Summary
Her præsenterer vi en protokol til at analysere genomomomfordelingen af histonemodifikationer, som kan identificere nye målgener i patogenesen af M. oryzae og andre filamentøse svampe.
Abstract
Chromatin immunprecipitation sekventering (ChIP-seq) er en kraftfuld og udbredt molekylær teknik til kortlægning af hele genom steder transskription faktorer (TFs), kromatin regulatorer, og histone modifikationer, samt detektering hele genomer til at afdække TF bindende mønstre og histone posttranslationelle ændringer. Kromatin-modificerende aktiviteter, såsom histone methylering, rekrutteres ofte til specifikke genregulerende sekvenser, hvilket forårsager lokaliserede ændringer i kromatinstrukturer og resulterer i specifikke transskriptionelle virkninger. Ris blast er en ødelæggende svampesygdom på ris i hele verden og er et modelsystem til at studere svamp-plante interaktion. Men de molekylære mekanismer i, hvordan histone modifikationer regulerer deres virulens gener i Magnaporthe oryzae forbliver undvigende. Flere forskere er nødt til at bruge ChIP-seq til at studere, hvordan histone epigenetiske modifikation regulerer deres mål gener. ChIP-seq er også meget udbredt til at studere samspillet mellem protein og DNA hos dyr og planter, men det er mindre anvendt inden for plantepatologi og er ikke blevet veludviklet. I dette papir beskriver vi den eksperimentelle proces og driftsmetode af ChIP-seq for at identificere genomomomfordelingen af histone methylering (såsom H3K4me3), der binder sig til de funktionelle målgener i M. oryzae. Her præsenterer vi en protokol til at analysere genomomomfordelingen af histonemodifikationer, som kan identificere nye målgener i patogenesen af M. oryzae og andre filamentøse svampe.
Introduction
Epigenetik er en gren af genetisk forskning, der refererer til den arvelige ændring af genekspression uden at ændre nukleotidsekvensen af gener. Et stigende antal undersøgelser har vist, at epigenetisk regulering spiller en vigtig rolle i væksten og udviklingen af eukaryote celler, herunder kromatin, der regulerer og påvirker genekspression gennem den dynamiske proces med at folde og samle sig i strukturer af højere orden1,2. Chromatin remodeling og kovalent histone modifikation påvirker og regulerer kromatins funktion og struktur gennem variationen af kromatin polymerer, og derved opnå funktionen af regulering af genekspression3,4,5,6. Posttranslationelle modifikationer af histone omfatter acetylation, fosforylering, methylering, monoubiquitination, sumoylation og ADP ribosylation7,8,9. Histone H3K4 methylering, især trimethylation, er blevet kortlagt til transskription start steder, hvor det er forbundet med transskription replikation, rekombination, reparation, og RNA behandling i eukaryoter10,11.
ChIP-seq-teknologi blev introduceret i 2007 og er blevet den eksperimentelle standard for genomom-dækkende analyse af transskriptionel regulering og epigenetiske mekanismer12,13. Denne metode er velegnet i genom-skala og til at opnå histone eller transskription faktor interaktion oplysninger, herunder DNA segmenter af DNA-bindende proteiner. Enhver DNA-sekvenser krydslinket til proteiner af interesse vil coprecipitate som en del af kromatin kompleks. Ny generation sekventering teknikker bruges også til sekvens 36-100 bp af DNA, som derefter matches til det tilsvarende mål genom.
