Summary
여기에서는 빠른 그리드 제작과 시간 해결 실험을 수행하기 위해 빠른 혼합 및 동결을 위한 신속한 그리드 제작 장치를 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
저온 전자 현미경 검사법(cryo-EM) 분야는 새로운 하드웨어 및 처리 알고리즘으로 빠르게 발전하여 더 까다로운 시스템에 대한 고해상도 구조와 정보를 생성하고 있습니다. 저온-EM에 대한 샘플 준비는 기존의 블로팅 시스템을 대체하기 위해 새로운 접근 방식이 개발되면서 유사한 혁명을 겪고 있습니다. 여기에는 압전 전기 디스펜서, 핀 인쇄 및 직접 살포의 사용이 포함됩니다. 이러한 발전의 결과로 그리드 준비 속도는 초에서 밀리초로 이동하여 특히 단백질과 기판이 급락하기 전에 빠르게 혼합될 수 있는 시간 해결 된 냉동 고극 EM 분야에서 짧은 수명 중간 상태를 트래핑하는 새로운 기회를 제공합니다. 여기에서는 표준 빠른 그리드 준비와 시간 해결 실험을 위해 사내 시간 해결 EM 장치에서 그리드를 만들기 위한 표준 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 4개의 그리드의 제조를 위해 ≥ 2 mg/mL의 농도에서 약 50 μL 샘플을 요구합니다. 샘플 응용 프로그램과 동결 사이의 지연은 10 ms만큼 낮을 수 있습니다. 한 가지 제한은 더 빠른 속도로 얼음 두께가 증가하고 블로팅 방법에 비해 증가한다는 것입니다. 이 프로토콜이 다른 사람들이 자신의 그리드 제작 장치와 시간 해결 된 실험을 설계하는 데 도움이되기를 바랍니다.
Introduction
배경
냉동 전자 현미경 검사법 (극저온-EM)의 최근 개발은 고해상도에서 점점 더 복잡해지는 시스템의 구조 연구를 가능하게했습니다. 몇 가지 예외를 제외하고, 이러한 연구는 평형1 또는 상대적으로 느린 반응2에서생물학적 거대 분자로 제한되었습니다. 생체 내 많은 프로세스는 더 빠른 시간 척도(밀리초)에서 발생하며 이러한 기간3에서시간 해결 된 저온 EM (TrEM)에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 그러나, 블로팅 방법에 의한 종래의 극저온-EM 샘플 제제는 밀리초 TrEM에 비해 너무 느립니다.
블로팅 방법은 가난한 시간 해결 외에 다른 제한이 있습니다. 단백질 및 단백질 복합체는 그리드4에서데우레이션 또는 선호하는 방향으로 고통받을 수 있다. 시료 준비 중 공기-물 인터페이스에 대한 노출 시간을 줄이는 것은 바람직한 방향 및 단백질 탈약5,6을완화하는 것으로 나타났다. 따라서 빠른 그리드 준비는 밀리초 TrEM을 가능하게 할 뿐만 아니라 그리드 품질을 향상시킬 수 있습니다.
현재 자동화된 그리드 준비에는 세 가지 접근 방식이 있습니다. 첫 번째 방법은 소량의 샘플을 보유하는 핀 또는 모세관을 사용합니다. 액체와 그리드 표면 사이의 접촉을 설정한 후 샘플은 그리드7,8에'기록'된다. 샘플 응용 프로그램 프로세스는 비교적 느리고 몇 초 정도 걸립니다. 대체 접근법은 압전 디스펜서와 자기 위킹 그리드9에의해 제어 된 액적 생성을 사용합니다. 이렇게 하면 더 빠른 디스펜스가 시간을 동결할 수 있지만 여전히 액적 및 속지 속도(현재 54ms에 도달)에 의해 제한됩니다. 지금까지 가장 빠른 접근법은 시료가 분무 노즐로 분무되고 작은 (~ 10 - 20 μm) 및 크저온-EM 그리드와 접촉할 때 빠른 (> 5m/s) 방울이 퍼지는 직접 스프레이 접근법입니다. 시료 분무는 에어블라스트 분무기, 표면 음향파 또는 초음파가습기(10,11,12,13)와같은 다양한 방법으로 생성될 수 있다. 우리의 경험에서, 직접 살포 접근 방식과 얼음 두께는 더 크지만 직접 살포는 분배가 10 ms< 시간을 동결 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 미세 유체 스프레이 노즐을 장착한 시간 해결 된 EM 장치 (TED)가 빠른 시간 척도14,15에서그리드를 준비하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 단계별로 설명합니다. 이 장치는 샘플 응용 프로그램과 동결 사이에 최소 6ms의 지연 시간으로 그리드를 준비하고 두 개의 샘플을 빠르게 혼합하고 동결하는 데 사용되었습니다. TED의 디자인은 이전버전(16)을 기반으로 하며 다른 스프레이 기반 시간 해결 극저온-EM장치(17)와유사하다.
첫째, TED 설정의 네 가지 주요 부분이 설명된다. TED의 핵심은 샘플 포부 및 분배를 담당하는 액체 처리 장치입니다. 공압 플런저는 스프레이를 통해 그리드를 액체 에탄으로 이동합니다. 스프레이의 생성은 미세 유체 스프레이 노즐로 달성되고 동결은 액체 에탄 용기에서 수행되며, 이는 간략하게 설명된다. 마지막으로 그리드 환경, 특히 습도를 제어하는 추가 기능이 강조 표시됩니다. 그 다음에는 장치 작동 및 TrEM 실험을 수행하기 위한 자세한 프로토콜이 뒤따릅니다. 빠른 그리드 준비와 간단한 TrEM 실험을 위한 대표적인 결과가 제공됩니다.
