Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie

Summary

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een apparaat voor het maken van snel rasters voor zowel snelle rasters als voor snel mengen en invriezen om tijd-opgeloste experimenten uit te voeren.

Abstract

Het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) ontwikkelt zich snel met nieuwe hardware en verwerkingsalgoritmen, waardoor structuren met een hogere resolutie en informatie over meer uitdagende systemen worden geproduceerd. Monstervoorbereiding voor cryo-EM ondergaat een vergelijkbare revolutie met nieuwe benaderingen die worden ontwikkeld om de traditionele blotting-systemen te vervangen. Deze omvatten het gebruik van piëzo-elektrische dispensers, pinprinten en direct spuiten. Als gevolg van deze ontwikkelingen gaat de snelheid van de netvoorbereiding van seconden naar milliseconden, wat nieuwe kansen biedt, vooral op het gebied van tijd-opgeloste cryo-EM, waar eiwitten en substraten snel kunnen worden gemengd voordat ze bevriezen, waardoor kortlevende tussentoestanden worden opgevangen. Hier beschrijven we in detail een standaardprotocol voor het maken van rasters op ons interne tijd-opgeloste EM-apparaat, zowel voor standaard snelle netvoorbereiding als voor tijd-opgeloste experimenten. Het protocol vereist een monster van minimaal ongeveer 50 μL bij concentraties van ≥ 2 mg / ml voor de voorbereiding van 4 roosters. De vertraging tussen het aanbrengen van het monster en het invriezen kan zo laag zijn als 10 ms. Een beperking is een verhoogde ijsdikte bij hogere snelheden en in vergelijking met de blotting-methode. We hopen dat dit protocol anderen zal helpen bij het ontwerpen van hun eigen apparaten voor het maken van rasters en degenen die geïnteresseerd zijn in het ontwerpen van tijd-opgeloste experimenten.

Introduction

Achtergrond
Recente ontwikkelingen in cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) hebben structurele studies van steeds complexere systemen met hoge resolutie mogelijk gemaakt. Op enkele uitzonderingen na zijn dergelijke studies beperkt tot biologische macromoleculen bij evenwicht¹ of relatief langzame reacties². Veel processen in vivo vinden plaats op een snellere tijdschaal (milliseconden) en er is een toenemende belangstelling voor time-resolved cryo-EM (TrEM) op deze tijdschalen³. Conventionele cryo-EM-monstervoorbereiding door de blotting-methode is echter te traag voor milliseconde TrEM.

De blotting-methode heeft andere beperkingen dan een slechte tijdresolutie. Eiwitten en eiwitcomplexen kunnen last hebben van denaturatie of voorkeursoriëntatie op roosters⁴. Het is aangetoond dat het verminderen van de blootstellingstijd aan de lucht-waterinterface tijdens de monstervoorbereiding de voorkeursoriëntatie en eiwitdenaturatie^{vermindert 5,6}. Een snelle netvoorbereiding maakt dus niet alleen milliseconde TrEM mogelijk, maar kan ook de netkwaliteit verbeteren.

Momenteel zijn er drie verschillende benaderingen voor geautomatiseerde netvoorbereiding. De eerste benadering maakt gebruik van een pin of capillair dat een kleine hoeveelheid monster bevat. Na het vaststellen van contact tussen de vloeistof en het rasteroppervlak, wordt het monster 'geschreven' op het raster^7,8. Het aanvraagproces van het monster is relatief traag en duurt enkele seconden. Een alternatieve aanpak maakt gebruik van gecontroleerde druppelgeneratie door een piëzo-dispenser en zelfafvoerende roosters⁹. Dit maakt een snellere afgifte mogelijk om de tijden te bevriezen, maar wordt nog steeds beperkt door druppel- en afvoersnelheid (momenteel 54 ms bereiken). De snelste aanpak tot nu toe is de directe spuitbenadering, waarbij het monster wordt verneveld in een sproeikop en de kleine (~ 10 - 20 μm) en snelle (> 5 m/s) druppeltjes zich verspreiden bij contact met het cryo-EM-rooster. De monsterspray kan op verschillende manieren worden gegenereerd, zoals luchtstraalverstuivers, akoestische oppervlaktegolven of ultrasone luchtbevochtigers^10,11,12,13. In onze ervaring is de ijsdikte met de directe spuitbenadering groter, maar direct spuiten maakt het mogelijk om de sproeitijden < 10 ms te bevriezen.

Dit protocol beschrijft stap voor stap hoe een time-resolved EM-apparaat (TED) uitgerust met een microfluïdische sproeikop kan worden gebruikt om roosters voor te bereiden op een snelle tijdschaal^14,15. Het apparaat is gebruikt om roosters voor te bereiden met een minimale vertragingstijd van 6 ms tussen het aanbrengen van het monster en het invriezen en om snel twee monsters te mengen en in te vriezen. Het ontwerp van de TED is gebaseerd op een eerdere versie¹⁶ en is vergelijkbaar met andere op spray gebaseerde tijd-opgeloste cryo-EM-apparaten¹⁷.