I phytopathogene svampe er forskning for nylig begyndt at studere, hvordan histone methyleringsændringer regulerer deres målgener i processen med patogenitet. Nogle tidligere undersøgelser viste, at reguleringen af histone methylase-relaterede gener hovedsageligt afspejles i genhæmning og katalysering af produktionen af sekundære metabolitter (SM). MoSet1 er H3K4 methylase i M. oryzae. Knockout af dette gen resulterer i fuldstændig sletning af H3K4me3 modifikation14. Sammenlignet med den vilde stamme hæmmes udtrykket af genet MoCEL7C i mutanten i CMC-induceret tilstand og i ikke-induceret tilstand (glukose eller cellobiose),15udtrykket af MoCEL7C . I Fusarium graminearumkan KMT6 katalysere methyleringsmodifikationen af H3K27me3, regulere den normale udvikling af svampe og hjælpe med at regulere det "kryptiske genom", der indeholder SM-genklyngen16,17,18,19. I 2013 rapporterede Connolly, at H3K9 og H3K27 methylering regulerer den patogene proces af svampe gennem sekundære metabolitter og effektorfaktorer, der regulerer hæmningen af målgener20. I Aspergilluser modifikationen af histonerne H3K4me2 og H3K4me3 relateret til genaktivering og spiller en vigtig rolle i kontrollen af kromatinniveaureguleringen af SM-genklynger21. I M. oryzaeer Tig1 (homolog til Tig1 i gær og pattedyr) en HADC (histone deacetylase)22. Knockout af Tig1-genet fører til fuldstændig tab af patogenitet og sporeproduktionsevne i null mutant. Det er mere følsomt over for et peroxygenmiljø, som ikke kan producere infektiøs hyphae22.
Ris blast forårsaget af M. oryzae. er en af de mest alvorlige ris sygdomme i de fleste ris-voksende områder i verden19. På grund af sin repræsentative infektionsproces ligner M. oryzae infektionsprocessen for mange vigtige patogene svampe. Da det nemt kan udføre molekylære genetiske operationer, er svampen blevet en modelorganisme til undersøgelse af svampe-planteinteraktioner23. Blokering hvert trin i infektionsprocessen af M. oryzae kan resultere i mislykket infektion. De morfologiske ændringer under infektionsprocessen er strengt reguleret af hele genomfunktionen og gentransskriptionen. Blandt dem spiller epigenetiske modifikationer som histone methylering en væsentlig rolle i transskriptionionen af funktionelle gener24,25. Men indtil videre er der kun gjort få undersøgelser af den molekylære mekanisme af epigenetiske modifikationer som histone methylering og histoneactylation i transskriptionen af patogenesegener i M. oryzae. Derfor vil yderligere udvikling af den epigenetiske reguleringsmekanisme for ris blast svamp, mens researchinh opstrøms og downstream regulatoriske netværk af disse patogene relaterede gener bidrage til at udvikle ris blast forebyggelse og kontrol strategier.
Med udviklingen af funktionelle genomforskninger som ChIP-seq, især i epigenetik, har denne high-throughput dataindsamlingsmetode fremskyndet forskning i kromosomer. Ved hjælp af ChIP-seq eksperimentel teknologi kan genomomfordelingen af histone methylering (såsom H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) i M. oryzae og andre filamentøse svampe identificeres. Derfor kan denne metode hjælpe med at belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for, hvordan epigenetiske modifikationer regulerer deres kandidatmålgener under svampepatogenese i plantepatologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af protoplaster fra M. oryzae
- Forbered havregryn-tomat agar (OTA).
- Afvej 30-50 g havregryn og kog den i 800 mL vand (ddH2O) i 20 min. Filtrer gennem to lag gaze og tag filtratet.
- Vælg modne tomater og skræl dem. Klem saften, og filtrer gennem to lag gaze for at opsamle 150 mL af den filtrerede saft.
- Bland al tomatsaft og den forberedte havrefiltrat grundigt og tilsæt ddH2O op til 1000 mL.
- Tilsæt 250 mL af OTA og 2,5 g agarpulver til en 500 mL konisk kolbe og autoklave i 20 min. Opbevares ved 25 °C.
- Hæld 25 mL af den autoklavede OTA i et glas 5 cm x 5 cm Petriskål. Forbered 10 af disse Petri retter i alt. Når OTA'en er størknet på Petri-retterne, skal du opbevare opvasken på hovedet ved 25 °C.
- Brug en steriliseret tandstikker til at grave et lille stykke mycelium fra M. oryzae (den vilde type stamme P131, knockout stammer Δmobre2, Δmospp1, og Δmoswd2) og placere dem på de forberedte OTA retter. Kultur dem i 4-6 dage ved 28 °C under lysforhold.
BEMÆRK: Vend petriskålen på hovedet for at forhindre forurening. - Tilsæt 1000 μL væske Complete Medium (CM) (0,6% gærekstrakt, 0,3% enzymatisk kaseinhydrolysat, 0,3% surt kaseinhydrolysat, 1% glukose) til OTA-retterne ved hjælp af en 1000 μL pipette.