실험 설정
액체 처리 장치
TED의 액체 처리 시스템은 3개의 주사기 구동 펌프('펌프 1 - 3')에 의해 형성되며, 각각 로터리밸브(그림 1)가장착되어 있습니다. 전원 공급 장치는 펌프 1 - 3, 24 V DC를 제공합니다. 제어 소프트웨어와의 통신(비주얼 베이직 및 C++로 작성)은 RS232 인터페이스를 통해 펌프 1을 제공합니다. 명령은 펌프 1에서 펌프 2-3까지 직렬 I/O 확장 포트를 통해 배포됩니다. 펌프 1-3에는 유리 주사기(주사기 1-3', 250 μL/제로 데드 볼륨 주사기를 사용)가 장착되어 있습니다. 각 밸브에는 '로드'와 '디스펜스'의 두 위치가 있습니다. '부하' 위치는 샘플을 주사기에 흡인하는 데 사용됩니다. 1/16의 짧은 조각 (~ 3 - 4cm) O.D., 0.01′′ I.D. FEP 튜브는 ETFE /ETFE flangeless 피팅을 통해 밸브 1-3의 '로드' 위치에 연결됩니다. 이 짧은 튜브 조각은 샘플 저장소(일반적으로 1.5mL 또는 0.5mL 플라스틱 튜브)에 도달합니다. '디스펜스' 위치는 스프레이 노즐로 이어집니다. '디스펜스' 콘센트와 스프레이 노즐 의 연결은 PE 튜빙(~ 20-30cm 길이, 0.043" O.D., 0.015" I.D.), 소매 튜브(~0.5cm) 및 ETFE/ETFE 플랑지 피팅으로 만들어집니다.
공압 플런저
TED는 공압 플런저를 사용하여 그리드를 가속화하고 샘플 스프레이를 통해 액체 에탄 용기로 이동합니다. 음압 핀셋은 그리드를 잡고, 듀얼 로드 공압 실린더(그림2A)에장착된 홈 내장 홀더에 나사로 고정됩니다.
압력은 다단계 레귤레이터 (0 - 10 bar, '주요 압력')가 장착 된 대형 질소 가스 실린더 (크기 W)에서 공급됩니다. 유연한 강화 PVC 튜브(12mm O.D.)는 레귤레이터를 12포트 매니폴드에 연결하여 가압 질소를 노즐과 공압 플런저로 전달합니다. 노즐을 통과하는 가스 흐름은 일정하며 질소 실린더(main pressure)에서 직접 조절됩니다. 노즐과의 연결은 PU 튜빙(4mm O.D., 2.5mm I.D.), PE 튜빙(~ 8cm 길이, 0.043" O.D., 0.015" I.D.) 및 적절한 커넥터로 만들어집니다. 공압 플런저에 대한 압력은 솔레노이드 밸브를 통해 제어됩니다. PU 튜빙(4mm O.D., 2.5mm I.D.)은 솔레노이드 밸브를 레귤레이터 및 공압 플런저와 연결하여 급락 압력(≤ 주 압력)을 줄입니다. 솔레노이드 밸브는 컴퓨터 제어됩니다. 설정에 대한 회로도 개요는 그림 2B에제공됩니다.
이 설정을 사용하면 급락 압력은 항상 분무 가스 압력(주 압력)보다 동일하거나 작습니다. 그러나, 낮은 스프레이 가스 압력에서 더 높은 플런지 속도를 허용하기 위해 스프레이 노즐의 두 번째 레귤레이터 상류를 통합하여 설정을 쉽게 변경할 수 있습니다. 고압(>> 2bar)은 PDMS 스프레이 노즐을 손상시킬 수 있습니다.
주의: 이것은 가압 시스템이며 '주요 압력'은 항상 7 bar<되어야합니다.
압력0.5와 2 바 사이의 압력은 일반적으로 공압 플런저에 사용되며 압력과 속도 사이의 대략 선형 관계를 표시합니다(스프레이의 수직 위치에서). 플런지 속도는 오실로스코프로 측정되며, 슬라이드 전위도(10kΩ)에 따라 2kΩ 저항기(그림2C)와병행하여 연결됩니다. 전원 공급 장치는 9 V DC와 함께 전위요계를 제공합니다. 대략적인 플런지 속도는 플런지 압력을 설정하여 실험 전에 설정되지만, 전위전도계는 실험 후 속도를 정확하게 판독합니다.
스프레이 노즐과 액체 에탄 용기
스프레이 기반 시료 전달을 위한 가스 동적 가상 노즐의 제조 및 작동은 다른 곳에서 자세히설명되어 있다(15). 전술한 바와 같이, 밸브 1-3의 '디스펜싱' 출구는 노즐(도3A)의액체 입구에 연결된다. 가압 된 스프레이 가스는 노즐의 가스 입구에 연결되어 있습니다. PDMS 스프레이 노즐의 입구는 0.043" O.D. PE 튜빙이 피팅 없이 직접 사용할 수 있도록 합니다. 당사의 노즐 설계에는 심판18에설명된 장치와 유사한 두 개의 샘플을 혼합하기 위한 '제트 인 제트' 지오메트리가 포함되어 있습니다. 설계의 회로도는 도 3B에도시되며, 노즐의 현미경 이미지는 도 3C에도시된다. 미세 유체 장치의 레이아웃은 두 개의 샘플을 혼합하기 위해 세 개의 주사기를 사용해야합니다. 스프레이 노즐은 일반적으로 그리드에서 1-1.5cm 거리(샘플 응용 프로그램 중)에 배치됩니다.
