tra il liquido e la superficie della griglia, il campione viene "scritto" sulla griglia7,8. Il processo di applicazione di esempio è relativamente lento e richiede alcuni secondi. Un approccio alternativo utilizza la generazione controllata di goccioline da un distributore piezoelettrico e griglie autoaspiranti9. Ciò consente tempi di erogazione più rapidi per congelare, ma è ancora limitato dalla velocità delle goccioline e dell'assorbimento (attualmente raggiunge i 54 ms). L'approccio più veloce finora è l'approccio a spruzzo diretto, in cui il campione viene atomizzato in un ugello spray e le goccioline piccole (~ 10 - 20 μm) e veloci (> 5 m / s) si diffondono a contatto con la griglia crio-EM. Lo spray campione può essere generato attraverso diversi modi come atomizzatori di sabbiatura ad aria, onde acustiche di superficie o umidificatori ad ultrasuoni10,11,12,13. Nella nostra esperienza, lo spessore del ghiaccio con l'approccio a spruzzo diretto è maggiore, ma la spruzzatura diretta consente di congelare i tempi di erogazione < 10 ms.
Questo protocollo descrive passo dopo passo come un dispositivo EM a risoluzione temporale (TED) dotato di un ugello a spruzzo microfluidico può essere utilizzato per preparare le griglie su una scala temporale rapida14,15. Il dispositivo è stato utilizzato per preparare griglie con un tempo di ritardo minimo di 6 ms tra l'applicazione del campione e il congelamento e per miscelare e congelare rapidamente due campioni. Il design del TED si basa su una versione precedente16 ed è simile ad altri dispositivi cryo-EM risolti nel tempo basati su spray17.
Innanzitutto, vengono descritte le quattro parti principali della configurazione TED. Il cuore del TED è l'unità di gestione dei liquidi, che è responsabile dell'aspirazione e dell'erogazione dei campioni. Uno stantuffo pneumatico sposta la griglia attraverso lo spruzzo nell'etano liquido. La generazione dello spray si ottiene con ugelli di spruzzatura microfluidici e il congelamento viene effettuato in un contenitore di etano liquido, che viene descritto brevemente. Infine, vengono evidenziate le funzionalità aggiuntive per controllare l'ambiente della griglia, in particolare l'umidità. Questo è seguito da protocolli dettagliati per il funzionamento del dispositivo e per la conduzione di esperimenti TrEM. Vengono forniti risultati rappresentativi per una rapida preparazione della griglia e un semplice esperimento TrEM.
Configurazione sperimentale
L'unità di trattamento dei liquidi
Il sistema di trattamento dei liquidi del TED è formato da tre pompe di azionamento a siringa ("pompe 1 - 3", ciascuna dotata di una valvola rotativa (Figura 1). Un alimentatore fornisce pompe 1 - 3 con 24 V DC. La comunicazione con il software di controllo (scritto in Visual Basic e C++) avviene tramite un'interfaccia RS232 per pompare 1. I comandi sono distribuiti attraverso le porte di espansione I/O seriali dalla pompa 1 alle pompe 2-3. Le pompe 1-3 sono dotate di siringhe di vetro ('siringhe 1-3', qui usiamo siringhe da 250 μL/zero volume morto). Ogni valvola ha due posizioni, 'load' e 'dispense'. La posizione di "carico" viene utilizzata per aspirare il campione nella siringa. Un pezzo corto (~ 3 - 4 cm) di tubi in Flangia IN F.D. da 1/16" O.D., 0,01′′ I.D. FEP è collegato tramite raccordi senza flangia ETFE/ETFE alla posizione di "carico" delle valvole 1-3. Questo breve pezzo di tubo raggiunge il serbatoio del campione (in genere un tubo di plastica da 1,5 ml o 0,5 ml). La posizione "dispense" porta all'ugello di spruzzatura. Il collegamento tra l'uscita 'dispense' e l'ugello spray è costituito da tubi in PE (~ 20-30 cm di lunghezza, 0,043" O.D., 0,015" I.D.), con un breve pezzo di tubo manicotto (~ 0,5 cm) e raccordi senza flangia ETFE/ETFE.
Lo stantuffo pneumatico
Il TED utilizza uno stantuffo pneumatico per accelerare la griglia e spostarla attraverso lo spray campione nel contenitore di etano liquido. Le pinzette a pressione negativa tengono la griglia, avvitata in un supporto costruito in casa che è montato su un cilindro pneumatico a doppia asta (Figura 2A).