BEMÆRK: Hyfanen voksede på OTA-retterne i 4-6 dage. - Skrab mykelia af den vilde type stamme og knockout stamme med en podning loop.
- Saml mykelia vragrester og overføre dem til 250 mL væske Complete Medium (CM).
- Svampeaffaldet dyrkes i en trekantet kolbe ved 28 °C i 36 timer med rysten ved 150 omdrejninger.
- Brug en tragt til at filtrere og indsamle svampehyfabe.
- Svampehyfafaen vaskes med 500 mL 0,7 M NaCl-opløsning.
- Saml svampemyceliet og afvej det.
BEMÆRK: Myceliet behøver ikke at tørres før vejning. - Tilsæt ~1 mL lysis enzym permeation opløsning pr 1 g af svampe mycelium.
- 20 mg/mL lysis enzym permeationsopløsningen opløses ved at opløse lysisenzymet fra Trichoderma harzianum i 0,7 M NaCl.
- Hyfanen placeres ved 28 °C i 3-4 timer med rysten ved 150 omdrejninger.
- Lys hyfanen vaskes med 50 mL 0,7 M NaCl-opløsning.
- Protoplasterne og centrifugen opsamles i 15 min ved 2.000 x g og 4 °C.
- Efter centrifugering skal supernatanten kasseres forsigtigt. Resuspend protoplasterne i 20 mL af 0,7 M NaCI buffer ved 4 °C.
2. In vivo crosslinking og sonikering
- Der tilsættes 55 μL 37% formaldehyd (tilsæt formaldehyd dråbe for dråbe, indtil den endelige koncentration er 1%) til 2 mL NaCI buffer indeholdende protoplast til krydslinking.
- Protoplasterne inkuberes ved 25 °C i 10 min.
- Der tilsættes 20 μL 10x glycin til hvert rør for at slukke den uredigerede formaldehyd.
- Hvirvel til at blande og inkubere ved 25 °C i 5 min.
- Centrifuge i 15 min ved 2.000 x g og 4 °C.
- Efter centrifugering skal supernatanten kasseres forsigtigt. Brugpillen igen i 1 mL 0,7 M NaCI-opløsning.
- Centrifuge i 10 min ved 2.000 x g og 4 °C.
- Efter centrifugering skal supernatanten kasseres forsigtigt. Brugpillen igen i 750 μL RIPA-buffer(50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS og proteasehæmmere).
- Der tilsættes 37,5 μL 20x proteasehæmmer.
- Overfør protoplasterne fra det foregående trin til et 1,5 mL centrifugerør.
- Udfør sonikering (25% W, output 3 s, stop 5 s, 4 °C) straks med en soniker i ca. 10 min. Formålet med dette trin er at sonikere det krydsforbundne lysat i en periode for at bestemme de bedste betingelser.
BEMÆRK: Lysatet kan fryses ved -80 °C ved dette trin. - Hvis optimale betingelser for sonikering allerede er fastlagt, skal du gå videre til næste trin.
- Hvis det ønskes, skal du fjerne 5 μL protoplaster til agarosegelanalyse (uhørt DNA).
- Forskyde kromatin ved sonikering med en ultralyd homogenisator i 8 min (25% W, output 3 s, stop 5 s, 4 °C).
- Når prøven er ultralyd brudt, skal du tage en del af prøven ud som "input".. Inputtet udfører ikke ChIP-eksperimentet og indeholder alt DNA og protein, der frigives, efter at prøven er sonikeret.
- Efter sonikering skal du køre en 1% agarosegelelektroforese for at analysere længden af DNA-fragmenter.
BEMÆRK: Resultaterne af agarosegelelektroforese viser, at DNA-fragmentets længde er 200-500 bp (Figur 4). - Placer det sonikerede rør på is for at forhindre proteinforringelse.
- Centrifuge i 10 min ved 10.000 x g og 4 °C.
- Efter centrifugering overføres det centrifugerede supernatant til et nyt 1,5 mL centrifugerør, og det opbevares ved -80 °C til senere brug. Kromatinopløsningen, der opnås i dette trin, kan bruges til efterfølgende IP.