우리는 표준 블로팅 방법에 사용되는 액체 에탄 /질소 용기에서 극저온으로 액체 에탄을 사용합니다. 실험실 리프팅 플랫폼으로 액체 에탄 컵의 수직 위치 지정이 달성됩니다.
스프레이 및 그리드 환경 제어
플런저 및 스프레이 노즐은 이중도어(그림 4A)가있는 맞춤형 내장 PMMA(아크릴 유리) 상자에 포함되어 있습니다. 상자 내부의 높은 상대 습도는TED(도 4B)의뒷면의 공기 가습 시스템에 의해 달성된다. 공기는 펌프에 의해 공급되고 처음 10"캐니스터로 공급됩니다 (일반적으로 싱크대 수정화에 사용됨). 캐니스터는 낮은 (~ 5-10cm) 수준의 물로 채워지며 가습기 유닛도 있습니다. 가습기에 대한 주전원은 디지털 습도/온도 컨트롤러와 아크릴 유리 상자 내부에 있는 습도/온도 센서에 의해 제어됩니다. 상대 습도가 90%≥ 도달하면 컨트롤러가 펌프를 끄도록 설정됩니다. 첫 번째 캐니스터에서 가습 된 공기는 디퓨저를 통해 펌핑되어 10 인치 캐니스터에 물에 담근 다음 아크릴 유리 상자에 들어갑니다.
주의: 시료가 분무 노즐에서 에어로졸화되기 때문에 유해 생물학적 또는 화학 적 시편은 시료로 적합하지 않습니다.
실행 시퀀스
제어 소프트웨어의 실행 스크립트 버튼은 실행 시퀀스를 시작합니다. 이 명령 시퀀스는 스크립트 파일에서 미리 정의되고 소프트웨어를 통해 변경할 수 있습니다. 가장 중요한 변수는 다음과 같습니다.
스프레이 속도: 스프레이 속도는 주사기 펌프에서 사용하는 액체 유동량을 결정합니다. 유량은 다음과 같이 계산할 수 있습니다: 여기에 사용되는 주사기 펌프 모터는 고정 된 단계 크기를 가지고 있습니다. 펌프의 전체 범위는 48,000 단계로 나뉩니다. 두 번째 중요한 요소는 주사기 볼륨입니다. 우리는 일반적으로 250 μL 주사기를 사용합니다. 제어 소프트웨어의 스프레이 속도는 단계/초 수로 설정됩니다. 1000 걸음/초의 스프레이 속도는 다음에 해당합니다.
스프레이 볼륨: 스프레이 볼륨은 분사할 총 부피를 결정합니다. 따라서, 또한 스프레이의 지속 시간을 결정한다. 제어 소프트웨어의 분무 볼륨은 여러 단계로 설정됩니다. 1000걸음/초의 스프레이 속도로 2,000단계의 스프레이 볼륨은 2s의 스프레이 지속 시간과 총 10.4 μL의 부피를 이끕킵니다.
사전 분무 시간: 이 변수는 스프레이와 플런지의 개시 시간을 정의합니다. 그리드를 급락하기 전에 스프레이가 안정화할 충분한 시간이 있도록 지연 시간을 선택하는 것이 중요합니다. 일반적으로, 스프레이는 그리드가 급락하기 전에 안정화하기 위해 1.5 - 4 s가 주어집니다. 그리드가 통과될 때까지 스프레이가 유지됩니다. 일반적으로, 액체 흐름(및 따라서 스프레이)은 그리드가 급락한 후 0.5~1s로 정지된다. 1000 걸음/s의 스프레이 속도와 2000단계의 스프레이 볼륨을 사용하여 일반적인 사전 스프레이 시간은 1.5초입니다.
명령의 예시적인 시퀀스는 도 5A에도시되고, 시간이 지남에 따라 그리드 위치는 도 5B에도시된다.
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Protocol
1. 시스템 준비
참고: 다음 프로토콜에서는 단일 샘플의 그리드를 준비하는 방법을 설명합니다. 일반적으로 복제 그리드는 각 샘플 또는 조건에 대해 최소 2개의 복제 그리드가 준비됩니다. 빠른 플런지 속도(~ 20ms 시간 지연 미만)의 경우 일반적으로 3 또는 4개의 복제 그리드가 얇은 얼음 영역의 감소를 고려하여 준비됩니다.
- 단백질 샘플을 원하는 완충제의 목표 농도로 희석시. 일반적으로 최종 농도는 TED와 그리드 준비를 위해 2 mg/mL≥ 잘 작동합니다. 샘플은 10단계까지 얼음 위에 보관할 수 있으며, 10단계 부터 는 3-4 그리드를 준비하는 데 약 20분이 걸리므로 실온에서 상당한 시간을 보낼 수 있습니다.
- TED를 켭니다. 그런 다음 제어 PC를 켜고 제어 소프트웨어를 시작합니다.