La pressione viene fornita da una grande bombola di azoto gassoso (taglia W), dotata di un regolatore multistadio (0 - 10 bar, "pressione principale"). Il tubo flessibile in PVC rinforzato (12 mm O.D.) collega il regolatore a un collettore a 12 porte in cui l'azoto pressurizzato viene erogato all'ugello e allo stantuffo pneumatico. Il flusso di gas attraverso l'ugello è costante, regolato direttamente sul cilindro di azoto (pressione principale). Il collegamento all'ugello è realizzato con tubo in PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), un breve pezzo di tubo in PE (~ 8 cm di lunghezza, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) e appositi connettori. La pressione sullo stantuffo pneumatico è controllata attraverso un'elettrovalvola. Il tubo in PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) collega l'elettrovalvola con un regolatore e lo stantuffo pneumatico, per consentire una ridotta pressione di immersione (≤ pressione principale). L'elettrovalvola è controllata da computer. Una panoramica schematica dell'installazione è fornita nella Figura 2B.
Si noti che con questa configurazione la pressione di immersione è sempre uguale o inferiore alla pressione del gas spray (pressione principale). Tuttavia, la configurazione può essere facilmente modificata incorporando un secondo regolatore a monte dell'ugello di spruzzatura per consentire velocità di immersione più elevate a bassa pressione del gas di spruzzatura. Alte pressioni (>> 2 bar) possono danneggiare l'ugello di spruzzatura PDMS.
ATTENZIONE: Questo è un sistema pressurizzato e la "pressione principale" deve essere sempre < 7 bar.
Le pressioni comprese tra 0,5 e 2 bar sono tipicamente utilizzate per lo stantuffo pneumatico e mostrano una relazione approssimativamente lineare tra pressione e velocità (nella posizione verticale dello spruzzo). Le velocità di immersione sono misurate con un oscilloscopio, collegato in linea con un potenziometro a scorrimento (10 kΩ) e in parallelo con un resistore da 2 kΩ (Figura 2C). Un alimentatore fornisce il potenziometro con 9 V DC. Mentre la velocità approssimativa del tuffo viene impostata prima dell'esperimento impostando la pressione del tuffo, il potenziometro fornisce una lettura precisa della velocità dopo l'esperimento.
Ugelli spray e contenitore di etano liquido
La fabbricazione e il funzionamento di ugelli virtuali gasdinamici per la consegna di campioni a spruzzo sono stati descritti altrove in dettaglio15. Come descritto sopra, le uscite "erogate" delle valvole 1-3 sono collegate alle prese liquide dell'ugello (Figura 3A). Il gas spray pressurizzato è collegato all'ingresso del gas dell'ugello. Gli assi di aspirazione negli ugelli di spruzzatura PDMS sono tali che i tubi in PE O.D. da 0,043" possono essere utilizzati direttamente senza la necessità di raccordi. Il nostro design dell'ugello contiene una geometria "jet-in-jet" per la miscelazione di due campioni, simile al dispositivo descritto nel rif.18. Uno schema del progetto è mostrato in Figura 3B, un'immagine microscopica di un ugello è mostrata in Figura 3C. Il layout del dispositivo microfluidico richiede l'uso di tre siringhe per mescolare due campioni. L'ugello di spruzzatura è in genere posizionato a una distanza di 1-1,5 cm dalla griglia (durante l'applicazione del campione).
Usiamo l'etano liquido come criogeno, in un contenitore liquido di etano / azoto come utilizzato per il metodo di blotting standard. Il posizionamento verticale della tazza di etano liquido si ottiene con una piattaforma elevata da laboratorio.
Controllo dell'ambiente di spruzzatura e griglia
Lo stantuffo e l'ugello di spruzzatura sono contenuti all'interno di una scatola in PMMA (vetro acrilico) costruita su misura con una doppia porta(Figura 4A). L'elevata umidità relativa all'interno della scatola è ottenuta da un sistema di umidificazione dell'aria sul retro del TED (Figura 4B). L'aria viene fornita da una pompa e immessa in un primo contenitore da 10 "(tipicamente utilizzato per la purificazione dell'acqua sotto il lavandino). Il contenitore è riempito con un basso (~ 5-10 cm) livello di acqua e ospita anche un'unità umidificatore. L'alimentazione di rete dell'umidificatore è controllata da un regolatore digitale di umidità/temperatura e da un sensore di umidità/temperatura situato all'interno della scatola di vetro acrilico. Il controller è impostato per spegnere la pompa quando l'umidità relativa raggiunge ≥ 90 %. L'aria umidificata dal primo contenitore viene pompata attraverso un diffusore, immersa in acqua in un secondo contenitore da 10 "e quindi entra nella scatola di vetro acrilico.
ATTENZIONE: Poiché il campione è aerosolizzato nell'ugello spray, i campioni biologici o chimici pericolosi non sono adatti come campioni.
