Summary
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בהתקן מהיר לייצור רשת הן לייצור רשת מהירה והן לערבוב מהיר והקפאה כדי לבצע ניסויים שנפתרו בזמן.
Abstract
תחום המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית (cryo-EM) מתפתח במהירות עם אלגוריתמי חומרה ועיבוד חדשים, ומייצר מבנים ברזולוציה גבוהה יותר ומידע על מערכות מאתגרות יותר. הכנה לדוגמה עבור cryo-EM עוברת מהפכה דומה עם גישות חדשות שפותחו כדי מחליף את מערכות הכתמים המסורתיות. אלה כוללים שימוש במתקנים פיזו-חשמליים, הדפסת סיכות וריסוס ישיר. כתוצאה מהתפתחויות אלה, מהירות הכנת הרשת עוברת משניות לאלפיות שניה, ומספקת הזדמנויות חדשות, במיוחד בתחום ה-cryo-EM שנפתר בזמן שבו חלבונים ומצעים יכולים להיות מעורבים במהירות לפני הקפאת הצלילה, לכידת מצבי ביניים קצרי מועד. כאן אנו מתארים בפירוט פרוטוקול סטנדרטי ליצירת רשתות במכשיר ה- EM שלנו שנפתר בזמן הבית הן להכנת רשת מהירה סטנדרטית והן לניסויים שנפתרו בזמן. הפרוטוקול דורש מינימום של כ 50 μL מדגם בריכוזים של ≥ 2 מ"ג / מ"ל להכנת 4 רשתות. העיכוב בין יישום מדגם להקפאה יכול להיות נמוך ככל 10 ms. מגבלה אחת היא עובי קרח מוגבר במהירויות גבוהות יותר בהשוואה לשיטת הכתם. אנו מקווים שפרוטוקול זה יסייע לאחרים לעצב מכשירים משלהם לייצור רשתות ואלה המעוניינים לתכנן ניסויים שנפתרו בזמן.
Introduction
רקע
ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) אפשרו מחקרים מבניים של מערכות מורכבות יותר ויותר ברזולוציה גבוהה. למעט כמה יוצאים מן הכלל, מחקרים כאלה הוגבלו למקרומולקולים ביולוגיים בשיווי משקל1 או תגובות איטיות יחסית2. תהליכים רבים ב- vivo מתרחשים בציר זמן מהיר יותר (אלפיות שניה) ויש עניין גובר בהקפאה-EM (TrEM) שנפתרה בזמן בלוחות זמנים אלה3. עם זאת, הכנה מדגם cryo-EM קונבנציונאלי על ידי שיטת blotting הוא איטי מדי עבור TrEM אלפית השנייה.
לשיטת הכתמים יש מגבלות אחרות מלבד רזולוציית זמן ירודה. חלבונים ומתחמי חלבון יכולים לסבול דנטורציה או אוריינטציה מועדפת על רשתות4. הפחתת זמן החשיפה לממשק מי האוויר במהלך הכנת המדגם הוכח כדי למתן את הכיוון המועדף ואת denaturation חלבון5,6. לכן, הכנת רשת מהירה לא רק מאפשרת TrEM אלפיות השנייה, אלא גם יכול לשפר את איכות הרשת.
נכון לעכשיו, ישנן שלוש גישות שונות להכנת רשת אוטומטית. הגישה הראשונה משתמשת בסיכה או נימה המכילה כמות קטנה של מדגם. לאחר יצירת מגע בין הנוזל לבין משטח הרשת, המדגם 'כתוב' על הרשת7,8. תהליך היישום לדוגמה איטי יחסית ונמשך מספר שניות. גישה חלופית משתמשת בדור טיפות מבוקר על ידי מתקן פיזו ורשתות מנדלות עצמיות9. זה מאפשר חלוקה מהירה יותר להקפיא את הזמנים, אבל עדיין מוגבל על ידי טיפה ומהירות מנדלות (כרגע מגיע 54 ms). הגישה המהירה ביותר עד כה היא גישת הריסוס הישירה, שבה המדגם אטומ בזרבובית ספריי והטיפות הקטנות (~ 10 - 20 מיקרומטר) ומהירות (> 5 מ'/ש') מתפשטות במגע עם רשת cryo-EM. תרסיס מדגם יכול להיווצר בדרכים שונות כגון אטומיזרים airblast, גלים אקוסטיים פני השטח או מכשירי אדים קוליים10,11,12,13. מניסיוננו, עובי הקרח עם גישת הריסוס הישיר גדול יותר אך ריסוס ישיר מאפשר להקפיא את זמני < 10 מיליות.
פרוטוקול זה מתאר צעד אחר צעד כיצד ניתן להשתמש בהתקן EM (TED) שנפתר בזמן המצויד בזרבובית ריסוס מיקרופלואידית להכנת רשתות בציר זמן מהיר14,15. המכשיר שימש להכנת רשתות עם זמן השהיה מינימלי של 6 אלפיות השנייה בין יישום מדגם להקפאה ולערבוב מהיר ולהקפיא שתי דגימות. העיצוב של TED מבוסס עלגרסה קודמת 16 והוא דומה למכשירי cryo-EM מבוססי ריסוס אחרים17.
ראשית, ארבעת החלקים העיקריים של הגדרת TED מתוארים. ליבת ה-TED היא יחידת הטיפול בנוזלים, האחראית על שאיפה וחלוקה לדוגמה. בוכנה פנאומטית מעבירה את הרשת דרך התרסיס לתוך האתאן הנוזלי. הדור של התרסיס מושגת עם חרירים ריסוס microfluidic והקפאה נעשית במיכל אתאן נוזלי, אשר מתוארים בקצרה. לבסוף, התכונות הנוספות לשליטה בסביבת הרשת, במיוחד לחות, מסומנות. לאחר מכן יש פרוטוקולים מפורטים להפעלת המכשיר ולביצוע ניסויי TrEM. תוצאות מייצגות ניתנות להכנת רשת מהירה וניסוי TrEM פשוט.