- 각 주사기 펌프의 이니셜화 버튼(아래 검정 버튼)을 눌러 모든 주사기 펌프를 초기화합니다.
- 강력한 전원 공급 장치를 켜고 9V로 설정하고 오실로스코프 제어 소프트웨어를 시작합니다.
- N 2-실린더의레귤레이터 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다. 실린더 밸브를 엽니다. 그런 다음, 분무 가스 압력(일반적으로 1-2 bar)에 대해 원하는 값으로 출구 압력을 설정하는 레귤레이터 밸브를 천천히 엽니다. 여기에 사용되는 PDMS 노즐의 경우 노즐의 손상을 피하기 위해 ~ 2.5 바보다 높은 압력을 사용하지 마십시오. 지속적으로 흐르는 가스는 액체가 노즐 팁에 떨어지고 축적되는 것을 방지하여 재현할 수 없는 살포로 이어질 수 있습니다.
- 모든 주사기 펌프 밸브가 '부하' 위치에 있는지 확인합니다. 이 작업은 모든 밸브를 제어 소프트웨어의 '디스펜스' 위치로 전환한 다음 다시 '로드'로 전환하여 수행할 수 있습니다. 모든 밸브를 '로드'로 전환하십시오. 모든 주사기를 0으로 설정합니다.
- 이 단계에서 시스템에 존재하는 기포를 제거합니다. 이렇게하려면 주사기가 미완성되어야 할 수도 있고, 거품을 수동으로 제거하고 주사기는 더 이상 거품을 포함하지 않을 때 다시 장착되어야 할 수 있습니다.
- 액체 처리 구성 요소는 일반적으로 H2O에 저장됩니다. 시료 용액을 적재하기 전에 과도한 버퍼로 튜브를 세척하여 액체 시스템을 버퍼로 평형화합니다. 스프레이 노즐의 과압을 피하기 위해 적절한 최대 액체 유동량을 사용합니다. 액체 유량> 10 μL/s는 여기에 설명된 PDMS 노즐에 손상을 일으킬 수 있다.
- ≥ 200 μL 버퍼가 들어 있는 1.5mL 튜브를 주사기 1에 놓습니다(상단은 튜브에 부착하려면 관통해야 합니다).
- 밸브 1이 '로드' 위치에 있는지 확인합니다. 필요한 경우 제어 소프트웨어에서 전환합니다.
- 제어 소프트웨어를 통해 주사기 1로 버퍼의 원하는 양(일반적으로 50-100 μL)을 흡인합니다.
- 제어 소프트웨어를 통해 밸브 1을 '디스펜스' 위치로 전환합니다.
- 제어 소프트웨어를 통해 주사기 1에 모든 액체를 분배합니다.
- 밸브를 '로드'로 되돌리고, 프로그램의 주사기 위치를 '0'으로 재설정하고 주사기 1에 초기화를 눌러 다음 사이클을 위한 시스템을 준비합니다.
참고: 1.9.1 단계 - 1.9.5 단계는 일반적으로 튜브의 철저한 세척을 보장하기 위해 세 번 반복됩니다.
- 플런징 암 클램프를 느슨하게 하고 핀셋을 클램프에 넣고 클램프를 조이면 EM 그리드(특정 유형에 대한 요구 사항 없음)를 장착한 핀셋을 로드합니다.
- 그리드와 노즐이 동일한 높이('샘플 응용 프로그램' 위치)에 있도록 급락 하는 팔을 수동으로 이동합니다. 노즐과 그리드가 정렬되면 장시간 분사 한 후 그리드에 액체가 축적됩니다. 필요한 경우 노즐 위치를 조정합니다.
- 장착된 핀셋으로 플런징 암을 최종 위치로 수동으로 이동하여 액체 에탄 컵의 위치를 조정합니다(에탄 컵에 도달). 올바르게 설정하면 핀셋에 의해 보유된 그리드가 액체 에탄 컵의 중심으로 약도달합니다.
- '실행 스크립트'가 원하는 유량, 볼륨 및 타이밍을 사용하는지 확인합니다. 자세한 내용은 위의 '실행 시퀀스' 섹션을 참조하십시오.
- 플런저의 경로를 방해하지 않는 것이 없는지 확인합니다. 단일 실행에 필요한 버퍼 의 볼륨을 주사기 1로 흡인합니다. 이 작업은 제어 소프트웨어에서 수행되며 일반적인 설정 및 볼륨에 대한 섹션 '실행 시퀀스'를 참조하십시오. 그런 다음 밸브 1이 '디스펜스' 위치로 전환되었는지 확인합니다. 제어 소프트웨어에서 실행 스크립트를 눌러 테스트 실행을 수행합니다.
주의: 실행 시퀀스가 완료될 때까지 TED를 지워십시오. 부품을 움직이면 부상을 입을 수 있습니다! - '실행 시퀀스'가 완료되면 급락하는 암의 압력을 원하는 값(일반적으로 1-2 bar)으로 설정합니다. 그런 다음 제어 소프트웨어에서 확인을 눌러 급락하는 팔에서 압력을 방출합니다. 급락하는 암에 대한 '실행 시퀀스' 또는 압력을 조정해야 하는 경우, 이러한 설정은 이 단계에서 변경될 수 있으며 1.13 - 1.15단계가 반복될 수 있다.