Eerst worden de vier belangrijkste onderdelen van de TED-opstelling beschreven. De kern van de TED is de vloeistofbehandelingseenheid, die verantwoordelijk is voor monsteraspiratie en -afgifte. Een pneumatische plunjer verplaatst het rooster door de spray naar het vloeibare ethaan. Generatie van de spray wordt bereikt met microfluïdische sproeikoppen en het invriezen gebeurt in een vloeibare ethaancontainer, die kort worden beschreven. Ten slotte worden de extra functies om de rasteromgeving te regelen, met name de luchtvochtigheid, benadrukt. Dit wordt gevolgd door gedetailleerde protocollen voor de werking van het apparaat en voor het uitvoeren van TrEM-experimenten. Representatieve resultaten worden gegeven voor een snelle rastervoorbereiding en een eenvoudig TrEM-experiment.

Experimentele installatie

De vloeistofbehandelingseenheid
Het vloeistofbehandelingssysteem van de TED wordt gevormd door drie spuitaangedreven pompen ('pompen 1 - 3'), elk uitgerust met een roterende klep(figuur 1). Een voeding voorziet pompen 1 - 3 van 24 V DC. Communicatie met de besturingssoftware (geschreven in Visual Basic en C++) verloopt via een RS232-interface naar pomp 1. Commando's worden verdeeld via de seriële I/O-uitbreidingspoorten van pomp 1 tot pompen 2-3. Pompen 1-3 zijn uitgerust met glazen spuiten ('spuiten 1-3', we gebruiken hier spuiten met een dood volume van 250 μL/nul dood volume). Elke klep heeft twee standen, 'load' en 'dispense'. De 'load'-positie wordt gebruikt om monster in de spuit te zuigen. Een kort stuk (~ 3 - 4 cm) van 1/16" O.D., 0.01′′ I.D. FEP-buizen is via ETFE/ETFE flensloze fittingen verbonden met de 'load'-positie van kleppen 1-3. Dit korte stukje buis reikt tot in het monsterreservoir (meestal een plastic buis van 1,5 ml of 0,5 ml). De 'dispense'-positie leidt naar de sproeikop. Verbinding tussen de 'dispense' uitlaat en de sproeikop wordt gemaakt door PE-buizen (~ 20-30 cm lengte, 0,043" O.D., 0,015" I.D.), met een kort stuk mouwbuis (~ 0,5 cm) en ETFE/ETFE flensloze fittingen.

De pneumatische plunjer
De TED gebruikt een pneumatische plunjer om het rooster te versnellen en door de monsterspray in de vloeibare ethaancontainer te verplaatsen. Onderdrukpincet houdt het rooster vast, geschroefd in een zelfgebouwde houder die is gemonteerd op een dubbele stang pneumatische cilinder(figuur 2A).

Druk wordt geleverd door een grote stikstofgasfles (maat W), uitgerust met een meertrapsregelaar (0 - 10 bar, 'hoofddruk'). Flexibele versterkte PVC-buizen (12 mm O.D.) verbinden de regelaar met een 12-poorts spruitstuk waar stikstof onder druk wordt afgeleverd bij het mondstuk en de pneumatische plunjer. De gasstroom door het mondstuk is constant, direct geregeld bij de stikstofcilinder (hoofddruk). De aansluiting op het mondstuk is gemaakt met PU-buizen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), een kort stuk PE-buis (~ 8 cm lengte, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) en geschikte connectoren. De druk op de pneumatische plunjer wordt geregeld door een magneetventiel. PU-buizen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) verbinden de magneetklep met een regelaar en de pneumatische plunjer, om een verminderde duikdruk (≤ hoofddruk) mogelijk te maken. Het magneetventiel is computergestuurd. Een schematisch overzicht van de opstelling wordt gegeven in figuur 2B.

Merk op dat bij deze opstelling de duikdruk altijd gelijk is aan of kleiner is dan de sproeigasdruk (hoofddruk). De opstelling kan echter eenvoudig worden gewijzigd door een tweede regelaar stroomopwaarts van de sproeikop op te nemen om hogere duiksnelheden bij lage sproeigasdruk mogelijk te maken. Hoge drukken (>> 2 bar) kunnen de PDMS-sproeikop beschadigen.

LET OP: Dit is een druksysteem en de 'hoofddruk' moet altijd < 7 bar zijn.

Drukken tussen 0,5 en 2 bar worden meestal gebruikt voor de pneumatische plunjer en vertonen een ongeveer lineaire relatie tussen druk en snelheid (op de verticale positie van de spray). Duiksnelheden worden gemeten met een oscilloscoop, verbonden in lijn met een schuifpotentiometer (10 kΩ) en parallel met een weerstand van 2 kΩ(figuur 2C). Een voeding voorziet de potentiometer van 9 V DC. Terwijl de geschatte duiksnelheid voorafgaand aan het experiment wordt ingesteld door de duikdruk in te stellen, geeft de potentiometer een nauwkeurige uitlezing van de snelheid na het experiment.

Sproeikoppen en vloeibare ethaan container
De fabricage en werking van gasdynamische virtuele nozzles voor monsterafgifte op basis van sproeien is elders in detail beschreven¹⁵. Zoals hierboven beschreven, zijn de 'dispense' uitgangen van kleppen 1-3 verbonden met de vloeistofinlaten van het mondstuk(figuur 3A). Het sproeigas onder druk is aangesloten op de gasinlaat van het mondstuk. De inlaten in de PDMS-sproeikoppen zijn zodanig dat 0,043" O.D. PE-buizen direct kunnen worden gebruikt zonder dat fittingen nodig zijn. Ons nozzle-ontwerp bevat een 'jet-in-jet'-geometrie voor het mengen van twee monsters, vergelijkbaar met het apparaat beschreven in ref.¹⁸. Een schema van het ontwerp wordt weergegeven in figuur 3B,een microscopisch beeld van een mondstuk wordt weergegeven in figuur 3C. De lay-out van het microfluïdische apparaat vereist het gebruik van drie spuiten om twee monsters te mengen. De sproeikop wordt meestal op 1-1,5 cm afstand van het rooster geplaatst (tijdens het aanbrengen van het monster).