התקנה ניסיונית
יחידת הטיפול בנוזלים
מערכת הטיפול הנוזלי של TED נוצרת על ידי שלוש משאבות כונן מזרק ('משאבות 1 - 3'), כל אחת מצוידת שסתום סיבובי(איור 1). ספק כוח מספק משאבות 1- 3 עם 24 V DC. תקשורת עם תוכנת הבקרה (כתובה ב- Visual Basic ו- C++) מתבצעת באמצעות ממשק RS232 לשאיבה 1. הפקודות מופצות דרך יציאות הרחבת קלט/פלט טוריות ממשאבה 1 למשאבות 2-3. משאבות 1-3 מצוידות במזרקי זכוכית (מזרקים 1-3', אנו משתמשים כאן במזרקי נפח מת μL/אפס). לכל שסתום יש שתי תנוחות, 'עומס' ו'לוותר '. תנוחת ה"עומס" משמשת לשאיפה לדגימה לתוך המזרק. חתיכה קצרה (~ 3 - 4 ס"מ) של 1/16 " O.D., 0.01′′ I.D. צינורות FEP מחובר באמצעות אביזרי FLFE / ETFE flANGELESS למיקום 'עומס' של שסתומים 1-3. פיסת צינורות קצרה זו מגיעה למאגר הדגימה (בדרך כלל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל או 0.5 מ"ל). תנוחת ה'מחלק' מובילה לזרבובית הריסוס. החיבור בין שקע 'לוותר' לבין זרבובית ספריי נעשה על ידי צינורות PE (~ 20-30 ס"מ אורך, 0.043 "O.D., 0.015 " I.D.), עם חתיכת קצרה של צינורות שרוול (~ 0.5 ס"מ) ואביזרים ETFE / ETFE flangeless.
הבוכנה הפנאומטית
TED משתמש בוכנה פנאומטית כדי להאיץ את הרשת ולהעביר אותו דרך תרסיס המדגם לתוך מיכל האתאן הנוזלי. פינצטה בלחץ שלילי מחזיקה את הרשת, מוברגת למחזיק ביתי שמותקן על גליל פנאומטי כפול(איור 2A).
הלחץ מסופק מבלון גז חנקן גדול (גודל W), המצויד בווסת רב-שלבי (0 - 10 בר, 'לחץ עיקרי'). צינורות PVC מחוזקים גמישים (12 מ"מ O.D.) מחברים את הרגולטור לסעפת 12 יציאות שבה מועבר חנקן בלחץ לזרבובית ולבוכנה הפנאומטית. זרימת גז דרך הזרבובית קבועה, מווסתת ישירות בצילינדר החנקן (הלחץ העיקרי). החיבור לזרבובית נעשה עם צינורות PU (4 מ"מ O.D., 2.5 מ"מ זהות), חתיכה קצרה של צינורות PE (~ 8 ס"מ אורך, 0.043 "O.D., 0.015 "I.D.) ומחברים מתאימים. לחץ על הבוכנה הפנאומטית נשלט באמצעות שסתום סולנואיד. צינורות PU (4 מ"מ O.D., 2.5 מ"מ זהות) מחבר את שסתום סולנואיד עם מווסת ואת הבוכנה פנאומטית, כדי לאפשר לחץ צלילה מופחת (≤ הלחץ העיקרי). שסתום סולנואיד נשלט על ידי המחשב. מבט כולל סכמטי על ההתקנה ניתן באיור 2B.
שים לב כי עם התקנה זו לחץ הצלילה הוא תמיד שווה או קטן יותר מאשר לחץ גז ספריי (לחץ עיקרי). עם זאת, ההתקנה יכולה להשתנות בקלות על ידי שילוב של וסת שני במעלה הזרם של זרבובית ספריי כדי לאפשר מהירויות צלילה גבוהות יותר בלחץ גז ספריי נמוך. לחצים גבוהים (>> 2 בר) עלולים להזיק לזרבובית ספריי PDMS.
זהירות: זוהי מערכת בלחץ ואת "הלחץ העיקרי" תמיד צריך להיות < 7 בר.
לחצים בין 0.5 ל 2 בר משמשים בדרך כלל עבור הבוכנה פנאומטית ומציגים קשר ליניארי בקירוב בין לחץ ומהירות (במיקום האנכי של התרסיס). מהירויות הצלילה נמדדות באוספילוסקופ, המחוברות בהתאם לפוטנציומטר שקופית (10 kΩ) ובמקביל נגד 2 kΩ (איור 2C). ספק כוח מספק את הפוטנציומטר עם 9 V DC. בעוד מהירות הצלילה המשוערת מוגדרת לפני הניסוי על ידי הגדרת לחץ הצלילה, הפוטנציומטר נותן קריאה מדויקת של המהירות לאחר הניסוי.
חריני ריסוס ומיכל אתאן נוזלי
הייצור וההפעלה של חריקות וירטואליות דינמיות גז עבור משלוח מדגם מבוסס ספריי תוארו במקומות אחרים בפירוט15. כפי שתואר לעיל, שקעי 'מחלק' של שסתומים 1-3 מחוברים למפרצונים הנוזליים של הזרבובית (איור 3A). גז הריסוס בלחץ מחובר לפצצת הגז של הזרבובית. המפרצונים בזרבוביות ספריי PDMS הן כאלה כי צינורות 0.043 "O.D. PE ניתן להשתמש ישירות ללא צורך אביזרי. עיצוב הזרבובית שלנו מכיל גיאומטריית 'סילון סילון' לערבוב של שתי דוגמאות, בדומה למכשיר המתואר בנציג18. תרשים של העיצוב מוצג באיור 3B, תמונה מיקרוסקופית של זרבובית מוצגת באיור 3C. הפריסה של המכשיר microfluidic דורש שימוש בשלושה מזרקים לערבב שתי דגימות. זרבובית הריסוס ממוקמת בדרך כלל במרחק של 1-1.5 ס"מ מהרשת (במהלך יישום מדגם).