La sequenza di esecuzione
Il pulsante Esegui script nel software di controllo avvia la sequenza di esecuzione. Questa sequenza di comandi può essere predefinita in un file di script e modificata tramite il software. Le variabili più importanti sono spiegate qui:
Velocità di spruzzatura: la velocità di spruzzatura determina la portata del liquido utilizzata dalla pompa della siringa. La portata può essere calcolata come segue: I motori della pompa a siringa utilizzati qui hanno una dimensione del gradino fissa. L'intera gamma della pompa è suddivisa in 48.000 gradini. Il secondo fattore importante è il volume della siringa. In genere utilizziamo siringhe da 250 μL. La velocità di spruzzatura nel software di controllo è impostata come numero di passi/secondo. Una velocità di spruzzatura di 1000 passi/secondo corrisponde a:
Volume di spruzzo: il volume di spruzzo determina il volume totale da spruzzare. Pertanto, determina anche la durata dello spray. Il volume di spruzzo nel software di controllo è impostato su una serie di passaggi. Un volume di spruzzo di 2000 passi, ad una velocità di spruzzo di 1000 passi/secondo, porta ad una durata di spruzzo di 2 s e un volume totale di 10,4 μL.
Tempo di pre-spruzzatura: questa variabile definisce il tempo che tra l'inizio dello spruzzo e l'immersione. È importante scegliere il tempo di ritardo in modo tale che lo spray abbia il tempo sufficiente per stabilizzarsi prima di immergere la griglia. Di solito, lo spray viene somministrato 1,5 - 4 s per stabilizzarsi prima che la griglia venga immersa. Lo spray viene mantenuto fino a quando la griglia non si è spostata. Di solito, il flusso di liquido (e quindi lo spray) viene interrotto da 0,5 a 1 s dopo che la griglia è stata immersa. Utilizzando una velocità di spruzzatura di 1000 passi / s e un volume di spruzzo di 2000 passi, un tempo tipico di pre-spruzzatura è di 1,5 s, ad esempio.
Una sequenza esemplare di comandi è mostrata nella Figura 5A, la posizione della griglia nel tempo è illustrata nella Figura 5B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione del sistema
Nota : il protocollo seguente descrive come preparare le griglie di un singolo campione. Di solito, vengono preparate almeno 2 griglie di replica per ogni campione o condizione. Per velocità di immersione più elevate (meno di ~ 20 ms di ritardo), 3 o 4 griglie di replica sono in genere preparate per tenere conto di un numero ridotto di aree di ghiaccio sottile.
- Diluire il campione proteico alla concentrazione target nel tampone desiderato. Tipicamente, le concentrazioni finali ≥ 2 mg / mL funzionano bene per la preparazione della griglia con il TED. Si noti che il campione può essere tenuto sul ghiaccio fino al passaggio 10, dal passaggio 10 in poi il campione trascorrerà molto tempo a temperatura ambiente in quanto ci vogliono circa 20 minuti per preparare 3-4 griglie.
- Accendi il TED. Quindi accendere il PC di controllo e avviare il software di controllo.
- Inizializzare tutte le pompe a siringa premendo il pulsante Inizializza (pulsante nero inferiore) su ciascuna pompa a siringa.
- Accendere l'alimentatore del potenziometro, impostarlo su 9 V e avviare il software di controllo dell'oscilloscopio.
- Assicurarsi che la valvola regolatrice del cilindro N2sia chiusa. Aprire la valvola del cilindro. Quindi, aprire lentamente la valvola regolatrice impostando la pressione di uscita sul valore desiderato per la pressione del gas spray (in genere 1-2 bar). Per gli ugelli PDMS utilizzati qui, non utilizzare pressioni superiori a ~ 2,5 bar per evitare danni all'ugello. Il gas che scorre continuamente impedisce al liquido di gocciolare e accumularsi sulla punta dell'ugello che può portare a irrisorzione irriproducibile.
- Assicurarsi che tutte le valvole della pompa a siringa siano in posizione di "carico". Questo può essere fatto commutando tutte le valvole nella posizione "erogazione" nel software di controllo e quindi di nuovo a "carico". Lasciare tutte le valvole commutate su "carico". Impostare tutte le siringhe a zero.
- Rimuovere eventuali bolle d'aria presenti nel sistema in questa fase. Per fare ciò, le siringhe potrebbero dover essere svitate, le bolle rimosse manualmente e le siringhe montate di nuovo quando non contengono più bolle.
- I componenti di gestione dei liquidi sono solitamente conservati in H2O. Prima di caricare la soluzione campione, equilibrare il sistema liquido con tampone lavando il tubo con un eccesso di tampone. Utilizzare una portata massima del liquido appropriata per evitare sovrapressioni sull'ugello di spruzzatura. Le portate dei liquidi > 10 μL/s possono causare danni agli ugelli PDMS qui descritti.
- Posizionare un tubo da 1,5 mL contenente ≥ tampone da 200 μL sulla siringa 1 (la parte superiore deve essere forata per essere attaccata al tubo).
- Assicurarsi che la valvola 1 sia in posizione di "carico". Passare al software di controllo, se necessario.
- Aspirare la quantità desiderata (tipicamente 50-100 μL) di tampone con la siringa 1, attraverso il software di controllo.