2. 빠른 그리드 준비
- 액체 에탄/질소 용기를 먼저 액체 질소로 채웁니다. 충분히 춥고 액체 질소가 없는 경우 컵에 액체 에탄을 채웁니다. 액체 에탄의 응고를 피하십시오. 이 단계는 기존의 그리드 준비와 동일합니다.
참고: 에탄 오염을 최소화하기 위해 2.2- 2.13 단계가 가능한 한 빨리 수행되도록 하십시오.
주의: 액체 에탄은 저온기와 인화성입니다. 취급할 때는 주의해야 합니다. - 광방출을 위해 극저온-EM 그리드를 준비합니다. 우리는 일반적으로 0.1 mbar 기압과 10 mA에서 90 s에 대한 구멍 이탄소 그리드와 빛 방전을 사용합니다. 일반적으로 4개 이상의 그리드가 한 번에 배출되는 광선이 없습니다. 그리드는 광선 방출 후 30분 이내에 사용됩니다.
- 샘플로 튜브를 상화합니다(다음 단계 1.9.1 - 1.9.5, 버퍼 대신 샘플을 사용). 사용 가능한 샘플 볼륨이 낮으면 튜브가 죽은 부피가 1개만 으로 평형화될 수 있습니다.
- 제어 소프트웨어에서 주사기 1로 실행되는 데 필요한 샘플의 양을 흡인합니다(자세한 내용은 '실행 시퀀스' 섹션 참조). 그런 다음 밸브 1을 '디스펜스' 위치로 전환합니다.
- 상대 습도가 원하는 값에 도달했는지 확인합니다(일반적으로 60% 상대 습도 이상으로 그리드를 준비합니다). 60%의 습도를 ≥ 되면 습도가 높은 유지를 위해 최소한의 시간 동안만 습도 챔버를 엽니다.
- 핀셋을 공압 플런저에 빛 배출 그리드를 들고 고정합니다. 플런저를 시작 위치(맨 위)로 이동합니다.
- 전위도계의 슬라이더가 플런저에 연락하기 위해 수동으로 이동하여 측정을 위한 준비된 시작 위치에 있는지 확인합니다. 오실로스코프 소프트웨어에서 발진기 스코프의 트리거를 설정합니다.
- 액체 에탄/질소 용기를 놓습니다.
- 제어 소프트웨어에서 실행 스크립트를 누릅니다. 메시지가 표시되면 제어 소프트웨어에서 확인을 클릭하여 실행을 시작합니다.
주의: 실행 시퀀스가 완료될 때까지 TED를 지워십시오. 부품을 움직이면 부상을 입을 수 있습니다! - '실행 시퀀스'가 완료되면 제어 소프트웨어에서 확인을 클릭하여 공압 플런저에 대한 압력을 해제합니다.
- 열린 습도 챔버는 핀셋을 다른 손으로 고정하면서 한 손으로 급락팔과 핀셋 사이의 연결을 느슨하게합니다. 핀셋이 없는 경우, 액체 에탄에 그리드를 유지하면서 급락 팔을 위로 이동합니다. 그런 다음 그리드를 주변 액체 N2의저장 공간으로 전송합니다. 동결 후 그리드는 항상 액체N2 온도에서 유지되어야 합니다.
- 오실로스코프 측정을 저장합니다. 수동으로 후 전위 오차계 슬라이더와 플런저의 위치를 재설정합니다.
- 복제 그리드를 준비하기 위해 2.4-2.12 단계를 반복합니다.
- 그리드 클리핑 및 데이터 수집전까지 그리드를 장기 저장소로 전송합니다.
- 단계 1.9.1 - 1.9.5에 따라 버퍼로 시스템을 세척하십시오. 그런 다음 1.9.1 - 1.9.5 단계에 따라 H2O로 시스템을 세척하십시오.
- 주요 질소 가스 레귤레이터를 끄고 전원을 끕니다.
- 에탄/질소 용기를 연기 후드에 넣고 따뜻하게 하고 액체 에탄과N2가 증발하게 합니다.
3. 시간 해결 된 극저온 EM
참고: TED를 사용하여 시간 해결 실험을 수행하면 기본 설정 및 변수가 동일하게 유지되지만 고려해야 할 추가 측면이 있습니다. 여기에 두 개의 솔루션이 1:1 (v/v) 비율로 혼합되어 그리드에 증착되는 최종 혼합물을 생성한다고 가정합니다. '1에 설명된 프로토콜을 따릅니다. TED'를 통해 빠른 그리드 준비, 다음과 같은 변경 사항:
- 간단한 스프레이 실험보다 혼합 실험에 더 높은 재고 농도를 사용합니다. 1:1(v/v) 비율로 혼합하면 각 구성 요소가 2배 희석됩니다.
- 빠른 혼합 실험을 위해, 단일 주사기가 아닌 세 개의 주사기를 모두 사용하십시오.
- 주사기 펌프 2-3에 튜브를 부착합니다.
- 주사기 펌프2-3에서 스프레이 노즐에 튜브를 부착합니다.
- 버퍼및 샘플에서 세 개의 주사기를 모두 상량화합니다. 전형적으로, 주사기 1은 샘플 A로 채워지고 주사기 2-3은 샘플B(도 3)로채워져 있다.
- 실행 시퀀스를 변경합니다. 빠른 혼합 실험에 대한 모든 3 개의 주사기를 사용하는 실행 시퀀스에 대한 예가 도 6에서주어진다. 자세한 내용은 '실행 시퀀스' 섹션도 참조하십시오.