- Før IP-eksperimentet udføres, fortyndes hver kromatinprøve til et forhold på 1:10 med 1x RIPA-buffer (f.eks. tilsættes 10 μL kromatinprøve til 1 μL af 1×RIPA buffer).
3. IP af krydslinket protein/DNA
- Pipette 50 μL superparamagnetiske proteinperler i et 2 mL centrifugerør. Placer rørene på et magnetisk stativ. Lad de magnetiske perler bundfælde. Fjern supernatanten.
- Tilsæt 1 mL 1x RIPA buffer (forkølet på is) til røret og vask superparamagnetiske proteinperler tre gange. Efter vask skal rørene placeres på et magnetisk stativ og fjerne supernatanten. Der tilsættes 100 μL 1x RIPA-buffer til hvert rør.
- Der blev anvendt 300 μL chormatinprøve (2 x 107 celler), 100 μL superparamagnetiske proteinperler og 4 μL H3K4me3 antistof til røret.
- Brug eksempler med Mouse IgG som negativ kontrol.
BEMÆRK: Muse-IgG, der anvendes i denne protokol, indeholder 0,01 M fosfatbuffer og 0,15 M NaCl og forbliver frosset til under 20 °C (se Materialetabel). - Efter at have blandet godt, placeres prøverne på en roterende shaker og inkuberes natten over ved 4 °C, 30 x g.
BEMÆRK: Det kan være muligt at reducere inkubationstiden for immunprecipitationen (IP). Inkubationstiden afhænger af forskellige faktorer (f.eks. antistoffet, genmålet, celletypen osv.) og skal empirisk testes.
4. Indsamling og skylning af IP-produkterne
- Pellet de superparamagnetiske proteinperler ved at placere dem på et magnetisk stativ. Aspirere og kassere supernatanten.
- Vask det superparamagnetiske protein perle-antistof/kromatin kompleks ved at genoplive perlerne i 1 mL af 1x RIPA buffer.
- Skyl røret på en roterende shaker i 5 min og fjern supernatanten ved 30 x g.
- Tilsæt 1 mL lav salt immun kompleks vask buffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, og 150 mM NaCl).
- Skyl røret på en roterende shaker i 5 min og fjern supernatanten.
- Tilsæt 1 mL høj salt immun kompleks vask buffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, og 500 mM NaCl) til centrifuge rør.
- Placer røret på en roterende shaker i 5 min og fjern supernatanten.
- Skyl med 1 mL LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoxycholic syre, 1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl pH 8.1) i centrifugerøret.
- Placer røret på en roterende shaker i 5 min og fjern supernatanten.
- Skyl reagensglasset igen med 1 mL 0,25 M LiCI-buffer, fjern supernatanten med en pipette, og kassér derefter supernatanten.
- Tilføj 1 mL TE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA).
- Placer røret på en roterende shaker i 5 min ved 30 x g.
- Vask røret igen med 1 mL TE buffer og fjern supernatanten med en pipette.
- Saml perlerne.
5. Elution af protein/DNA-komplekser
- Opløsningsbufferen (10 μL på 20 % SDS, 20 μL på 1 M NaHCO3, 170 μL steril destilleret H2O) til alle IP- og inputrør.
- Der tilsættes 100 μL elutionsbuffer til hvert centrifugerør.
- Opløsning ved 65 °C i 15 min.
- Centrifuge i 1 min ved 10.000 x g og 4 °C og opsamle supernatanten i nye centrifugrør.
- Gentag trin 5.2 - 5.4 og kombiner eluaterne. Der tilsættes 190 μL elutionsbuffer til 10 μL af input-DNA'et. (samlet volumen = 200 μL).
6. Omvendt krydskædning af protein/DNA-komplekser
- Der tilsættes 8 μL på 5 M NaCl til alle rørene, og inkuberes ved 65 °C i 4-5 timer eller natten over for at vende dna-protein-krydsforbindelserne.
BEMÆRK: Efter dette trin skal prøverne opbevares ved -20 °C og fortsætte protokollen den følgende dag, hvis det er nødvendigt. - Der tilsættes 1 μL RNase A og inkuberes i 30 min ved 37 °C.
- Der tilsættes 4 μL proteinase K (opløst i H2O ved 20 mg/mL og opbevares ved -20 °C) til hvert rør og inkuberes ved 45 °C i 1-2 timer.