- Commutare la valvola 1 in posizione 'dispense', tramite il software di controllo.
- Erogare tutto il liquido nella siringa 1, attraverso il software di controllo.
- Riportare la valvola a 'caricare', ripristinare la posizione della siringa su '0' nel programma e premere inizializza sulla siringa 1, per preparare il sistema per il ciclo successivo.
NOTA: i passaggi 1.9.1 - 1.9.5 vengono solitamente ripetuti tre volte per garantire un lavaggio accurato del tubo.
- Caricare le pinzette con una griglia EM (nessun requisito per alcun tipo specifico) allentando il morsetto del braccio di immersione, posizionando le pinzette nel morsetto e stringendo il morsetto.
- Spostare manualmente il braccio di immersione in modo che la griglia e l'ugello siano alla stessa altezza (posizione di "applicazione del campione"). Se l'ugello e la griglia sono allineati, il liquido si accumulerà sulla griglia dopo la spruzzatura per un periodo prolungato. Se necessario, regolare la posizione dell'ugello.
- Regolare la posizione della tazza di etano liquido spostando manualmente il braccio di immersione con una pinzetta montata nella sua posizione finale (raggiungendo la tazza di etano). Se impostata correttamente, una griglia tenuta dalle pinzette raggiungerà approssimativamente il centro della tazza di etano liquido.
- Verificare che lo "script di esecuzione" utilizzi le portate, i volumi e i tempi desiderati. Vedere la sezione "La sequenza di esecuzione" sopra per i dettagli.
- Assicurati che nulla ostruisca il percorso dello stantuffo. Aspirare il volume di tampone necessario per una singola corsa nella siringa 1. Questo viene fatto nel software di controllo, vedere la sezione 'La sequenza di esecuzione' per l'impostazione e i volumi tipici. Quindi assicurarsi che la valvola 1 sia commutata nella posizione "erogazione". Eseguire un'esecuzione di test premendo Esegui script nel software di controllo.
ATTENZIONE: tenere lontano il TED fino al termine della sequenza di esecuzione. Le parti mobili potrebbero causare lesioni! - Al termine della "sequenza di esecuzione", impostare la pressione sul braccio di immersione sul valore desiderato (in genere 1-2 bar). Solo allora premere OK nel software di controllo per rilasciare la pressione dal braccio di immersione. Se è necessario regolare la "sequenza di corsa" o la pressione sul braccio di immersione, queste impostazioni possono essere modificate in questa fase e i passaggi 1.13 - 1.15 ripetuti.
2. Preparazione rapida della griglia
- Riempire prima il contenitore liquido di etano/ azoto con azoto liquido. Quando è sufficientemente freddo e privo di azoto liquido, riempire la tazza con etano liquido. Evitare la solidificazione dell'etano liquido. Questo passaggio è lo stesso della preparazione della griglia convenzionale.
NOTA: per ridurre al minimo la contaminazione da etano, assicurarsi che i passaggi da 2.2 a 2.13 vengano eseguiti il più rapidamente possibile
ATTENZIONE: L'etano liquido è un criogeno e infiammabile. Bisogna fare attenzione durante la manipolazione. - Preparare le griglie crio-EM per la scarica a bagliore. In genere utilizziamo griglie di carbonio bucato e glow-discharge per 90 s, a pressione dell'aria di 0,1 mbar e 10 mA. Di solito, non più di 4 griglie vengono scaricate alla volta. Le griglie vengono utilizzate entro 30 minuti dalla scarica del bagliore.
- Equilibrare il tubo con il campione (seguendo i passaggi 1.9.1 - 1.9.5, utilizzando il campione anziché il buffer). Se il volume del campione disponibile è basso, il tubo può essere bilanciato con solo 1 volume morto.
- Aspirare la quantità di campione necessaria per una singola corsa nella siringa 1 nel software di controllo (vedere la sezione "La sequenza di esecuzione" per i dettagli). Quindi commutare la valvola 1 nella posizione "erogazione".
- Verificare che l'umidità relativa abbia raggiunto il valore desiderato (in genere prepariamo griglie al 60 % di umidità relativa o superiore). Una volta raggiunto ≥ 60 % di umidità, aprire la camera di umidità solo per un periodo di tempo minimo, per mantenere elevata l'umidità.
- Posizionare le pinzette, tenendo una griglia a scarica di bagliore, nello stantuffo pneumatico e fissarle. Spostare lo stantuffo nella posizione iniziale (in alto).
- Assicurarsi che il cursore del potenziometro sia in posizione di partenza, pronto per la misurazione, spostandolo manualmente per contattare lo stantuffo. Impostare il trigger sull'oscilloscopio nel software dell'oscilloscopio.
- Posizionare il contenitore liquido di etano/azoto.
- Premere Esegui script nel software di controllo. Quando richiesto, fare clic su OK nel software di controllo per avviare l'esecuzione.