אנו משתמשים באתאן נוזלי כקריוגן, במיכל אתאן נוזלי/חנקן המשמש לשיטת הכתמים הסטנדרטית. מיקום אנכי של האתאן הנוזלי מושגת עם פלטפורמת הרמת מעבדה.
שליטה בסביבת הריסוס והרשת
הבוכנה וזרבובית הריסוס כלולים בתוך תיבת PMMA (זכוכית אקרילית) שנבנתה בהתאמה אישית עם דלת כפולה(איור 4A). לחות יחסית גבוהה בתוך הקופסה מושגת על ידי מערכת לחות אוויר בחלק האחורי של TED (איור 4B). האוויר מסופק על ידי משאבה ומוזן למיכל הראשון של "10 (המשמש בדרך כלל לטיהור מי כיור). המיכל מלא בגובה מים נמוך (~ 5-10 ס"מ) וגם מכיל יחידת מכשירי אדים. עוצמת החשמל של מכשיר הלחות נשלטת על ידי בקר לחות/טמפרטורה דיגיטלי וחיישן לחות/טמפרטורה הממוקם בתוך קופסת הזכוכית האקרילית. הבקר מוגדר לכבות את המשאבה כאשר הלחות היחסית מגיעה ≥ 90%. אוויר לח מהמיכל הראשון נשאב דרך מפזר, שקוע במים במיכל 10 " שני ולאחר מכן נכנס לקופסת הזכוכית האקרילית.
אזהרה: מכיוון שהדגימה מתרסיס בזרבובית ספריי, דגימה ביולוגית או כימית מסוכנת אינם מתאימים כדגימות.
רצף הריצה
לחצן הפעל Script בתוכנת הבקרה מאתחל את רצף הריצה. ניתן להגדיר מראש רצף פקודות זה בקובץ Script ולשנותו באמצעות התוכנה. המשתנים החשובים ביותר מוסברים כאן:
מהירות ריסוס: מהירות הריסוס קובעת את קצב הזרימה הנוזלי המשמש את משאבת המזרק. ניתן לחשב את קצב הזרימה כדלקמן: למנועי משאבת המזרק המשמשים כאן יש גודל שלב קבוע. הטווח המלא של המשאבה מחולק ל-48,000 צעדים. הגורם החשוב השני הוא נפח המזרק. אנחנו בדרך כלל משתמשים במזרקי μL 250. מהירות הריסוס בתוכנת הבקרה מוגדרת כמספר שלבים/שניה. מהירות ריסוס של 1000 שלבים/שניה תואמת ל:
נפח ריסוס: נפח הריסוס קובע את הנפח הכולל שיש לרסס. לכן, הוא גם קובע את משך התרסיס. עוצמת הקול של הריסוס בתוכנת הבקרה מוגדרת כמספר שלבים. נפח ספריי של 2000 צעדים, במהירות ריסוס של 1000 צעדים לשנייה, מוביל משך ריסוס של 2 s ונפח כולל של 10.4 μL.
זמן קדם ריסוס: משתנה זה מגדיר את הזמן בין ייזום התרסיס לצלילה. חשוב לבחור את זמן ההשהיה כך שלתרסיס יש מספיק זמן לייצב לפני הצלילה ברשת. בדרך כלל, התרסיס ניתן 1.5 - 4 s כדי לייצב לפני הרשת הוא צלל. התרסיס נשמר עד שהרשת עברה. בדרך כלל, זרימת הנוזל (ולכן התרסיס) נעצר 0.5 ל 1 s לאחר הרשת כבר צלל. באמצעות מהירות ריסוס של 1000 צעדים/s ונפח ריסוס של 2000 צעדים, זמן טרום ספריי טיפוסי הוא 1.5 s, למשל.
רצף פקודות למופת מוצג באיור 5A, מיקום הרשת לאורך זמן מומחש באיור 5B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת המערכת
הערה: הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין רשתות של דוגמה אחת. בדרך כלל, מינימום של 2 רשתות לשכפל מוכנים עבור כל מדגם או תנאי. למהירויות צלילה גבוהות יותר (פחות מ- ~ 20 ms זמן השהיית זמן), רשתות 3 או 4 לשכפל מוכנים בדרך כלל להסביר מספר מופחת של אזורי קרח דקים.
- לדלל את דגימת החלבון לריכוז היעד במאגר הרצוי. בדרך כלל, ריכוזים סופיים ≥ 2 מ"ג / מ"ל לעבוד היטב להכנת רשת עם TED. שים לב כי המדגם יכול להישמר על קרח עד שלב 10, החל בשלב 10 ואילך המדגם יבלה זמן ניכר בטמפרטורת החדר כפי שלוקח כ 20 דקות להכין 3-4 רשתות.
- תדליק את ה-TED. לאחר מכן הפעל את מחשב הבקרה והפעל את תוכנת הבקרה.
- אתחל את כל משאבות המזרק על-ידי לחיצה על לחצן Initialize (לחצן שחור תחתון) בכל משאבת מזרק.
- הפעל את ספק הכוח של פוטנציומטר, הגדר אותו ל- V 9 והפעל את תוכנת בקרת האוסצילוסקופ.