7. Rensning og inddrivelse af DNA
- Der tilsættes 550 μL phenol/chloroform/isoamylalkoholblanding (forholdet 25:24:1) til centrifugerøret.
- Hvirvd blandingen grundigt i 1 min.
- Centrifuge i 15 min ved 10.000 x g og aspirere supernatanten.
- Overfør det ekstraherede supernatant fra det foregående trin til et nyt 1,5 mL centrifugerør.
- 1/10 volumen af 3 M natriumacetatopløsning, 2,5 volumener absolut ethanol og 3 μL glykogen (20 mg/ml) til røret.
- Prøven anbringes i køleskab ved -20 °C natten over for nedbør.
- Centrifuge i 15 min ved 10.000 x g og 4 °C.
- Kassér supernatanten efter centrifugering. Vask pellet tre gange med 1 mL 75% ethanol (skal tilberedes frisk) ved 10.000 x g.
- Læg det vaskede bundfald på en ren bænk for at lade alkoholen tørre.
- Der tilsættes 50 μL steril deioniseret H2O for i tilstrækkelig grad at opløse bundfaldet.
- Ligate sekventeringsadapteren til DNA-fragmentet og brug en sekventeringsplatform med høj kapacitet til at sekvensere DNA'et.
8. DNA-reparation og Solexa bibliotekskonstruktion
- Reparer DNA-enderne for at generere stumpt end-end-reparationsbuffer, ved hjælp af et DNA-endereparationssæt (1-34 μL DNA, 5 μL på 10x endreparationsbuffer, 5 μL på 2,5 mM hver dNTP, 5 μL på 10 mM ATP, 1 μL endreparationsenzymblanding og H2O for at justere reaktionsvolumenet til 49 μL).
- Brug et PCR-rensningssæt eller phenol: kloroformudvinding til at rense DNA'et. Udsmid eller resuspend DNA'et i 30 μL af 1x TE pH 7.4.
- Der tilsættes "A" til 3' ender (30 μL DNA fra trin 2, 2 μL på H2O, 5 μL på 10x Taq-buffer, 10 μL på 1 mM dATP og 3 μL Taq DNA-polymerase). Tilsættes reagenserne til et 0,2 mL PCR-centrifugerør, bland godt, og reager i en PCR-maskine ved 72 °C i 10 min.
- Udfør linker ligation ved at blande 10 μL DNA, 9,9 μL af H2O, 2,5 μL T4 DNA ligase buffer, 0,1 μL adapter oligo mix og 2,5 μL af T4 DNA ligase. Tilsæt reagenserne til et 0,2 mL PCR-centrifugerør og bland godt. Inkuberes ved 16 °C i 4 timer.
- Rense DNA'et ved hjælp af et PCR-rensningssæt i henhold til producentens protokol. Elute med 20-25 μL elution buffer.
- Før DNA-biblioteket oprettes, identificeres koncentrationen af det rensede DNA for at bekræfte dets anvendelse til de efterfølgende sekventeringsforsøg.
- Detekter DNA-koncentrationen ved hjælp af et fluorometer. Efter smeltning af prøven på is blandes den grundigt og centrifuger i 30 s ved 1000 x g og 4 °C. Tag derefter en passende mængde prøve og mål den i et fluorometer med en bølgelængde på 260 nm.
- Placer DNA-prøver med kvalificeret kvalitet og koncentration på Illumina sekventering platform til sekventering.
- Før sekventering forstærkes DNA'et ved hjælp af PCR-primere, PE1.0 og PE2.0 og 2x high fidelity master mix (10,5 μL DNA, 12,5 μL af 2x high fidelity master mix, 1 μL PCR primer PE1.0 og 1 μL PCR primer PE2.0). Tilsæt reagenserne til et 0,2 mL PCR-centrifugerør og bland godt.
- Kør PCR-reaktionen i PCR-maskinen: 95 °C predenaturering i 2 min; derefter 35 cyklusser på 95 °C denaturering i 10 s, udglødning ved 60 °C for 15 s, forlængelse ved 72 °C for 5 s; en endelig forlængelse ved 72 °C i 5 min. Endelig inkuberes reaktionen ved 4 °C.
- Brug DNA til klynge generation og udføre sekventering-by-syntese på en Illumina Hiseq 2000.