We gebruiken vloeibaar ethaan als cryogeen, in een vloeibare ethaan/stikstof container zoals gebruikt voor de standaard blotting methode. Verticale positionering van de vloeibare ethaanbeker wordt bereikt met een laboratoriumhefplatform.

Controle van de spuit- en roosteromgeving
De plunjer en sproeikop bevinden zich in een op maat gemaakte PMMA (acrylglas) doos met een dubbele deur(figuur 4A). Een hoge relatieve vochtigheid in de doos wordt bereikt door een luchtbevochtigingssysteem aan de achterkant van de TED(figuur 4B). Lucht wordt geleverd door een pomp en gevoerd in een eerste 10 "bus (meestal gebruikt voor waterzuivering onder de gootsteen). De bus is gevuld met een laag (~ 5-10 cm) waterniveau en herbergt ook een luchtbevochtiger. De netvoeding naar de luchtbevochtiger wordt geregeld door een digitale vochtigheids-/temperatuurregelaar en een vochtigheids-/temperatuursensor in de acrylglasdoos. De regelaar is ingesteld om de pomp uit te schakelen wanneer de relatieve vochtigheid ≥ 90% bereikt. Bevochtigde lucht uit de eerste bus wordt door een diffuser gepompt, ondergedompeld in water in een tweede 10 "-bus en komt vervolgens in de acrylglasdoos.

LET OP: Omdat het monster in de sproeikop is verneveld, zijn gevaarlijke biologische of chemische monsters niet geschikt als monsters.

De loopvolgorde
Met de knop Script uitvoeren in de besturingssoftware wordt de reeks uitgevoerd. Deze reeks opdrachten kan vooraf worden gedefinieerd in een scriptbestand en worden gewijzigd via de software. De belangrijkste variabelen worden hier uitgelegd:

Spuitsnelheid: De spuitsnelheid bepaalt het vloeistofdebiet dat door de spuitpomp wordt gebruikt. Het debiet kan als volgt worden berekend: De hier gebruikte spuitpompmotoren hebben een vaste stapgrootte. Het volledige bereik van de pomp is verdeeld in 48.000 stappen. De tweede belangrijke factor is het spuitvolume. We gebruiken meestal spuiten van 250 μL. De spuitsnelheid in de besturingssoftware wordt ingesteld op aantal stappen per seconde. Een spuitsnelheid van 1000 stappen/seconde komt overeen met:

Spuitvolume: Het spuitvolume bepaalt het totale te spuiten volume. Het bepaalt dus ook de duur van de spray. Het spuitvolume in de besturingssoftware is ingesteld als een aantal stappen. Een spuitvolume van 2000 stappen, bij een spuitsnelheid van 1000 stappen/seconde, leidt tot een spuitduur van 2 s en een totaal volume van 10,4 μL.

Pre-spray tijd: Deze variabele definieert de tijd tussen het starten van de spray en het duiken. Het is belangrijk om de vertragingstijd zodanig te kiezen dat de spray voldoende tijd heeft om te stabiliseren voordat het rooster wordt gezonken. Meestal wordt de spray 1,5 - 4 s gegeven om te stabiliseren voordat het rooster wordt ondergedompeld. De spray wordt gehandhaafd totdat het rooster is doorgetrokken. Meestal wordt de vloeistofstroom (en dus de spray) 0,5 tot 1 s gestopt nadat het rooster is ondergedompeld. Met een spuitsnelheid van 1000 stappen/s en een spuitvolume van 2000 stappen is een typische voorspuittijd bijvoorbeeld 1,5 s.

Een voorbeeldige reeks opdrachten wordt weergegeven in figuur 5A, de rasterpositie in de loop van de tijd wordt geïllustreerd in figuur 5B.

Protocol

1. Het systeem voorbereiden

OPMERKING: In het volgende protocol wordt beschreven hoe u rasters van één monster voorbereidt. Gewoonlijk worden voor elk monster of elke toestand minimaal 2 replicatieroosters voorbereid. Voor hogere duiksnelheden (minder dan ~ 20 ms tijdsvertraging), zijn 3 of 4 replicatieroosters meestal voorbereid om rekening te houden met een verminderd aantal dunne ijsgebieden.