- 다른 시간 지연은 두 가지 방법으로 달성 될 수있다 :
- 플런저 속도를 변경합니다. 플런저 속도를 조정함으로써 시간 지연은 상대적으로 좁은 범위에서 변경될 수 있습니다. 예를 들어, 스프레이/에탄 거리가 2cm인 플런저를 1m/s 또는 2m/s로 이동하여 각각 20ms 또는 10ms의 시간 지연을 줄 수 있습니다. 이 작업은 1.15 단계에서 설명된 대로 수행됩니다.
- 스프레이 노즐의 (수직) 위치를 조정하여 스프레이/에탄 위치를 변경합니다. 노즐이 에탄 표면으로부터 5cm 거리에 위치하는 경우, 예를 들어, 1m/s의 급락 속도는 50ms의 시간 지연을 준다. 훨씬 긴 시간 지연을 달성하려면 설정을 추가로 수정해야 합니다.
참고: 노즐의 흐름 초점 영역의 라미나르 흐름으로 인해 노즐의 이 부분에서 상당한 혼합이 기대되지 않습니다. 대신, 우리는 혼합이 스프레이 생성 중에, 그리드로 가는 길에, 그리고 그리드에 퍼지는 물방울 중에 발생할 것으로 예상합니다. 스프레이 액적이 그리드에 도달하는 비행 시간은 1ms (≥ 10m / s의 물방울 속도와 1cm의 노즐 그리드 거리)≤ 추정됩니다. 따라서, 물방울 착륙과 유리화 사이의 시간만 '시간 지연'으로 간주됩니다.
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Representative Results
TED와의 빠른 그리드 준비
빠른 그리드 준비를 위한 시험 표본으로서, 우리는 30mHEPES, 150 mM MM NaCl, pH 7.5에서 20 μM에서 말 비장에서 아포페리틴을 사용했습니다. 3.5 Å 해상도에서 의재건은심판15(도 7A)에기재된 690개의 현미경으로부터 수득하였다. 디포커스 범위는 원시이미지(도 7B)에서입자를 쉽게 식별할 수 있도록 선택되었다. 10-40 ms의 시간 지연으로 제조된 일반적인 그리드는 > 1000개의 현미경 으로 수집할 수 있도록 얇은얼음(도 7C)의충분한 영역을 나타낸다. 결과 분해능은 얼음 두께에 의해 제한될 가능성이 높으며, 다수의 상이한 그리드의 지형 분석에 따르면 96± 33nm 얼음 두께6을나타냈다.
시간 해결 된 저온 EM
TED를 이용한 신속한 혼합 및 시간 분해능을 입증하기 위해 ATP와 결합하여 ACtomyosin 복합체의 해리를 모델반응(19)으로사용했습니다. 이러한 선택은 원시 현미경그래프에서 아토묘신과 무료 F-actin과 반응의 잘 이해된 운동사이의 쉬운 구별에 기초했다.
다음에서, ATP에 의한 actomyosin 복합체의 해리의 TrEM에 대한 대표적인 결과가 도시된다. 자세한 실험 절차 및 결과는 심판에서 제공된다.19. 간단히 말해서, F-액틴과 토끼 골격 묘신 S1은 10mM MOPS, 50mM KAc, 2m MgCl2,0.1 mM EGTA, pH 7을 40 μM의 최종 단머 농도에서 혼합하여 actomyosin(AM) 복합체를 준비시켰다. AM 단지는 주사기 1 과 200 μM MgATP에 적재되어 동일한 버퍼로 주사기 2 및 3에 적재되었다. 준비된 두 개의 서로 다른 타임포인트에 대한 주요 실험 매개 변수는 표 1에나열됩니다.
두 시간 모두, 결과는 AM 복합체와 MgATP의 1:1 v/v 혼합물로, 20 μM AM 단지와 100 μM MgATP의 최종 농도를 제공하였다. 표 1에표시된 대로 동결 시간에 대한 계산된 혼합은 7및 13ms였다. 노즐과 그리드 사이의 스프레이 물방울의 예상 비행 시간은 < 1ms였습니다.
각 타임포인트에 대해 작은 저온-EM 데이터 세트(306 및 123 마이크로그래프)를 획득하고 표준 헬릭 처리 절차를 사용하여 처리된 결합된데이터(20). 결과 컨센서스 재구성(두 시간 모두 결합)은 그림 8A에표시됩니다. 결합된 데이터는 집중분류를 거쳐 AM 복합체 및 F-actin클래스(도 8B,C)로분할하였다. 이어서, 각 시간대에 대한 AM 복합체 또는 F-액틴 입자의 분획이 계산되고 도 8D로도시되었다.
AM 복합 해리에 대한 두 번째 주문 속도 상수는 1.5 · 106 M-1 s-1 21. 가정하에
통합 요금법은 다음과 같은 근사치가 될 수 있습니다.
[AM-복합체]는 AM 복합체의 시간 의존 농도인 경우, [AM-복합체]0은 초기 농도이고, k는 2차 요율상수및 [ATP]0은 (초기) ATP 농도이다.
이 방정식을 사용하여 AM 복합 해리의 역학을 모델링했습니다. 이 모델은 실험적인 TrEM 데이터와 합리적으로 잘 동의합니다. 도 8D에도시된 바와 같이 현미경당 상당한 변형이 있다.