ATTENZIONE: tenere lontano il TED fino al termine della sequenza di esecuzione. Le parti mobili potrebbero causare lesioni! - Una volta completata la "sequenza di esecuzione", rilasciare la pressione sullo stantuffo pneumatico facendo clic su OK nel software di controllo.
- Aprire la camera di umidità, allentare la connessione tra braccio tuffante e pinzette con una mano mentre si fissano le pinzette con l'altra. Quando le pinzette sono libere, spostare il braccio di immersione verso l'alto mantenendo la griglia nell'etano liquido. Quindi trasferire la griglia nel suo spazio di stoccaggio nel liquido circostante N2. Dopo il congelamento, la griglia deve essere mantenuta sempre a temperatura N2 liquida.
- Salvare la misurazione dell'oscilloscopio. Successivamente, reimpostare manualmente la posizione del cursore del potenziometro e dello stantuffo.
- Ripetere i passaggi 2.4-2.12 per preparare le griglie di replica
- Trasferisci le griglie in un archivio a lungo termine fino al ritaglio della griglia e alla raccolta dei dati.
- Lavare il sistema con tampone, secondo i passaggi 1.9.1 - 1.9.5. Quindi lavare il sistema con H2O, secondo i passaggi 1.9.1 - 1.9.5.
- Spegnere il regolatore principale del gas di azoto e spegnere l'alimentazione.
- Posizionare il contenitore di etano/azoto in una cappa aspirante per farlo scaldare e lasciare evaporare l'etano liquido e N2.
3. Crio-EM risolta nel tempo
NOTA: quando gli esperimenti risolti nel tempo vengono condotti con il TED, ci sono aspetti aggiuntivi da considerare, sebbene la configurazione di base e le variabili rimangano le stesse. Si presume qui che due soluzioni siano mescolate in un rapporto 1:1 (v/v) per produrre la miscela finale che si deposita sulla griglia. Seguire il protocollo descritto al '1. Preparazione rapida della griglia con il TED', con le seguenti modifiche:
- Utilizzare concentrazioni di stock più elevate per gli esperimenti di miscelazione rispetto ai semplici esperimenti di spruzzatura. La miscelazione in un rapporto 1:1 (v/v) comporterà una diluizione 2x di ciascun componente.
- Per un rapido esperimento di miscelazione, utilizzare tutte e tre le siringhe anziché una sola.
- Collegare il tubo alle pompe a siringa 2-3.
- Collegare i tubi dalle pompe a siringa 2-3 all'ugello di spruzzatura.
- Equilibrare separatamente tutte e tre le siringhe nel tampone e nel campione. In genere, la siringa 1 viene riempita con il campione A e le siringhe 2-3 vengono riempite con il campione B (Figura 3).
- Modificare la sequenza di esecuzione. Un esempio per una sequenza di esecuzione che utilizza tutte e 3 le siringhe per un esperimento di miscelazione rapida è riportato nella Figura 6. Vedere anche la sezione "La sequenza di esecuzione" per i dettagli.
- Ritardi di tempo diversi possono essere raggiunti in due modi:
- Modificate la velocità dello stantuffo. Regolando la velocità dello stantuffo, il ritardo temporale può essere modificato in un intervallo relativamente ristretto. Ad esempio, con una distanza spray/etano di 2 cm, lo stantuffo può essere spostato a 1 m/s o 2 m/s per dare un ritardo di 20 ms o 10 ms, rispettivamente. Questa mente viene eseguita come descritto nel passaggio 1.15.
- Modificare la posizione di spruzzo/etano regolando la posizione (verticale) dell'ugello di spruzzatura. Se l'ugello è posizionato a una distanza di 5 cm dalla superficie dell'etano, ad esempio, una velocità di immersione di 1 m/s dà un ritardo di 50 ms. Il raggiungimento di ritardi significativamente più lunghi richiede ulteriori modifiche alla configurazione.
NOTA: a causa del flusso laminare nella regione di messa a fuoco del flusso dell'ugello, non ci aspettiamo una miscelazione significativa in questa parte dell'ugello. Invece, ci aspettiamo che la miscelazione avvenga durante la generazione di spray, in goccioline in rotta verso la griglia e durante la diffusione delle goccioline sulla griglia. Il tempo di volo per le goccioline di spruzzo per raggiungere la griglia è stimato ≤ 1 ms (per una velocità delle gocce di ≥ 10 m/s e una distanza ugello-griglia di 1 cm). Pertanto, solo il tempo tra l'atterraggio delle goccioline e la vetrificazione è considerato il "ritardo temporale".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Preparazione rapida della griglia con il TED
Come campione di prova per la preparazione rapida della griglia, abbiamo utilizzato apofertitina dalla milza equina a 20 μM in 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Una ricostruzione con risoluzione di 3,5 Å è stata ottenuta da 690 micrografie come descritto nel rif.15 (Figura 7A). La gamma di sfocatura è stata scelta in modo che le particelle possano essere facilmente identificate nelle immagini grezze (Figura 7B). Una tipica griglia preparata con un ritardo temporale di 10-40 ms mostra aree sufficienti di ghiaccio sottile(Figura 7C)per consentire la raccolta di > 1000 micrografie. La risoluzione risultante è probabilmente limitata dallo spessore del ghiaccio, l'analisi tomografica di un certo numero di griglie diverse ha mostrato 96 ± 33 nm di spessore di ghiaccio6.