1. Verdun het eiwitmonster tot de doelconcentratie in de gewenste buffer. Doorgaans werken eindconcentraties ≥ 2 mg / ml goed voor roostervoorbereiding met de TED. Merk op dat het monster tot stap 10 op ijs kan worden bewaard, vanaf stap 10 zal het monster veel tijd doorbrengen bij kamertemperatuur omdat het ongeveer 20 minuten duurt om 3-4 roosters te bereiden.
2. Schakel de TED in. Schakel vervolgens de besturings-pc in en start de besturingssoftware.
3. Initialiseer alle spuitpompen door op de initialiseren-knop (onderste zwarte knop) op elke spuitpomp te drukken.
4. Schakel de voeding van de potentiometer in, stel deze in op 9 V en start de oscilloscoopbesturingssoftware.
5. Zorg ervoor dat de regelklep van de N₂-cilinder gesloten is. Open de cilinderklep. Open vervolgens langzaam de regelklep en stel de uitlaatdruk in op de gewenste waarde voor de sproeigasdruk (meestal 1-2 bar). Gebruik voor de PDMS-nozzles die hier worden gebruikt geen drukken hoger dan ~ 2,5 bar om schade aan het mondstuk te voorkomen. Het continu stromende gas voorkomt dat vloeistof druppelt en zich ophoopt aan de punt van het mondstuk, wat kan leiden tot onherleidbaar spuiten.
6. Zorg ervoor dat alle spuitpompkleppen in de 'belastingsstand' staan. Dit kan door alle kleppen in de besturingssoftware in de 'dispense'-positie te zetten en vervolgens weer terug te zetten naar 'load'. Laat alle kleppen overschakelen naar 'belasting'. Zet alle spuiten op nul.
7. Verwijder in dit stadium alle luchtbellen in het systeem. Om dit te doen, moeten de spuiten mogelijk worden losgeschroefd, bubbels handmatig worden verwijderd en de spuiten opnieuw worden gemonteerd wanneer ze geen bubbels meer bevatten.
8. De vloeistofbehandelingscomponenten worden meestal opgeslagen in H₂O. Voordat u de monsteroplossing laadt, moet u het vloeistofsysteem in evenwicht met buffer in evenwicht trekken door de slang te wassen met een teveel aan buffer. Gebruik een geschikt maximaal vloeistofdebiet om overdruk op de sproeikop te voorkomen. Vloeistofdebieten > 10 μL/s kunnen schade veroorzaken aan de hier beschreven PDMS-nozzles.
9. Plaats een buis van 1,5 ml met ≥ buffer van 200 μL op spuit 1 (de bovenkant moet worden doorboord om aan de slang te worden bevestigd).
   1. Zorg ervoor dat klep 1 in de 'belastingsstand' staat. Schakel indien nodig de besturingssoftware in.
   2. Aspirateer de gewenste hoeveelheid (meestal 50-100 μL) buffer met spuit 1, via de besturingssoftware.
   3. Schakel klep 1 naar de 'dispense'-positie, via de besturingssoftware.
   4. Spuit alle vloeistof in spuit 1 af via de besturingssoftware.
   5. Terugslagklep naar 'laden', zet de positie van de spuit in op '0' in het programma en druk op initialiseren op spuit 1 om het systeem voor te bereiden op de volgende cyclus.
      OPMERKING: Stappen 1.9.1 - 1.9.5 worden meestal drie keer herhaald om ervoor te zorgen dat de slang grondig wordt gewassen.
10. Laad pincetten met een EM-rooster (geen vereiste voor een specifiek type) door de stortarmklem los te maken, het pincet in de klem te plaatsen en de klem aan te spannen.
11. Beweeg de stortarm handmatig zodat rooster en mondstuk zich op dezelfde hoogte bevinden (de positie 'monstertoepassing'). Als mondstuk en rooster zijn uitgelijnd, zal vloeistof zich ophopen op het rooster na het spuiten gedurende een langere periode. Pas indien nodig de positie van het mondstuk aan.
12. Pas de positie van de vloeibare ethaanbeker aan door de stortarm met gemonteerd pincet handmatig naar de eindpositie te bewegen (reikend in de ethaanbeker). Wanneer correct ingesteld, zal een rooster dat door het pincet wordt vastgehouden ongeveer het midden van de vloeibare ethaanbeker bereiken.
13. Controleer of het 'run script' de gewenste flowrates, volumes en timings gebruikt. Zie het gedeelte 'De reeks uitgevoerden' hierboven voor meer informatie.
14. Zorg ervoor dat niets het pad van de zuiger belemmert. Aspirateer het volume buffer dat nodig is voor een enkele run in spuit 1. Dit gebeurt in de besturingssoftware, zie sectie 'De run-volgorde' voor typische instellingen en volumes. Zorg er dan voor dat klep 1 in de 'dispense' stand staat. Voer een testrun uit door in de besturingssoftware op Script uitvoeren te drukken.
    LET OP: Blijf uit de buurt van de TED totdat de reeks uitgevoerd is. Bewegende delen kunnen letsel veroorzaken!
15. Wanneer de 'run-reeks' is voltooid, stelt u de druk op de stortarm in op de gewenste waarde (meestal 1-2 bar). Druk vervolgens op OK in de besturingssoftware om de druk van de stortarm te verwijderen. Als de "loopvolgorde" of de druk op de plunging-arm moet worden aangepast, kunnen deze instellingen in dit stadium worden gewijzigd en de stappen 1.13 - 1.15 worden herhaald.