BEMÆRK: I denne protokol blev Illumina-flowceller brugt til klyngegenerering. Sekventering-by-syntesen blev udført på en Illumina Genome Analyzer efter producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele rutediagrammet for ChIP-seq-metoden vises i figur 1. ChIP-seq-eksperimenter blev udført ved hjælp af antistoffer mod H3K4me3 i den vilde stamme P131 og tre null mutant stammer, der var blottet for mobre2, mospp1og moswd2 gen for at kontrollere hele genomet-dækkende profil af histone H3K4me3 fordeling i M. oryzae. Protoplasterne af den vilde stamme, Δmobre2,Δmospp1og Δmoswd2, blev forberedt og sonikeret ved 25% W, output 3 s, stop 5 s, ved 4 °C. Desuden blev kromatin immunpurified med H3K4me3 antistof og Dynabeads protein A/G. Efterfølgende blev DNA-fragmenter udvundet ved hjælp af phenol-chloroform metode til at konstruere en sekventering bibliotek og sekventeret med enkelte ender på en high-throughput sekventering platform.
De repræsentative resultater af den vilde type, Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2 stammer med ChIP-seq metode ved hjælp af H3K4me3 antistof er vist i figur 2. H3K4me3-signalerne fra Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2 sletningsmutanter blev signifikant reduceret i dets funktionelle målregioner. Som vist i figur 2blev nogle udvalgte kandidatmålgener, herunder MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 og MGG_04235, kortlagt til H3K4me3-distribution. Sammenlignet med den vilde stamme P131, signalerne fra beriget H3K4me3-ChIP-seq læser i Δmobre2, Δmospp1, og Δmoswd2 sletning mutanter blev stort set faldet (Figur 2)26. Disse resultater tyder på, at H3K4me3 modifikation spiller vigtige roller i reguleringen af mål genekspression i M. oryzae.
Figur 1. Rutediagrammet for ChIP-seq-metoden i M. oryzae. (A) Det genomiske DNA af M. oryzae blevkryds forbundet med 1% formaldehyd. (B) Lysed blast svamp celler, brudt DNA, gratis DNA, og histone bindende DNA blev efterfølgende opnået. C) DNA-fragmenter, der var bundet til histoner, og som blev udvundet ved specifik binding til H3K4me3-antistoffet. (D) Gennem omvendt krydsklink opnåede renset DNA efterfølgende DNA-fragmenter modificeret af H3K4me3 histoner. (E-F) DNA-fragmenter blev sekventeret, sekventeringsresultaterne blev sammenlignet, og sekvenser blev identificeret i M. oryzae DNA-gruppen. (G) Specifikke gener og loci af H3K4me3 histoner i M. oryzae blev hentet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Den Δmobre2, Δmospp1, og Δmoswd2 sletning mutanter betydeligt faldt H3K4me3 profiler i deres mål regioner. H3K4me3-ChIP-seq-fordelingen af berigede toppe omkring kodningsregionerne af overlappede gener i Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2 deletion mutanter aflives sammenlignet med den vilde stamme i MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 og MGG_04235 gener26. Tallet i WT (input), der er mærket som [0-2074], betyder, at chip's resultater i området for genomisk DNA [0-2074]. [0-2074] refererer til 0-2074bp af kromosom 6.Figuren viser et tilfældigt udvalg af sekventeringsresultaterne, som kun repræsenterer DNA-fordelingen på kromosom 6. De fuldstændige sekventeringsresultater er blevet forelagt Genbank. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/accession 649321) 26. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Serienummer | Eksempelnavn | Eksempel på serienummer | Antal rør | I alt (μg) | Fragmentfordeling | Databasetype | Bemærkninger | ||||
| 1 | indgang | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | Den vigtigste top er under 100bp, men der er DNA-fordeling mellem 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmentet er for lille | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Indgang | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | Den vigtigste top er under 100bp, men der er DNA-fordeling mellem 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmentet er for lille | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | input Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | Den vigtigste top er under 100bp, men der er DNA-fordeling mellem 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmentet er for lille | ||||
| 4 | input Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | Den vigtigste top er under 100bp, men der er DNA-fordeling mellem 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmentet er for lille | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | Den vigtigste top er mellem 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | Den vigtigste top er mellem 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | Den vigtigste top er mellem 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | Den vigtigste top er mellem 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
Tabel 1. Den samlede mængde DNA i dette eksperiment. Den samlede indgangsmængde P131( 2) er 2,7948 μg, den samlede mængde Δmobre2(3) (input) er 2,4748 μg, den samlede mængde Δmospp1(4) (input) er 3,22 μg, den samlede mængde af Δmoswd2 (5) (input) er 3,97 μg, og det samlede beløb på P131(2) er 0,0735 μg, den samlede mængde af Δmobre2(3) er 0,0491μg, den samlede mængde Δmospp1(4) er 0,0288 μg, den samlede mængde Δmoswd2(5) er 0,0527 μg.