- ודא כי שסתום הרגולטור של N2-צילינדרסגור. פתח את שסתום הגליל. לאחר מכן, לאט לפתוח את שסתום הרגולטור הגדרת לחץ השקע לערך הרצוי עבור לחץ גז ספריי (בדרך כלל 1-2 בר). עבור חרירים PDMS בשימוש כאן, לא להשתמש בלחצים גבוהים יותר ~ 2.5 בר כדי למנוע נזק לזרבובית. הגז הזורם ברציפות מונע מהנוזל לטפטף ולהצטבר בקצה הזרבובית מה שעלול להוביל לרסס בלתי ניתן לערעור.
- ודא שכל שסתומי משאבת המזרק נמצאים במצב 'עומס'. זה יכול להיעשות על ידי החלפת כל השסתומים למיקום 'לוותר' בתוכנת הבקרה ולאחר מכן בחזרה "עומס". השאר את כל השסתומים עברו ל'עומס '. הגדר את כל המזרקים לאפס.
- הסר את כל בועות האוויר הקיימות במערכת בשלב זה. כדי לעשות זאת, ייתכן שיהיה צורך לפתוח את המזרקים, להסיר בועות באופן ידני והמזרקים רכובים שוב כאשר אינם מכילים בועות נוספות.
- רכיבי הטיפול בנוזל מאוחסנים בדרך כלל ב- H2O. לפני טעינת הפתרון לדוגמה, יש לתעד את המערכת הנוזלית עם חוצץ על ידי שטיפת הצינורות עם עודף של חוצץ. השתמש בזרימת נוזלים מקסימלית מתאימה כדי למנוע לחץ יתר על זרבובית הריסוס. קצבי זרימה נוזליים > 10 μL/s עלולים לגרום נזק לזרירי PDMS המתוארים כאן.
- מניחים צינור 1.5 מ"ל המכיל ≥ 200 μL חוצץ על מזרק 1 (החלק העליון חייב להיות פירסינג כדי לצרף צינורות).
- ודא שסתום 1 הוא במצב 'עומס'. החלף את תוכנת הבקרה, במידת הצורך.
- שאף את הכמות הרצויה (בדרך כלל 50-100 μL) של חוצץ עם מזרק 1, באמצעות תוכנת הבקרה.
- החלף שסתום 1 למיקום 'לוותר', באמצעות תוכנת הבקרה.
- מחלק את כל הנוזל במזרק 1, באמצעות תוכנת הבקרה.
- חזור שסתום כדי 'עומס', לאפס את מיקום המזרק ל '0' בתוכנית ולחץ על אתחול על מזרק 1, כדי להכין את המערכת למחזור הבא.
הערה: שלבים 1.9.1 - 1.9.5 חוזרים בדרך כלל שלוש פעמים כדי להבטיח כביסה יסודית של הצינורות.
- טען פינצטה עם רשת EM (אין דרישה לכל סוג מסוים) על ידי שחרור היד צוללת מהדק, הצבת פינצטה מהדק והידוק המהדק.
- הזז ידנית את זרוע הצלילה כך שהרשת והזרבובית נמצאות באותו גובה (מיקום 'היישום לדוגמה'). אם זרבובית ורשת מיושרים, נוזל יצטבר על הרשת לאחר ריסוס לתקופה ממושכת. במידת הצורך, התאם את מיקום הזרבובית.
- התאימו את מיקום האתאן הנוזלית על ידי הזזה ידנית של הזרוע הצוללת עם פינצטה רכובה למיקום הסופי שלה (הגעה לכוס האתאן). כאשר מוגדר כראוי, רשת המוחזקת על ידי פינצטה תגיע בערך למרכז האתאן הנוזלי.
- ודא ש- 'run Script' ישתמש בתקצבי הזרימה, באמצעי האחסון ובתזמונים הרצויים. עיין בסעיף 'רצף הריצה' לעיל לקבלת פרטים.
- ודא ששום דבר לא חוסם את נתיב הבוכנה. שאף את נפח המאגר הנדרש לריצה בודדת למזרק 1. פעולה זו מתבצעת בתוכנת הבקרה, ראה סעיף 'רצף הריצה' עבור הגדרה ואמצעי אחסון טיפוסיים. לאחר מכן ודא שסתום 1 הוא עבר למצב 'לוותר'. בצע בדיקה מופעלת על-ידי הקשה על הפעל Script בתוכנת הבקרה.
אזהרה: התרחקו מה-TED עד לסיום רצף הריצה. העברת חלקים עלולה לגרום לפציעה! - כאשר 'רצף הריצה' מסתיים, הגדר את הלחץ על הזרוע הצוללת לערך הרצוי (בדרך כלל 1-2 פס). רק לאחר מכן לחץ על אישור בתוכנת הבקרה כדי לשחרר לחץ מזרוע הצלילה. אם יש להתאים את 'רצף הריצה' או הלחץ על הזרוע הצלילה, הגדרות אלה עשויות להשתנות בשלב זה ושלבים 1.13 - 1.15 חוזרים על עצמם.
2. הכנת רשת מהירה
- מלאו תחילה את מיכל האתאן/חנקן הנוזלי בחנקן נוזלי. כאשר קר מספיק ללא חנקן נוזלי, למלא את הכוס עם אתאן נוזלי. הימנע התגבשות של האתאן הנוזלי. שלב זה זהה להכנה קונבנציונלית של הרשת.
הערה: כדי למזער את זיהום האתאן, ודא כי שלבים 2.2 - 2.13 מבוצעים מהר ככל האפשר
זהירות: אתאן נוזלי הוא קריוגן ודליק. יש להסתפיד בעת הטיפול. - הכן רשתות קריו-EM לפריקה זוהרת. אנחנו בדרך כלל משתמשים ברשתות פחמן חוריות ופריקה זוהרת עבור 90 s, בלחץ אוויר 0.1 mbar ו 10 mA. בדרך כלל, לא יותר מ 4 רשתות הם זוהר משוחררים בכל פעם. הרשתות משמשות בתוך 30 דקות של פריקת זוהר.