Cryo-EM risolta nel tempo
Al fine di dimostrare una rapida miscelazione e risoluzione temporale utilizzando il TED, abbiamo usato la dissociazione del complesso dell'actomiosina mescolando con ATP come reazione modello19. Questa scelta si è basata sulla facile distinzione tra actomiosina e F-actina libera da micrografie grezze e sulla cinetica ben compresa della reazione.
Di seguito, vengono mostrati i risultati rappresentativi per TrEM della dissociazione del complesso actomiosina da parte di ATP. Le procedure sperimentali dettagliate e i risultati sono forniti nel rif.19. In breve, F-actina e miosina scheletrica di coniglio S1 sono state miscelate in 10 mM MOPS, 50 mM KAc, 2 mM MgCl2,0,1 mM EGTA, pH 7 a concentrazioni finali di monomero di 40 μM per preparare il complesso di actomiosina (AM). Il complesso AM è stato caricato nella siringa 1 e il MgATP da 200 μM nello stesso buffer è stato caricato nelle siringhe 2 e 3. I principali parametri sperimentali per i due diversi timepoint preparati sono elencati nella Tabella 1.
Per entrambi i timepoint, il risultato è stato una miscela 1:1 v/v di complesso AM e MgATP, dando concentrazioni finali di 20 μM am complex e 100 μM MgATP. I tempi di miscelazione e congelamento calcolati sono stati di 7 e 13 ms, come mostrato nella Tabella 1. Il tempo di volo stimato per le goccioline spray tra ugello e griglia era di < 1 ms.
Un piccolo set di dati crio-EM (306 e 123 micrografie) è stato acquisito per ogni timepoint e i dati combinati elaborati utilizzando procedure di elaborazione elicoidale standard20. La ricostruzione del consenso risultante (entrambi i punti temporali combinati) è mostrata nella Figura 8A. I dati combinati sono stati quindi sottoposti a una classificazione focalizzata e suddivisi in un complesso AM e una classe F-actina (Figura 8B, C). Quindi, è stata calcolata la frazione di particelle AM-complesso o F-actina per ogni punto temporale ed è mostrata nella Figura 8D.
La costante di velocità del secondo ordine per la dissociazione del complesso AM è 1,5 · 106 M-1 s-1 21. Nell'ipotesi che
la legge sulle tariffe integrate può essere approssimata a:
Dove [am-complesso] è la concentrazione tempo-dipendente del complesso AM, [am-complesso]0 è la concentrazione iniziale, k è la costante di velocità del secondo ordine e [ATP]0 è la concentrazione (iniziale) di ATP.
Usando questa equazione, è stata modellata la cinetica della dissociazione del complesso AM. Il modello concorda ragionevolmente bene con i dati sperimentali di TrEM. C'è una variazione significativa per micrografia come mostrato nella Figura 8D.
Figura 1: Il dispositivo EM a risoluzione temporale (TED). (A) Panoramica del TED. (B) L'unità di trattamento dei liquidi con pompe 1-3. La quarta pompa a sinistra non viene utilizzata in questo lavoro. Le posizioni di carico e di erogazione sono indicate per la valvola 1, così come il serbatoio del campione ('campione 1'). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Stantuffo pneumatico e potenziometro lineare. (A) Dettagli dello stantuffo pneumatico del TED con componenti importanti etichettati. (B) Schema del sistema pneumatico del TED. I numeri corrispondono al cilindro N2 (1), al regolatore di pressione principale (2), all'ugello di spruzzatura (3), all'elettrovalvola (4), al regolatore di velocità a tuffo (5) e al cilindro pneumatico a doppia asta (6). (C) Schema del circuito per il potenziometro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Ugelli virtuali gasdinamici per la miscelazione e la spruzzatura. (A) Un ugello con 4 tubi di ingresso collegati, per alimentare i campioni (A e B) e N2 gas. (B) Schema della sezione centrale degli ugelli di spruzzatura PDMS con geometria di messa a fuoco a doppio flusso per ottenere la messa a fuoco del flusso (per la miscelazione a valle) e la messa a fuoco o l'atomizzazione del gas. Il campione B è mostrato in giallo e il campione A in viola. (C) Immagine microscopica delle sezioni di miscelazione e atomizzazione dell'ugello microfluidico. Immagine dal rif.15. Barra di scala 100 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Controllo ambientale della griglia e dello spruzzo nella scatola di vetro acrilico. (A) Vista frontale e (B) dal lato del TED. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: La sequenza di esecuzione. (A) Una sequenza di esecuzione di esempio che mostra le variabili in alto e la sequenza di comandi in basso. Alcuni dei comandi chiave sono annotati in rosso. (B) Posizione della griglia nel corso temporale di una «sequenza di esecuzione» mostrata come una linea fissa nera. La posizione iniziale della griglia è a 0 cm. Lo spray viene avviato a t = 0 s per 2 s, la distanza tra spray ed etano liquido è ~ 2 cm. A 1,5 s, la griglia inizia a muoversi con 2 m / s, attraverso lo spray e nell'etano liquido. La sequenza termina quando lo spray si ferma dopo 2 s. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esempio di sequenza di esecuzione per un esperimento di miscelazione rapida. Le differenze importanti rispetto alla Figura 5 A sono annotate in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Risultati rappresentativi di un semplice esperimento di spruzzatura. (A) 3.5 Å ricostruzione dell'apoferitina equina da una griglia preparata in 36 ms tra irrorazione e vetrificazione (EMD-10533). (B) Immagine grezza dello stesso campione di apofertitina. (C) Vista a basso ingrandimento della griglia, un quadrato a griglia esemplare contenente ghiaccio sottile è evidenziato dal rettangolo blu tratteggiato, l'area di ghiaccio sottile all'interno di questa griglia quadrata è indicata dalla freccia blu. Le aree di ghiaccio spesso o contaminazione sono indicate con asterischi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Risultati rappresentativi di un esperimento di miscelazione. (A) Ricostruzione consensuale del complesso AM mostrata ad una soglia alta (colorata) e bassa (trasparente). Una densità di miosina è etichettata ed evidenziata con una linea tratteggiata. La ricostruzione è stata generata dai dati di entrambi i punti temporali combinati. (B) Classe F-actina che non mostra alcun legame con miosina. (C) Classe AM-complessa che mostra la miosina legata (miosina in grigio, legata principalmente alla subunità dell'actina rosso chiaro). (D) Confronto tra modello cinetico e dati sperimentali TrEM. Viene mostrata la frazione del complesso AM rispetto alla concentrazione iniziale. Grandi punti neri solidi indicano dati TrEM medi, piccoli punti mostrano dati TrEM per micrografia. La linea tratteggiata viola rappresenta il modello cinetico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| portata (μL/s) | distanza spray/etano (cm) | velocità di immersione (m/s) | ritardo temporale (ms) | |||
| siringa 1 | siringa 2 | siringa 3 | ||||
| (AM) | (ATP) | (ATP) | ||||
| 7 ms | 2.08 | 1.04 | 1.04 | 1.4 | 2 | 7 |
| 13 ms | 1.04 | 0.52 | 0.52 | 2 | 1.6 | 13 |
Tabella 1: Impostazioni sperimentali per TrEM della dissociazione del complesso AM da parte di ATP
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protocolli in questo lavoro possono essere utilizzati per la preparazione rapida della griglia mediante spruzzatura diretta ed esperimenti TrEM. La preparazione rapida della griglia può essere utilizzata per ridurre le interazioni delle particelle con l'interfaccia aria-acqua5. Le principali limitazioni sono la concentrazione del campione disponibile e lo spessore del ghiaccio sulla griglia. Entro questi limiti e a condizione che la qualità del campione sia buona, il protocollo produce griglie adatte per crio-EM ad alta risoluzione.
Risoluzione dei problemi
La portata del liquido e la velocità della rete determinano la quantità di liquido depositato sulla rete. Con le impostazioni di esempio sopra riportate (portata del liquido 5 μL/s e velocità di immersione 1-2 m/s), ci si aspetta una buona copertura della griglia con goccioline. Se l'ugello non è stato allineato bene (quindi le goccioline spray mancano la griglia), le griglie congelate mostrano pochissime o nessuna goccioline.
La contaminazione delle griglie non può essere completamente evitata (vedi Figura 7C)ma può essere ridotta riducendo al minimo il tempo di esposizione dell'etano liquido a un ambiente umido. Ciò si ottiene preparando le griglie di replica il più rapidamente possibile (≤ 20 minuti per 4 griglie). In genere prepariamo 4 griglie prima di sostituire l'etano liquido.
Il ghiaccio vitreo sulle griglie può (parzialmente) cristallizzare se il raffreddamento iniziale nell'etano liquido è troppo lento. In accordo con un precedente studio22,abbiamo scoperto che basse velocità di immersione (< 0,5 m / s) portano ad un aumento del ghiaccio cristallino. Le aree di ghiaccio molto spesso (≥ 200 nm) mostrano tipicamente ghiaccio cristallino a causa del raffreddamento intrinsecamente più lento. Se la griglia si riscalda durante una qualsiasi delle fasi successive alla preparazione della griglia (trasferimento dall'etano liquido all'azoto liquido, trasferimento allo stoccaggio, ecc.)può verificarsi anche ghiaccio cristallino.