그림 1: 시간 해결 된 EM 장치 (TED). (A)TED의 개요. (B)펌프 1-3이 있는 액체 처리 장치. 왼쪽의 네 번째 펌프는 이 작업에 사용되지 않습니다. 시료 저장소('샘플 1')와 마찬가지로 밸브 1에 대해 적재 및 분배 위치가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 공압 플런저 및 선형 전위오미터. (A)중요한 구성 요소가 표시된 TED의 공압 플런저의 세부 사항. (B)TED의 공압 시스템의 회로도. 숫자는N2 실린더(1), 주 압력 레귤레이터(2), 스프레이 노즐(3), 솔레노이드 밸브(4), 플런지 속도 레귤레이터(5) 및 이중 로드 공압 실린더(6)에 해당한다. (C)전위요미터회로의 회로 의 회로 의 회로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혼합 및 분무를위한 가스 동적 가상 노즐. (A)4개의 입구 튜브가 연결된 노즐은 시료(A 및 B)와N2 가스에 공급한다. (B)이중 유동을 위한 PDMS 스프레이 노즐의 중앙 단면의 회로도는 유동 초점(다운스트림 혼합용) 및 가스 초점 또는 원자화를 달성한다. 샘플 B는 노란색으로 표시되고 A를 보라색으로 샘플링합니다. (C)미세 유체 노즐의 혼합 및 분무 섹션의 현미경 이미지. 15. 스케일 바 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 아크릴 유리 상자에 그리드 및 스프레이의 환경 제어. (A)정면에서 보기 및(B)TED의 측면에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 실행 시퀀스. (A)맨 위에 변수를 나타내는 예제 실행 시퀀스와 하단의 명령 시퀀스를 보여 줄 수 있습니다. 일부 키 명령은 빨간색으로 부가됩니다. (B)블랙 솔리드라인으로 표시된 '실행 시퀀스'의 시간 과정 동안 그리드 위치. 그리드의 시작 위치는 0cm입니다. 스프레이는 t = 0 s에서 시작되며, 스프레이와 액체 에탄 사이의 거리는 ~ 2cm입니다. 1.5 s에서 그리드는 스프레이를 통해 액체 에탄으로 2m/s로 움직이기 시작합니다. 시퀀스는 스프레이가 2 초 후에 중지될 때 끝납니다.
도 6: 빠른 혼합 실험에 대한 예제 실행 시퀀스. 그림 5 A의 중요한 차이점은 빨간색으로 부가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 간단한 스프레이 실험에서 대표적인 결과. (A)3.5 Å의 말 아포페리틴을 분사 및 바이트로시화(EMD-10533) 사이에 36ms로 제조하였다. (B)동일한 아포페리틴 샘플의 원시 이미지. (C)그리드의 낮은 배율 뷰, 얇은 얼음을 함유한 하나의 예시 그리드 사각형은 파선된 파란색 사각형에 의해 강조되고, 이 그리드 광장 내의 얇은 얼음 영역은 파란색 화살표로 표시됩니다. 두꺼운 얼음이나 오염 부위는 별표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 혼합 실험의 대표적인 결과. (A)높은 임계값(색) 및 낮은 임계값(투명)으로 나타난 AM 복합체의 컨센서스 재구성. 한 미오신 밀도는 대시 선으로 표시되고 강조 표시됩니다. 재구성은 두 시간 모두의 데이터에서 생성된 것입니다. (B)미오신 바운드가 없는 F-액틴 클래스. (C)미오신 바운드(회색의 묘신, 주로 라이트 레드 액틴 서브유닛에 묶여 있음)를 보여주는 AM 복합 클래스. (D)운동 모델과 실험적인 TrEM 데이터 간의 비교. 도시된 것은 초기 농도에 비해 AM 복합체의 분획이다. 큰 고체 검은 점은 평균 TrEM 데이터를 나타내며, 작은 점은 현미경 TrEM 데이터당 표시됩니다. 보라색 파선은 운동 모델을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유량(μL/s) | 스프레이/에탄 거리(cm) | 플런지 속도(m/s) | 시간 지연(ms) | |||
| 주사기 1 | 주사기 2 | 주사기 3 | ||||
| (오전) | (ATP) | (ATP) | ||||
| 7 ms | 2.08 | 1.04 | 1.04 | 1.4 | 2 | 7 |
| 13 ms | 1.04 | 0.52 | 0.52 | 2 | 1.6 | 13 |
표 1: ATP에 의한 AM 복합 해리의 TrEM에 대한 실험 설정
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Discussion
이 작업의 프로토콜은 직접 분무 및 TrEM 실험을 통해 빠른 그리드 준비에 사용할 수 있습니다. 빠른 그리드 준비는 공기 물 인터페이스5와의입자 상호 작용을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 주요 제한 사항은 그리드에서 사용 가능한 샘플 농도 및 얼음 두께입니다. 이러한 제한 내에서 샘플 품질이 양호하다면 프로토콜은 고해상도 저온-EM에 적합한 그리드를 생성합니다.
문제 해결
액체 유량 및 그리드 속도는 그리드에 증착된 액체의 양을 결정합니다. 위에 주어진 예제 설정(액체 유량 5 μL/s 및 플런지 속도 1-2 m/s)를 사용하면 방울이 있는 그리드의 좋은 커버리지가 예상됩니다. 노즐이 잘 정렬되지 않은 경우 (그래서 스프레이 방울이 그리드를 그리워), 냉동 그리드는 거의 또는 전혀 방울을 보여줍니다.