- ישילב את הצינורות עם מדגם (בעקבות שלבים 1.9.1 - 1.9.5, באמצעות מדגם במקום חוצץ). אם נפח המדגם הזמין נמוך, ייתכן שהאובבים ישוללו עם נפח מת אחד בלבד.
- שאף את כמות המדגם הדרושה לריצה בודדת למזרק 1 בתוכנת הבקרה (ראה סעיף 'רצף הריצה' לקבלת פרטים). לאחר מכן לעבור שסתום 1 למצב 'לוותר'.
- בדוק שהלחות היחסית הגיעה לערך הרצוי (בדרך כלל אנו מכינים רשתות ב- 60% לחות יחסית ומעלה). לאחר ≥ 60% לחות הוא הגיע, לפתוח את תא הלחות רק למשך פרק זמן מינימלי, כדי לשמור על לחות גבוהה.
- מניחים את פינצטה, מחזיקים רשת זוהרת, בפוכנה פנאומטית ולתקן אותם. הזז את הבוכנה למיקום ההתחלה שלו (בחלק העליון).
- ודא שהמחוון של הפוטנציומטר נמצא במצב ההתחלה, מוכן למדידה, על-ידי הזזתו ידנית ליצירת קשר עם הבוכנה. הגדר את הגורם המפעיל על האוסצילוסקופ בתוכנת האוסצילוסקופ.
- מניחים את מיכל האתאן/חנקן הנוזלי.
- הקש הפעל Script בתוכנת הבקרה. כאשר תתבקש, לחץ על אישור בתוכנת הבקרה כדי להתחיל את ההפעלה.
אזהרה: התרחקו מה-TED עד לסיום רצף הריצה. העברת חלקים עלולה לגרום לפציעה! - לאחר השלמת 'רצף הריצה', שחרר את הלחץ על הבוכנה הפנאומטית על-ידי לחיצה על אישור בתוכנת הבקרה.
- תא לחות פתוח, לשחרר את הקשר בין זרוע צוללת פינצטה ביד אחת תוך הבטחת פינצטה עם השני. כאשר פינצטה חופשית, להזיז את זרוע הצלילה למעלה תוך שמירה על הרשת באתאן הנוזלי. לאחר מכן העבר את הרשת לשטח האחסון שלה בנוזל N2שמסביב . לאחר הקפאה, הרשת צריכה להישמר בטמפרטורת N2 נוזלית בכל עת.
- שמור את מדידת האוסצילוסקופ. אפס באופן ידני את המיקום של מחוון פוטנציומטר ואת הבוכנה לאחר מכן.
- חזור על שלבים 2.4-2.12 כדי להכין רשתות שכפול
- העבר את הרשתות לאחסון לטווח ארוך עד לחיתוך רשת ואיסוף נתונים.
- לשטוף את המערכת עם חוצץ, על פי שלבים 1.9.1 - 1.9.5. ואז לשטוף את המערכת עם H2O, על פי שלבים 1.9.1 - 1.9.5.
- כבה את וסת הגז הראשי של החנקן וכבה את החשמל.
- מניחים את מיכל האתאן/חנקן במכסה המנוע כדי לתת לו להתחמם ולתת לאתאן הנוזלי ול-N2 להתאדות.
3. קריו-EM שנפתר בזמן
הערה: כאשר ניסויים שנפתרו בזמן נערכים עם TED, יש לקחת בחשבון היבטים נוספים, אם כי ההתקנה הבסיסית והמשתנים נשארים זהים. ההנחה כאן היא כי שני פתרונות מעורבים ביחס 1:1 (v / v) כדי לייצר את התערובת הסופית אשר מופקד על הרשת. 'פעל לפי הפרוטוקול המתואר ב-1. הכנת רשת מהירה עם TED', עם השינויים הבאים:
- השתמש בריכוזים גבוהים יותר במלאי לערבוב ניסויים מאשר לניסויי ספריי פשוטים. ערבוב ביחס של 1:1 (v/v) יביא לדילול של פי 2 של כל רכיב.
- לניסוי ערבוב מהיר, השתמש בכל שלושת המזרקים ולא רק באחד.
- חבר צינורות למשאבות מזרק 2-3.
- יש לחבר צינורות ממשאבות מזרק 2-3 לזרבובית הריסוס.
- ישילב את כל שלושת המזרקים במאגר ודגימה בנפרד. בדרך כלל, מזרק 1 מלא בדגימה A ומזרקים 2-3 מלאים בדגימה B(איור 3).
- שנה את רצף הריצה. דוגמה לרצף ריצה באמצעות כל שלושת המזרקים לניסוי ערבוב מהיר ניתנת באיור 6. עיין גם בסעיף 'רצף הריצה' לקבלת פרטים.
- עיכובים שונים בזמן ניתן להשיג בשתי דרכים:
- לשנות את מהירות הבוכנה. על ידי התאמת מהירות הבוכנה, ניתן לשנות את השהיית הזמן בטווח צר יחסית. לדוגמה, עם מרחק ריסוס / אתאן של 2 ס"מ, הבוכנה ניתן להזיז ב 1 מ '/s או 2 מ '/s לתת עיכוב זמן של 20 ms או 10 ms, בהתאמה. זה נעשה כמתואר בשלב 1.15.
- שנה את מיקום הריסוס/אתאן על-ידי התאמת המיקום (האנכי) של זרבובית הריסוס. אם הזרבובית ממוקמת במרחק של 5 ס"מ מפני השטח של האתאן, למשל, מהירות צלילה של 1 מ'/ש' נותנת עיכוב זמן של 50 אלפיות שניה. השגת עיכובים ארוכים יותר באופן משמעותי בזמן דורשת שינויים נוספים בהתקנה.