2. Snelle netvoorbereiding

1. Vul de vloeibare ethaan/stikstof container eerst met vloeibare stikstof. Wanneer het voldoende koud en vrij van vloeibare stikstof is, vult u de beker met vloeibaar ethaan. Vermijd stolling van het vloeibare ethaan. Deze stap is dezelfde als voor conventionele netvoorbereiding.
   OPMERKING: Om ethaanbesmetting tot een minimum te beperken, moet u ervoor zorgen dat stappen 2.2 - 2.13 zo snel mogelijk worden uitgevoerd
   LET OP: Vloeibaar ethaan is een cryogeen en ontvlambaar. Voorzichtigheid is het belangrijk bij het hanteren.
2. Bereid cryo-EM-roosters voor gloeiende ontlading voor. We gebruiken meestal holey carbon roosters en glow-discharge voor 90 s, bij 0,1 mbar luchtdruk en 10 mA. Meestal worden niet meer dan 4 roosters tegelijk ontladen. De roosters worden binnen 30 minuten na gloed-ontlading gebruikt.
3. Evenwicht tussen de slang en het monster (volg stappen 1.9.1 - 1.9.5, met behulp van het monster in plaats van de buffer). Als het beschikbare monstervolume laag is, mag de slang in evenwicht worden gebracht met slechts 1 dood volume.
4. Spuit de hoeveelheid monster die nodig is voor een enkele run in spuit 1 in de besturingssoftware (zie rubriek 'De run-sequentie' voor meer informatie). Schakel vervolgens klep 1 naar de 'dispense' stand.
5. Controleer of de relatieve vochtigheid de gewenste waarde heeft bereikt (we bereiden meestal roosters voor bij 60% relatieve vochtigheid of hoger). Zodra ≥ luchtvochtigheid van 60% is bereikt, opent u de vochtigheidskamer slechts gedurende een minimale tijd om een hoge luchtvochtigheid te behouden.
6. Plaats het pincet, met een gloeiend rooster, in de pneumatische zuiger en bevestig ze. Verplaats de zuiger naar de startpositie (bovenaan).
7. Zorg ervoor dat de schuifregelaar van de potentiometer zich in de startpositie bevindt, klaar voor de meting, door deze handmatig te bewegen om contact te maken met de zuiger. Stel de trigger in op de oscilloscoop in de oscilloscoopsoftware.
8. Plaats de vloeibare ethaan/stikstof container.
9. Druk op Script uitvoeren in de besturingssoftware. Wanneer u hierom wordt gevraagd, klikt u op OK in de besturingssoftware om het uitvoeren te starten.
   LET OP: Blijf uit de buurt van de TED totdat de reeks uitgevoerd is. Bewegende delen kunnen letsel veroorzaken!
10. Zodra de 'run-reeks' is voltooid, laat u de druk op de pneumatische zuiger los door in de besturingssoftware op OK te klikken.
11. Open vochtkamer, maak de verbinding tussen de plunging arm en pincet met één hand los terwijl u het pincet met de andere vastmaakt. Wanneer het pincet vrij is, beweegt u de inknuiterende arm omhoog terwijl u het rooster in het vloeibare ethaan houdt. Breng vervolgens het rooster over naar zijn opslagruimte in de omringende vloeistof N₂. Na het invriezen moet het rooster te allen tijde op vloeibare N_{2-temperatuur} worden gehouden.
12. Sla de oscilloscoopmeting op. Stel de positie van de potentiometerschuifregelaar en zuiger daarna handmatig opnieuw in.
13. Herhaal stap 2.4-2.12 om replicatierasters voor te bereiden
14. Breng de rasters over naar langdurige opslag totdat het raster wordt geknipt en gegevens worden verzameld.
15. Was het systeem met buffer, volgens stap 1.9.1 - 1.9.5. Was vervolgens het systeem met H₂O, volgens stappen 1.9.1 - 1.9.5.
16. Schakel de belangrijkste stikstofgasregelaar uit en schakel de stroom uit.
17. Plaats de ethaan/stikstofcontainer in een zuurkast om deze te laten opwarmen en laat het vloeibare ethaan en N₂ verdampen.

3. Tijd-opgeloste cryo-EM

OPMERKING: Wanneer tijd-opgeloste experimenten worden uitgevoerd met de TED, zijn er aanvullende aspecten waarmee rekening moet worden gehouden, hoewel de basisopstelling en variabelen hetzelfde blijven. Hierbij wordt aangenomen dat twee oplossingen in een verhouding van 1:1 (v/v) worden gemengd om het uiteindelijke mengsel te produceren dat op het net wordt afgezet. Volg het protocol beschreven in '1. Snelle netvoorbereiding met de TED', met de volgende wijzigingen:

1. Gebruik hogere voorraadconcentraties voor mengexperimenten dan voor eenvoudige spuitexperimenten. Mengen in een verhouding van 1:1 (v/v) resulteert in een verdunning van 2x van elk bestanddeel.
2. Gebruik voor een snel mengexperiment alle drie de spuiten in plaats van slechts één.
   1. Bevestig slangen aan spuitpompen 2-3.
   2. Bevestig slangen van spuitpompen 2-3 aan de sproeikop.
   3. Balanceer alle drie de spuiten in buffer en monster afzonderlijk. Doorgaans wordt spuit 1 gevuld met monster A en spuiten 2-3 met monster B(figuur 3).
3. Wijzig de reeks uitgevoerde acties. Een voorbeeld voor een run-sequentie waarbij alle 3 spuiten worden gebruikt voor een snel mengexperiment wordt gegeven in figuur 6. Zie ook het gedeelte 'De reeks uitgevoerden' voor meer informatie.
4. Verschillende tijdvertragingen kunnen op twee manieren worden bereikt:
   1. Wijzig de snelheid van de zuiger. Door de snelheid van de zuiger aan te passen, kan de tijdsvertraging in een relatief smal bereik worden gewijzigd. Bij een spuit/ethaanafstand van 2 cm kan de zuiger bijvoorbeeld met 1 m/s of 2 m/s worden bewogen om een tijdsvertraging van respectievelijk 20 ms of 10 ms te geven. Dit gebeurt zoals beschreven in stap 1.15.
   2. Verander de spuit-/ethaanpositie door de (verticale) positie van de sproeikop aan te passen. Als het mondstuk bijvoorbeeld op een afstand van 5 cm van het ethaanoppervlak is geplaatst, geeft een duiksnelheid van 1 m/s een tijdsvertraging van 50 ms. Het bereiken van aanzienlijk langere tijdvertragingen vereist verdere aanpassingen aan de opstelling.
      OPMERKING: Vanwege de laminaire stroming in het stroomfocusgebied van het mondstuk, verwachten we geen significante menging in dit deel van het mondstuk. In plaats daarvan verwachten we dat vermenging plaatsvindt tijdens het genereren van sprays, in druppels op weg naar het net en tijdens druppelverspreiding op het rooster. De vluchttijd voor sproeidruppels om het raster te bereiken wordt geschat ≤ 1 ms (voor een druppelsnelheid van ≥ 10 m /s en een nozzle-grid afstand van 1 cm). Zo wordt alleen de tijd tussen druppellanding en vitrificatie beschouwd als de 'tijdsvertraging'.