Acquisizione dati per griglie preparate TED
Lo spessore medio del ghiaccio prodotto dal TED è più spesso della griglia crio-EM "ideale" preparata su un sistema di blotting standard. Lo spessore del ghiaccio può anche variare tra le aree di acquisizione. Ciò significa che le aree di acquisizione devono essere selezionate con attenzione per dare il ghiaccio più sottile possibile. Potrebbe essere necessario regolare la gamma di sfocatura per ottenere immagini ad alto contrasto. Quando il ghiaccio è spesso e le particelle hanno un basso contrasto, suggeriamo un'acquisizione iniziale dei dati pilota utilizzando valori di sfocatura molto elevati (3 - 5 μm). Lavori recenti suggeriscono che l'alta risoluzione può ancora essere raggiunta utilizzando valori di sfocatura così elevati23.
Per la raccolta di dati crio-EM convenzionali, un intero set di dati viene spesso raccolto da una singola griglia. Tuttavia, abbiamo trovato utile la raccolta di più piccoli set di dati e l'unione di questi set di dati. In questo modo, è possibile registrare più punti temporali entro un tempo limitato al microscopio e identificare i punti temporali di interesse.
Elaborazione e analisi dei dati TrEM
L'unione di set di dati può essere eseguita di routine nel più comune software di elaborazione dati crio-EM. Come descritto sopra e nel lavoro di altri, la fusione di set di dati da punti temporali separati può essere utile17. È importante che le particelle possano essere ricondotte al loro sottoinsieme originale (timepoint) durante l'elaborazione.
Le misurazioni cinetiche convenzionali (ad esempio utilizzando la diffusione della luce o la fluorescenza) possono essere una preziosa aggiunta agli esperimenti TrEM. Le costanti di velocità delle misurazioni biochimiche possono essere utilizzate per prevedere la durata dello stato intermedio di interesse o per confermare la cinetica osservata da TrEM. Per un'introduzione di base alla cinetica di reazione e alla loro relazione con gli studi strutturali risolti nel tempo, vedere rif.24.
Ci sono una serie di possibili ragioni per le differenze tra TrEM e gli esperimenti cinetici convenzionali. Come mostrato nella Figura 8D,i dati TrEM possono mostrare variazioni significative per micrografia. Notiamo anche che i dati preliminari suggeriscono almeno il 5% di variabilità nel numero relativo di particelle tra le griglie replicate. La classificazione delle particelle (assegnazione di classe) potrebbe essere imperfetta, in particolare se gli stati sono strutturalmente simili o se una struttura è altamente flessibile. Le particelle, e quindi la cinetica derivata da TrEM, potrebbero anche essere influenzate dalle interazioni delle particelle con l'interfaccia aria-acqua perché tali interazioni sono ridotte ma non eliminate a velocità elevate.
Questo lavoro fornisce alcune linee guida per TrEM, ma notiamo che questa è un'area di ricerca attiva e ci aspettiamo ulteriori progressi in futuro. Mentre gli esperimenti TrEM richiedono uno sforzo sperimentale significativo, possono offrire informazioni ad alta risoluzione sulla dinamica dei complessi macromolecolari.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Molly S.C. Gravett per le discussioni utili e lo staff della struttura ABSL per l'aiuto con la raccolta dei dati crio-EM. David P. Klebl è uno studente di dottorato del programma di dottorato di 4 anni Wellcome Trust presso l'Astbury Centre finanziato dall'Università di Leeds. I microscopi FEI Titan Krios sono stati finanziati dall'Università di Leeds (premio UoL ABSL) e wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione BBSRC a Stephen P. Muench (BB / P026397 / 1) e supportato da sovvenzioni di ricerca a Howard D. White dell'American Heart Association (AMR21-236078) e Howard D. White e Vitold Galkin del National Institutes of Health degli Stati Uniti (171261).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10x70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
References
- Murphy, B. J., et al. Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling. Science. 364, (2019).
- Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH. Nature. , 1-4 (2020).
- Dance, A. Molecular motion on ice. Nature Methods. , 1-5 (2020).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15, 793-795 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales. BioRxiv. , (2020).
- Ravelli, R. B., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11, 1-9 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM. Structure. 25, 663-670 (2017).
- Ashtiani, D., et al. Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation. Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11, 1-14 (2020).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, (2019).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).
- White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Protein Complex Assembly. , Springer. 59-71 (2018).
- Trebbin, M., et al. Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions. Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).
- Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).
- He, S., Scheres, S. H. Helical reconstruction in RELION. Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).
- Millar, N. C., Geeves, M. A. The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1. FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).
- Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging. Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).
- Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading. bioRxiv. , (2020).
- Bagshaw, C. A beginner's guide to flow kinetics. The Biochemist. 42, (2020).