הערה: בשל זרימת למינאר באזור מיקוד הזרימה של הזרבובית, איננו מצפים לערבוב משמעותי בחלק זה של הזרבובית. במקום זאת, אנו צופים כי ערבוב מתרחש במהלך יצירת ספריי, בטיפות בדרך לרשת ובמהלך התפשטות טיפה על הרשת. זמן הטיסה עבור טיפות ספריי להגיע לרשת מוערך ≤ 1 אלפיות שני (למהירות טיפה של ≥ 10 מ '/s ומרחק רשת זרבובית של 1 ס"מ). לכן, רק הזמן בין נחיתת טיפה וvitrification נחשב "עיכוב זמן".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנת רשת מהירה עם TED
כדגימה בדיקה להכנת רשת מהירה, השתמשנו אפופריצין מטחול סוסים ב 20 מיקרומטר ב 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5. שחזור ברזולוציה של 3.5 Å התקבל מ 690 מיקרוגרפים כמתואר ב ref.15 (איור 7A). טווח הפירוק נבחר כך שניתן לזהות חלקיקים בקלות בתמונות הגולמיות(איור 7B). רשת טיפוסית שהוכנה עם עיכוב זמן של 10-40 אלפיות שני מראה מספיק שטחים של קרח דק(איור 7C)כדי לאפשר איסוף של > 1000 מיקרוגרפים. הרזולוציה המתקבלת מוגבלת ככל הנראה על ידי עובי קרח, ניתוח טומוגרפי של מספר רשתות שונות הראה 96 ± 33 ננומטר עובי קרח6.
קריו-EM שנפתר בזמן
על מנת להדגים ערבוב מהיר ורזולוציית זמן באמצעות TED, השתמשנו בניתוק של קומפלקס actomyosin על ידי ערבוב עם ATP כתגובת מודל19. בחירה זו התבססה על ההבחנה הקלה בין אקונומיוסין לבין F-actin חינם ממיקרוגרפים גולמיים ואת הקינטיקה המובנת היטב של התגובה.
להלן, התוצאות הייצוגיות עבור TrEM של ניתוק מתחם actomyosin על ידי ATP מוצגים. הליכים ניסיוניים מפורטים ותוצאות מסופקים בנציג19. בקצרה, F-actin וארנב שלד מיוסין S1 היו מעורבים 10 mM MOPS, 50 mM KAc, 2 מ"מ MgCl2, 0.1m EGTA, pH 7 בריכוזים מונומר סופיים של 40 מיקרומטר כדי להכין את מתחם actomyosin (AM). קומפלקס AM נטען למזרק 1 ו 200 μM MgATP באותו חיץ נטען למזרקים 2 ו -3. הפרמטרים הניסיוניים העיקריים עבור שתי נקודות הזמן השונות שהוכנו מפורטים בטבלה 1.
עבור שתי נקודות הזמן, התוצאה הייתה תערובת 1:1 v /v של קומפלקס AM ו MgATP, נותן ריכוזים סופיים של 20 μM AM קומפלקס ו 100 μM MgATP. ערבוב מחושב בזמני הקפאה היו 7 ו -13 ms כפי שמוצג בטבלה 1. זמן הטיסה המשוער של טיפות ספריי בין זרבובית לרשת היה < 1 אלפיות שני.
ערכת נתונים קטנה של cryo-EM (306 ו-123 מיקרוגרפים) נרכשה עבור כל נקודת זמן והנתונים המשולבים שעובדו באמצעות הליכי עיבוד סללי סטנדרטיים20. שחזור הקונצנזוס שנוצר (שתי נקודות הזמן יחד) מוצג באיור 8A. הנתונים המשולבים היו נתונים לסיווג ממוקד ופוצלו למתחם AM ולמעמד F-actin(איור 8B,C). לאחר מכן, חושב השבר של חלקיקי AM-complex או F-actin עבור כל נקודת זמן ומוצג באיור 8D.
קבוע שיעור ההזמנה השני עבור דיסוציאציה מורכבת AM הוא 1.5 · 106 M-1 s-1 21. תחת ההנחה
ניתן להעריך את חוק התעריפים המשולבים ל:
כאשר [AM-complex] הוא הריכוז תלוי הזמן של קומפלקס AM, [AM-complex]0 הוא הריכוז הראשוני, k הוא קבוע שיעור ההזמנה השנייה ו- [ATP]0 הוא ריכוז ה- ATP (הראשוני).
באמצעות משוואה זו, הקינטיקה של דיסוציאציה מורכבת AM עוצבה. המודל מסכים באופן סביר עם נתוני TrEM הניסיוניים. קיימת שונות משמעותית למיקרוגרף כפי שמוצג באיור 8D.