그리드의 오염은 완전히 피할 수 없지만(그림 7C참조) 습한 환경에 대한 액체 에탄의 노출 시간을 최소화하여 줄일 수 있습니다. 이는 복제 그리드를 가능한 한 빨리 준비하여 달성됩니다(그리드 4개에 대해 ≤ 20분). 우리는 일반적으로 액체 에탄을 교체하기 전에 4 그리드를 준비합니다.
액체 에탄의 초기 냉각이 너무 느리면 그리드의 유리체 얼음이 결정화될 수 있습니다. 이전 연구22와합의하여, 우리는 낮은 플런지 속도 (< 0.5 m/s)가 결정적 얼음의 증가로 이어지는 것으로 나타났습니다. 매우 두꺼운 얼음 (≥ 200 nm)의 영역은 일반적으로 본질적으로 느린 냉각으로 인해 결정얼음을 보여줍니다. 그리드 준비(액체 에탄에서 액체 질소로의 이송, 저장 등)에따른 단계 중 하나에서 그리드가 워밍업되면 결정적인 얼음도 발생할 수 있습니다.
TED 준비 그리드에 대한 데이터 수집
TED가 생성한 평균 얼음 두께는 표준 블로팅 시스템에서 제조된 "이상적인" 저온-EM 그리드보다 두껍습니다. 얼음 두께는 획득 영역마다 다를 수 있습니다. 즉, 가장 얇은 얼음을 제공하기 위해 획득 영역을 신중하게 선택해야 합니다. 디포커스 범위는 고대비 이미지를 얻기 위해 조정해야 할 수 있습니다. 얼음이 두껍고 입자가 콘트라스트가 낮은 경우 매우 높은 디포커스 값(3 - 5 μm)을 사용하여 초기 파일럿 데이터 수집을 제안합니다. 최근 연구에 따르면 고해상도는 여전히 높은 디포커스값(23)을사용하여 달성될 수 있음을 시사한다.
기존의 cryo-EM 데이터 수집의 경우 전체 데이터 집합이 단일 그리드에서 수집되는 경우가 많습니다. 그러나 여러 개의 작은 데이터 집합의 컬렉션과 이러한 데이터 집합병합이 유용합니다. 이러한 방식으로, 제한된 현미경 시간 내에 여러 시간점을 기록할 수 있으며 관심의 시간점을 확인할 수 있다.
TrEM 데이터 처리 및 분석
데이터 집합의 병합은 대부분의 일반적인 cryo-EM 데이터 처리 소프트웨어에서 일상적으로 수행할 수 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이 다른 사람의 작업에서 데이터 집합을 별도의 시간점에서 병합하는 것은 유용할 수있습니다(17) 파티클을 처리 전체에서 원래 의 하위 집합(시간점)으로 다시 추적할 수 있어야 합니다.
기존의 운동 측정(예: 광 산란 또는 형광을 사용하여)은 TrEM 실험에 귀중한 추가될 수 있다. 생화학 적 측정에서 속도 상수를 사용하여 중간 관심 상태의 수명을 예측하거나 TrEM에 의해 관찰 된 운동학을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 반응 역학에 대한 기본 소개와 시간 해결 구조 연구와의 관계에 대한 자세한 내용은 참조.24.
TrEM과 기존의 운동 실험 사이의 차이에 대한 가능한 이유가 많이 있습니다. 도 8D에도시된 바와 같이 TrEM 데이터는 현미경 검사장당 상당한 변동을 보일 수 있습니다. 또한 예비 데이터는 복제 그리드 간의 상대 입자 수의 5% 가변성을 나타냅니다. 입자 분류(클래스 할당)는 특히 상태가 구조적으로 유사하거나 구조가 매우 유연할 경우 불완전할 수 있습니다. 입자, 따라서 TrEM 파생 운동학, 또한 이러한 상호 작용이 감소하지만 빠른 속도로 제거되지 않기 때문에 공기 물 인터페이스와 입자 상호 작용에 의해 영향을받을 수 있습니다.
이 연구는 TrEM에 대한 몇 가지 지침을 제공하지만, 우리는이것이 연구의 적극적인 영역이며, 우리는 미래에 더 진보를 기대한다는 것을 주목한다. TrEM 실험은 상당한 실험적 노력이 필요하지만 거시 분자 복합체의 역학에 대한 고해상도 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
몰리 S.C. 그레이브트에게 유용한 토론과 ABSL 시설 직원에게 cryo-EM 데이터 수집에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 데이비드 P. 클레블은 리즈 대학에 의해 투자 애스트베리 센터에서 웰컴 트러스트 4 년 박사 과정 프로그램에 박사 과정 학생입니다. FEI 티탄 크리오스 현미경은 리즈 대학 (UoL ABSL 상)과 웰컴 트러스트 (108466/ Z / 15 / Z)에 의해 투자되었다. 이 작품은 스티븐 P. Muench (BB / P026397/1)에 BBSRC 보조금에 의해 지원되었으며 미국 심장 협회 (AMR21-236078)와 하워드 D. 화이트와 미국 국립 보건 원 (171261)의 하워드 D. 화이트에 대한 연구 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10x70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976). |
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