Representative Results

Snelle netvoorbereiding met de TED
Als testmonster voor snelle rastervoorbereiding hebben we apoferritine uit paardenpleet gebruikt bij 20 μM in 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Een reconstructie met een resolutie van 3,5 Å werd verkregen uit 690 micrografieën zoals beschreven in ref.¹⁵ (Figuur 7A). Het onscherptebereik is zo gekozen dat deeltjes gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd in de onbewerkte afbeeldingen (figuur 7B). Een typisch raster dat is opgesteld met een tijdsvertraging van 10-40 ms toont voldoende gebieden met dun ijs(figuur 7C)om > 1000 microfoto's te kunnen verzamelen. De resulterende resolutie wordt waarschijnlijk beperkt door de ijsdikte, tomografische analyse van een aantal verschillende rasters toonde 96 ± 33 nm ijsdikte⁶.

Tijd-opgeloste cryo-EM
Om snelle menging en tijdresolutie met behulp van de TED aan te tonen, hebben we dissociatie van het actomyosinecomplex gebruikt door te mengen met ATP als een modelreactie¹⁹. Deze keuze was gebaseerd op het gemakkelijke onderscheid tussen actomyosine en vrij F-actine uit ruwe micrografieën en de goed begrepen kinetiek van de reactie.

Hieronder worden de representatieve resultaten voor TrEM van dissociatie van het actomyosinecomplex door ATP getoond. Gedetailleerde experimentele procedures en resultaten zijn opgenomen in ref.¹⁹. Kortom, F-actine en konijnenskelet myosine S1 werden gemengd in 10 mM MOPS, 50 mM KAc, 2 mM MgCl_2,0,1 mM EGTA, pH 7 bij uiteindelijke monomeerconcentraties van 40 μM om het actomyosine (AM) complex te bereiden. AM-complex werd in spuit 1 geladen en 200 μM MgATP in dezelfde buffer werd in spuiten 2 en 3 geladen. De belangrijkste experimentele parameters voor de twee verschillende voorbereide tijdspunten zijn vermeld in tabel 1.

Voor beide tijdspunten was het resultaat een 1:1 v/v mengsel van AM-complex en MgATP, wat uiteindelijke concentraties van 20 μM AM-complex en 100 μM MgATP oplevert. De berekende menging tot vriestijden waren 7 en 13 ms zoals weergegeven in tabel 1. De geschatte vluchttijd voor de sproeidruppels tussen mondstuk en rooster was < 1 ms.

Een kleine cryo-EM dataset (306 en 123 microfoto's) werd verkregen voor elk tijdstip en de gecombineerde gegevens verwerkt met behulp van standaard spiraalvormige verwerkingsprocedures²⁰. De resulterende consensusreconstructie (beide tijdspunten gecombineerd) is weergegeven in figuur 8A. De gecombineerde gegevens werden vervolgens onderworpen aan gerichte classificatie en opgesplitst in een AM-complex en een F-actineklasse (figuur 8B, C). Vervolgens werd de fractie van AM-complex of F-actinedeeltjes voor elk tijdspunt berekend en wordt weergegeven in figuur 8D.

De tweede orde rate constante voor AM-complexe dissociatie is 1,5 · 10⁶ M^-1 s^-1 21. In de veronderstelling dat

de wet op het geïntegreerd tarief kan worden benaderd tot:

Waar [AM-complex] de tijdsafhankelijke concentratie van AM-complex is, is [AM-complex]₀ de beginconcentratie, k de tweede orde snelheidsconstante en [ATP]₀ de (initiële) ATP-concentratie.

Met behulp van deze vergelijking werd de kinetiek van AM-complexe dissociatie gemodelleerd. Het model komt redelijk overeen met de experimentele TrEM-gegevens. Er is een significante variatie per micrograaf zoals weergegeven in figuur 8D.