Figur 3. Elektroforese påvisning af DNA efter ultralyd. Efter ultralyd sonikering, DNA udsættes for en 1% agarose gel eksperiment til at analysere længden af DNA-fragmenter. Den sonikerede DNA-fragmentlængde er fra 200-500 bp, og disse DNA-fragmenter kan bruges til følgende trin i ChIP-seq. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Bioanalyzer spor af input og ChIP prøver. Figuren viser fragmentfordelingen af hver prøve, hvor abscissa repræsenterer fragmentstørrelsen, og ordinaten repræsenterer spidsstørrelsen. Prøverne, der kører på bioanalyzeren, er input P131(2), Δmobre2(3) (input), Δmospp1(4) (input), Δmoswd2(5) (input), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Blandt dem viser fordelingen af input P131(2), Δmobre2(3) (input), Δmospp1(4) (input), Δmoswd2(5) (input) hovedtoppen er under 100 bp, men der er DNA-fordeling ved 100-500 bp. Den sande fordeling af P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) og Δmoswd2(5) er mellem 100-500 bp som den vigtigste top26. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For nylig er ChIP-seq blevet en meget anvendt genomisk analysemetode til bestemmelse af de bindende websteder for TF'er eller berigelsessteder, der er ændret af specifikke histoner. Sammenlignet med tidligere ChIP-seq-teknologi er den nye ChIP-seq-teknologi meget følsom og fleksibel. Resultaterne leveres i høj opløsning uden negative virkninger, såsom støjsignalet forårsaget af den ikke-specifikke hybridisering af nukleinsyrer. Selv om dette er en fælles genekspression analyse, mange beregningsmæssige metoder er blevet valideret, og kompleksiteten af ChIP-seq data med hensyn til støj og variabilitet gør dette problem særligt vanskeligt for ChIP-seq at overvinde. Med hensyn til dataanalyse er styring og analyse af den store mængde data, der genereres af ChIP-seq-eksperimenter, også en udfordring, der endnu ikke er løst tilstrækkeligt.
Der er flere vigtige trin i ChIP-seq-eksperimentet. Først og fremmest er forberedelsen af protoplasterne meget vigtig. Det er nødvendigt at kontrollere kollapstiden, så protoplaster af høj kvalitet kan indsamles. Ultralyd er også meget vigtigt, ultralydstiden skal kontrolleres, for lang eller for kort vil ikke fungere. For det andet bør mængden af tilsat antistof være tilstrækkelig til at lette berigelsen af flere DNA-fragmenter, der binder sig til proteinet. Ved kontrol af kvaliteten og mængden af DNA, der er udfældet i ChIP-seq-eksperimentet, blev Qubit Fluorometer anvendt. Agilent 2100 blev brugt til at detektere massekoncentrationen og fragmentfordelingen af DNA, hvilket danner grundlag for, om prøven kan bruges til efterfølgende biblioteks- og sekventeringsforsøg.
Samlet set forbedrer denne protokol forståelsen af hele genomomomomfordelingen af epigenetiske modifikationer, der regulerer patogene gener under patogeninfektion. Denne metode vil bidrage til at identificere molekylære mekanismer for epigenetiske modifikationer og identificere nye målgener under svampeudvikling og patogenfremkaldt patogenese i M. oryzae og andre filamentøse svampe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), special Scientific Research Project of Beijing Agriculture University (YQ201603), Det Videnskabelige Projekt i Beijing Educational Committee (KM201610020005), BUA 's videnskabelige forskningsdyrkningsprojekt (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al.
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T.
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