איור 1: התקן EM (TED) שנפתר בזמן. (A) סקירה כללית של TED. (B)יחידת הטיפול בנוזל עם משאבות 1-3. המשאבה הרביעית משמאל אינה משמשת בעבודה זו. מיקום עומס וחלוקה מסומנים עבור שסתום 1, כמו גם מאגר המדגם ('מדגם 1'). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בוכנה פניאומטית ופוטנציומטר ליניארי. (A)פרטים על הבוכנה הפנאומטית של TED עם רכיבים חשובים המסומנים. (B)סכמטי של המערכת הפנאומטית של TED. המספרים תואמים לצילינדר N2 (1), לווסת הלחץ הראשי (2), לזרבובית הריסוס (3), שסתום הסולנואיד (4), לווסת מהירות הצלילה (5) ולצליל הפנאומטי הכפול (6). (C)שרטוט של המעגל עבור פוטנציומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חריני וירטואליים דינמיים לגז לערבוב וריסוס. (A)זרבובית עם 4 צינורות נכנס מחוברים, כדי לספק דגימות (A ו- B) וגז N2. (B)סכמטי של החלק המרכזי של PDMS ספריי חרירים עם זרימה כפולה מיקוד גיאומטריה כדי להשיג מיקוד זרימה (לערבוב במורד הזרם) ומיקוד גז או אטומיזציה. דגימה B מוצגת בצהוב ודגימה A בסגול. (C)תמונה מיקרוסקופית של מקטעי הערבוב והאטומיזציה של הזרבובית המיקרופלואידית. תמונה מנציג15. סרגל קנה מידה 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בקרה סביבתית על הרשת וריסוס בקופסת הזכוכית האקרילית. (A) מבט מקדימה ו-(B)מצד ה- TED. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: רצף הריצה. (A) רצף ריצה לדוגמה המציג משתנים בחלק העליון ואת רצף הפקודות בתחתית. חלק מפקודות המפתח מובאות באדום. (B)מיקום רשת לאורך הזמן של 'רצף ריצה' המוצג כקו מוצק שחור. מיקום ההתחלה של הרשת הוא 0 ס"מ. ספריי מופעל ב t = 0 s עבור 2 s, המרחק בין ספריי ואתאן נוזלי הוא ~ 2 ס"מ. ב 1.5 s, הרשת מתחילה לנוע עם 2 מ '/s, דרך התרסיס לתוך האתאן הנוזלי. הרצף מסתיים כאשר התרסיס נעצר לאחר 2 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: רצף ריצה לדוגמה לניסוי ערבוב מהיר. הבדלים חשובים באיור 5 A מובאים באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תוצאות מייצגות מניסוי תרסיס פשוט. (A)3.5 Å שחזור של אפופריצין סוסים מרשת שהוכנה ב-36 אלפיות שניה בין ריסוס להתחדשות (EMD- 10533). (B)תמונה גולמית של אותה דגימת אפופריצין. (C)תצוגת הגדלה נמוכה של הרשת, ריבוע רשת מופתי אחד המכיל קרח דק מודגש על ידי המלבן הכחול המקווקו, שטח הקרח הדק בתוך ריבוע רשת זה מצוין על ידי החץ הכחול. אזורים של קרח עבה או זיהום מסומנים עם כוכביות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: תוצאות מייצגות מניסוי ערבוב. (א)שחזור קונצנזוס של קומפלקס AM המוצג בסף גבוה (צבעוני) ובסף נמוך (שקוף). צפיפות מיוסין אחת מסומנת ומודגשת בקו מקווקו. השחזור נוצר מנתונים משתי נקודות הזמן יחד. (B)כיתת F-actin מראה שום מיוסין כבול. (C)AM-כיתה מורכבת המציגה מיוסין כבול (מיוסין באפור, קשור בעיקר לאקטין אדום בהיר). (D)השוואה בין מודל קינטי לבין נתוני TrEM ניסיוניים. מוצג השבר של AM-מורכב ביחס לריכוז הראשוני. נקודות שחורות גדולות ומוצקות מציינות נתוני TrEM ממוצעים, נקודות קטנות מציגות נתוני TrEM לפי מיקרוגרף. הקו המקווקו הסגול מייצג את המודל הקינטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| flowrate (μL/s) | מרחק ריסוס/אתאן (ס"מ) | מהירות צלילה (m/s) | השהיית זמן (ms) | |||
| מזרק 1 | מזרק 2 | מזרק 3 | ||||
| (AM) | (ATP) | (ATP) | ||||
| 7 מיליות | 2.08 | 1.04 | 1.04 | 1.4 | 2 | 7 |
| 13 מיליות | 1.04 | 0.52 | 0.52 | 2 | 1.6 | 13 |
טבלה 1: הגדרות ניסיוניות עבור TrEM של דיסוציאציה מורכבת של AM על-ידי ATP
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים בעבודה זו יכולים לשמש להכנת רשת מהירה על ידי ריסוס ישיר וניסויים TrEM. הכנת רשת מהירה יכולה לשמש כדי להפחית אינטראקציות חלקיקים עם ממשק מי האוויר5. המגבלות העיקריות הן ריכוז המדגם הזמין ועובי הקרח ברשת. בתוך גבולות אלה ובתנאי שאיכות המדגם טובה, הפרוטוקול מייצר רשתות המתאימות להקפאה-EM ברזולוציה גבוהה.
פתרון בעיות
קצב זרימה נוזלי ומהירות רשת קובעים את כמות הנוזל המופקד על הרשת. עם ההגדרות לדוגמה שניתנו לעיל (זרימה נוזלית 5 μL/s ומהירות צלילה 1-2 מ'/ש'), כיסוי טוב של הרשת עם טיפות צפוי. אם הזרבובית לא הייתה מיושרת היטב (כך טיפות ספריי לפספס את הרשת), רשתות קפואות להראות מעט מאוד או לא טיפות.
לא ניתן להימנע לחלוטין מזיהום רשתות (ראו איור 7C)אך ניתן לצמצם אותה על ידי מזעור זמן החשיפה של אתאן נוזלי לסביבה לחה. זה מושג על ידי הכנת רשתות לשכפל מהר ככל האפשר (≤ 20 דקות עבור 4 רשתות). אנחנו בדרך כלל להכין 4 רשתות לפני החלפת האתאן הנוזלי.
קרח זגג על רשתות עשוי (חלקית) להתגבש אם הקירור הראשוני באתאן נוזלי הוא איטי מדי. בהסכמה עם מחקר קודם22, מצאנו מהירויות צלילה נמוכות (< 0.5 מ '/ש') להוביל לעלייה של קרח גבישי. אזורים של קרח סמיך מאוד (≥ 200 ננומטר) בדרך כלל מראים קרח גבישי עקב קירור איטי יותר מטבעו. אם הרשת מתחממת במהלך כל השלבים שלאחר הכנת הרשת (העברה מאתאן נוזלי לחנגן נוזלי, העברה לאחסון וכו ')קרח גבישי עלול להתרחש, מדי.