Figuur 1: Het time-resolved EM-apparaat (TED). (A) Overzicht van de TED. (B) De vloeistofbehandelingseenheid met pompen 1-3. De vierde pomp aan de linkerkant wordt niet gebruikt in dit werk. Belastings- en afgifteposities zijn aangegeven voor klep 1, evenals het monsterreservoir ('monster 1'). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Pneumatische plunjer en lineaire potentiometer. (A) Details van de pneumatische plunjer van de TED met belangrijke componenten gelabeld. B)Schema van het pneumatische systeem van de TED. De cijfers komen overeen met de N_2-cilinder (1), de hoofddrukregelaar (2), de sproeikop (3), de magneetklep (4), de dompelsnelheidsregelaar (5) en de pneumatische cilinder met dubbele stang (6). (C) Schema van de schakeling voor de potentiometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Gasdynamische virtuele nozzles voor mengen en spuiten. (A) Een mondstuk met 4 aangesloten inlaatbuizen, voor de toevoer naar monsters (A en B) en N₂ gas. (B) Schema van het centrale gedeelte van de PDMS-sproeikoppen met dubbele stroomfocusgeometrie om stroomfocussing (voor stroomafwaarts mengen) en gasfocussing of verstuiving te bereiken. Monster B wordt weergegeven in geel en monster A in paars. (C) Microscopisch beeld van de meng- en verstuivingssecties van het microfluïdische mondstuk. Afbeelding uit ref.¹⁵. Schaalbalk 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Omgevingscontrole van rooster en spray in de acrylglasdoos. (A) Uitzicht vanaf de voorkant en (B) vanaf de zijkant van de TED. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: De run-reeks. (A) Een voorbeeld van een run-reeks met variabelen bovenaan en de volgorde van opdrachten onderaan. Sommige toetscommando's zijn rood geannoteerd. (B) Rasterpositie over het tijdsverloop van een "run sequence" weergegeven als een zwarte ononderbroken lijn. De startpositie van het rooster ligt op 0 cm. Spray wordt gestart bij t = 0 s voor 2 s, de afstand tussen spray en vloeibaar ethaan is ~ 2 cm. Bij 1,5 s begint het rooster met 2 m / s te bewegen, door de spray en in het vloeibare ethaan. De reeks eindigt als de spray stopt na 2 s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Voorbeeld van een reeks voor een snel mengexperiment. Belangrijke verschillen met figuur 5 A zijn rood geannoteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Representatieve resultaten van een eenvoudig spuitexperiment. (A) 3,5 Å reconstructie van paardenapoferritine uit een rooster bereid in 36 ms tussen spuiten en vitrificatie (EMD- 10533). (B) Ruwe afbeelding van hetzelfde apoferritinemonster. (C) Lage vergrotingsweergave van het raster, een voorbeeldig rastervierkant met dun ijs wordt gemarkeerd door de onderbroken blauwe rechthoek, het gebied van dun ijs binnen dit raster-vierkant wordt aangegeven door de blauwe pijl. Gebieden met dik ijs of verontreiniging worden aangegeven met sterretjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Representatieve resultaten van een mengexperiment. (A) Consensusreconstructie van het AM-complex getoond bij een hoge drempel (gekleurd) en laagdrempelig (transparant). Eén myosinedichtheid is gelabeld en gemarkeerd met een stippellijn. De reconstructie werd gegenereerd op basis van gegevens van beide tijdspunten gecombineerd. (B) F-actineklasse die geen myosinegebonden is. (C) AM-complexklasse met myosine gebonden (myosine in grijs, voornamelijk gebonden aan de lichtrode actine subeenheid). D)Vergelijking tussen kinetisch model en experimentele TrEM-gegevens. Getoond is de fractie van AM-complex ten opzichte van de beginconcentratie. Grote effen zwarte stippen geven gemiddelde TrEM-gegevens aan, kleine stippen tonen TrEM-gegevens per micrograaf. De paarse stippellijn vertegenwoordigt het kinetische model. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	debiet (μL/s)			spray/ethaan afstand (cm)	duiksnelheid (m/s)	tijdvertraging (ms)
	spuit 1	spuit 2	spuit 3
	(AM)	(ATP)	(ATP)
7 ms	2.08	1.04	1.04	1.4	2	7
13 ms	1.04	0.52	0.52	2	1.6	13

Tabel 1: Experimentele instellingen voor TrEM van AM-complexe dissociatie door ATP

Discussion

De protocollen in dit werk kunnen worden gebruikt voor snelle netvoorbereiding door direct spuiten en TrEM-experimenten. Snelle rastervoorbereiding kan worden gebruikt om deeltjesinteracties met de luchtwaterinterface te verminderen⁵. De belangrijkste beperkingen zijn de beschikbare monsterconcentratie en ijsdikte op het rooster. Binnen deze grenzen en mits de monsterkwaliteit goed is, produceert het protocol roosters die geschikt zijn voor hoge resolutie cryo-EM.

Probleemoplossing
Vloeistofdebiet en netsnelheid bepalen de hoeveelheid vloeistof die op het net wordt afgezet. Met de bovenstaande voorbeeldinstellingen (vloeistofdebiet 5 μL/s en duiksnelheid 1-2 m/s) wordt een goede dekking van het rooster met druppels verwacht. Als het mondstuk niet goed was uitgelijnd (dus sproeidruppels missen het rooster), vertonen bevroren roosters zeer weinig of geen druppels.

Verontreiniging van roosters kan niet volledig worden vermeden (zie figuur 7C),maar kan worden verminderd door de blootstellingstijd van vloeibaar ethaan aan een vochtige omgeving te minimaliseren. Dit wordt bereikt door replicatieroosters zo snel mogelijk voor te bereiden (≤ 20 minuten voor 4 roosters). We bereiden meestal 4 roosters voor voordat we het vloeibare ethaan vervangen.