רכישת נתונים עבור רשתות מוכנות של TED
עובי הקרח הממוצע המיוצר על ידי TED הוא עבה יותר מרשת ה-Cryo-EM "האידיאלית" המוכנה במערכת סופגת סטנדרטית. עובי הקרח יכול גם להשתנות בין אזורי רכישה. משמעות הדבר היא כי אזורי רכישה צריך להיבחר בקפידה כדי לתת את הקרח הדק ביותר האפשרי. ייתכן שיהיה צורך להתאים את טווח ההשבתה כדי לקבל תמונות עם ניגודיות גבוהה. כאשר הקרח סמיך ולחלקיקים יש ניגודיות נמוכה, אנו מציעים רכישת נתוני פיילוט ראשונית באמצעות ערכי נטרול גבוהים מאוד (3 - 5 מיקרומטר). עבודה אחרונה מציעה כי רזולוציה גבוהה עדיין ניתן להשיג באמצעות ערכי נטרול גבוהים כאלה23.
עבור איסוף נתונים קריו-EM קונבנציונלי, ערכת נתונים שלמה נאספה לעתים קרובות מרשת אחת. עם זאת, מצאנו את האיסוף של ערכות נתונים קטנות מרובות ומיזוג של ערכות נתונים אלה שימושיות. בדרך זו, נקודות זמן מרובות ניתן להקליט בתוך זמן מיקרוסקופ מוגבל ונקודות זמן של עניין ניתן לזהות.
עיבוד וניתוח של נתוני TrEM
מיזוג של ערכות נתונים יכול להיעשות באופן שגרתי בתוכנת עיבוד הנתונים הנפוצה ביותר של Cryo-EM. כפי שתואר לעיל ובעבודתם של אחרים, מיזוג של ערכות נתונים מנקודות זמן נפרדות יכול להיות שימושי17. חשוב כי חלקיקים ניתן לייחס בחזרה תת-קבוצה המקורית שלהם (נקודת זמן) לאורך העיבוד.
מדידות קינטיות קונבנציונליות (לדוגמה באמצעות פיזור אור או פלואורסצנטיות) יכולות להיות תוספת חשובה לניסויי TrEM. ניתן להשתמש בקבועי שיעור ממדידות ביוכימיות כדי לחזות תקופות חיים של מצב ביניים של עניין, או לאישור הקינטיקה שנצפו על ידי TrEM. להקדמה בסיסית לקינטיקה של תגובה וליחסם למחקרים מבניים שנפתרו בזמן, ראה ref.24.
ישנן מספר סיבות אפשריות להבדלים בין TrEM לניסויים קינטיים קונבנציונליים. כפי שמוצג באיור 8D, נתוני TrEM יכולים להציג וריאציות משמעותיות למיקרוגרף. כמו כן, נציין כי נתונים ראשוניים מצביעים על שונות של לפחות 5% במספרי חלקיקים יחסיים בין רשתות שכפול. סיווג חלקיקים (הקצאת מחלקה) יכול להיות לא מושלם, במיוחד אם מצבים דומים מבחינה מבנית או אם מבנה הוא גמיש מאוד. חלקיקים, ולכן הקינטיקה שמקורה ב- TrEM, עשויים להיות מושפעים גם מאינטראקציות חלקיקים עם ממשק מי האוויר מכיוון שאינטראקציות כאלה מופחתות אך אינן מסולקות במהירויות גבוהות.
עבודה זו מספקת כמה קווים מנחים עבור TrEM אך אנו מציינים כי זהו תחום מחקר פעיל, ואנו מצפים להתקדמות נוספת בעתיד. בעוד שניסויי TrEM דורשים מאמץ ניסיוני משמעותי, הם יכולים להציע תובנות ברזולוציה גבוהה על הדינמיקה של מתחמי מקרומולקולריים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למולי ס.C גרייבט על דיונים מועילים וצוות מתקן ABSL על העזרה באיסוף נתונים של cryo-EM. דייוויד פ. קלבל הוא דוקטורנט בתוכנית הדוקטורט ל-Wellcome Trust במרכז אסטבורי במימון אוניברסיטת לידס. המיקרוסקופים של FEI Titan Krios מומנו על ידי אוניברסיטת לידס (פרס ABSL UoL) וקרן Wellcome (108466/Z/15/Z). עבודה זו מומנה על ידי מענק BBSRC לסטיבן פ. מונץ ' (BB/P026397/1) ונתמכה על ידי מענקי מחקר להווארד ד. ווייט מאיגוד הלב האמריקאי (AMR21-236078) ולהווארד ד. ווייט ו-ויטולד גלקין מהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (171261).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10x70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
References
- Murphy, B. J., et al. Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling. Science. 364, (2019).
- Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH. Nature. , 1-4 (2020).
- Dance, A. Molecular motion on ice. Nature Methods. , 1-5 (2020).
- D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
- Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15, 793-795 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales. BioRxiv. , (2020).
- Ravelli, R. B., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11, 1-9 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).
- Feng, X., et al. A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM. Structure. 25, 663-670 (2017).
- Ashtiani, D., et al. Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation. Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11, 1-14 (2020).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, (2019).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).
- White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Protein Complex Assembly. , Springer. 59-71 (2018).
- Trebbin, M., et al. Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions. Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).
- Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).
- He, S., Scheres, S. H. Helical reconstruction in RELION. Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).
- Millar, N. C., Geeves, M. A. The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1. FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).
- Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging. Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).
- Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading. bioRxiv. , (2020).
- Bagshaw, C. A beginner's guide to flow kinetics. The Biochemist. 42, (2020).