Glasachtig ijs op roosters kan (gedeeltelijk) kristalliseren als de initiële afkoeling in vloeibaar ethaan te langzaam is. In overeenstemming met een eerdere studie²²hebben we gevonden dat lage duiksnelheden (< 0,5 m / s) leiden tot een toename van kristallijn ijs. Gebieden met zeer dik ijs (≥ 200 nm) vertonen meestal kristallijn ijs als gevolg van inherent langzamere afkoeling. Als het rooster opwarmt tijdens een van de stappen na de voorbereiding van het rooster (overdracht van vloeibaar ethaan naar vloeibare stikstof, overdracht naar opslag, enz.),kan ook kristallijn ijs optreden.

Data-acquisitie voor ted-voorbereide grids
De gemiddelde ijsdikte geproduceerd door de TED is dikker dan het "ideale" cryo-EM-raster dat is voorbereid op een standaard deslottingsysteem. De ijsdikte kan ook variëren tussen acquisitiegebieden. Dit betekent dat acquisitiegebieden zorgvuldig moeten worden geselecteerd om een zo dun mogelijk ijs te geven. Het onscherptebereik moet mogelijk worden aangepast om beelden met een hoog contrast te verkrijgen. Wanneer het ijs dik is en deeltjes een laag contrast hebben, raden we een eerste pilot-gegevensverzameling aan met behulp van zeer hoge onscherptewaarden (3 - 5 μm). Recent werk suggereert dat hoge resolutie nog steeds kan worden bereikt met behulp van dergelijke hoge onscherptewaarden²³.

Voor conventionele cryo-EM-gegevensverzameling wordt vaak een volledige dataset verzameld uit één raster. We hebben echter het verzamelen van meerdere kleine datasets en het samenvoegen van deze datasets nuttig gevonden. Op deze manier kunnen meerdere tijdspunten worden vastgelegd binnen beperkte microscooptijd en kunnen tijdspunten van belang worden geïdentificeerd.

Verwerking en analyse van TrEM-gegevens
Het samenvoegen van datasets kan routinematig worden gedaan in de meest voorkomende cryo-EM-gegevensverwerkingssoftware. Zoals hierboven beschreven en in het werk van anderen, kan het samenvoegen van datasets vanuit afzonderlijke tijdspunten nuttig zijn¹⁷. Het is belangrijk dat deeltjes tijdens de verwerking terug te voeren zijn op hun oorspronkelijke deelverzameling (tijdspunt).

Conventionele kinetische metingen (bijvoorbeeld met behulp van lichtverstrooiing of fluorescentie) kunnen een waardevolle aanvulling zijn op TrEM-experimenten. Snelheidsconstanten van biochemische metingen kunnen worden gebruikt om levens van de tussentoestand van belang te voorspellen, of om de kinetiek waargenomen door TrEM te bevestigen. Voor een basisintroductie van reactiekinetiek en hun relatie tot tijd-opgeloste structurele studies, zie ref.²⁴.

Er is een aantal mogelijke redenen voor verschillen tussen TrEM en conventionele kinetische experimenten. Zoals weergegeven in figuur 8D,kunnen TrEM-gegevens significante variaties per micrograaf laten zien. We merken ook op dat voorlopige gegevens ten minste 5% variabiliteit suggereren in relatieve deeltjesaantallen tussen repliceerrasters. Deeltjesclassificatie (klassentoewijzing) kan onvolmaakt zijn, vooral als toestanden structureel vergelijkbaar zijn of als een structuur zeer flexibel is. Deeltjes, en dus trem afgeleide kinetiek, kunnen ook worden beïnvloed door deeltjesinteracties met de lucht-waterinterface omdat dergelijke interacties worden verminderd maar niet geëlimineerd bij hoge snelheden.

Dit werk biedt enkele richtlijnen voor TrEM, maar we merken op dat dit een actief onderzoeksgebied is en we verwachten verdere vooruitgang in de toekomst. Hoewel TrEM-experimenten aanzienlijke experimentele inspanningen vereisen, kunnen ze inzicht bieden in de dynamiek van macromoleculaire complexen met een hoge resolutie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Time resolved device
acrylic glass box	USA scientific
digital humidity/temperature controller	THE20 digital humidity/temperature controller
dual rod pneumatic cylinder	dual rod pneumatic cylinder TN 10x70
FEP tubing	Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing
flangeless fittings	Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings
flexible reinforced PVC tubing	12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing
glass syringes	Kloehn 250 µL zero-dead volume
humidifier pump	Interpret Aqua Air AP3
liquid ethane container	from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV
multistage regulator	GASARC class 3 multistage regulator
negative pressure tweezers	Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers
oscilloscope	Hantek 6022BE oscilloscope
PE tubing	Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing
power supply	Mean Well GSM160A24-R7B
power supply	Wanptek KPS305D power supply
PU tubing	SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing
regulator	Norgren R72G-2GK-RMN
slide potentiometer	PS100 slide potentiometer
solenoid valve	SMC NVJ314M solenoid valve
syringe drive pumps	Kloehn V6 48K model
Reagents & Materials
apoferritin from equine spleen	Sigma-Aldrich, A3660
ATP	Sigma-Aldrich, A2383
cryo-EM grids	Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3
EGTA	Sigma Aldrich E3889
F-actin	Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)
glow-discharger	Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit
HEPES	Sigma-Aldrich, H7006
KAc	Sigma-Aldrich, P1190
MgCl2	Sigma-Aldrich, M8266
MOPS	Sigma-Aldrich, M1254
NaCl	Sigma-Aldrich, S9888
Skeletal muscle myosin S1	Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)
Ref 1	Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).
Ref 2	White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).