Summary
Her presenterer vi en protokoll for å analysere den genomomfattende fordelingen av histone modifikasjoner, som kan identifisere nye målgener i patogenesen av M. oryzae og andre filamentøse sopp.
Abstract
Kromatinimmunoprecipitation sekvensering (ChIP-seq) er en kraftig og mye brukt molekylær teknikk for å kartlegge hele genomet steder av transkripsjonsfaktorer (TFer), kromatinregulatorer og histone modifikasjoner, samt oppdage hele genomer for å avdekke TF bindende mønstre og histone posttranslational modifikasjoner. Kromatinmodifiserende aktiviteter, som histone metylering, rekrutteres ofte til spesifikke genregulatoriske sekvenser, forårsaker lokaliserte endringer i kromatinstrukturer og resulterer i spesifikke transkripsjonseffekter. Risblåsingen er en ødeleggende soppsykdom på ris over hele verden og er et modellsystem for å studere soppplanteinteraksjon. Imidlertid forblir de molekylære mekanismene i hvordan histone modifikasjonene regulerer deres virulensgener i Magnaporthe oryzae unnvikende. Flere forskere må bruke ChIP-seq for å studere hvordan histone epigenetisk modifikasjon regulerer deres målgener. ChIP-seq er også mye brukt til å studere samspillet mellom protein og DNA hos dyr og planter, men det er mindre brukt innen plantepatologi og har ikke blitt godt utviklet. I dette dokumentet beskriver vi den eksperimentelle prosessen og operasjonsmetoden til ChIP-seq for å identifisere den genomomfattende fordelingen av histonmetylering (som H3K4me3) som binder seg til de funksjonelle målgenene i M. oryzae. Her presenterer vi en protokoll for å analysere den genomomfattende fordelingen av histone modifikasjoner, som kan identifisere nye målgener i patogenesen av M. oryzae og andre filamentøse sopp.
Introduction
Epigenetikk er en gren av genetisk forskning som refererer til arvelig endring av genuttrykk uten å endre nukleotidsekvensen av gener. Et økende antall studier har vist at epigenetisk regulering spiller en viktig rolle i veksten og utviklingen av eukaryote celler, inkludert kromatin som regulerer og påvirker genuttrykk gjennom den dynamiske prosessen med å brette og montere i høyere orden strukturer1,2. Kromatin ombygging og kovalent histone modifikasjon påvirker og regulerer funksjonen og strukturen av kromatin gjennom variasjonen av kromatinpolymerer, og oppnår dermed funksjonen til å regulere genuttrykk3,4,5,6. Posttranslasjonelle modifikasjoner av histon inkluderer acetylering, fosforylering, metylering, monoubiquitination, sumoylering og ADP ribosylering7,8,9. Histone H3K4 metylering, spesielt trimetylering, er kartlagt til transkripsjonsstartsteder der det er knyttet til transkripsjonsreplikasjon, rekombinasjon, reparasjon og RNA-behandling i eukaryoter10,11.
ChIP-seq-teknologi ble introdusert i 2007 og har blitt den eksperimentelle standarden for genomomfattende analyse av transkripsjonsregulering og epigenetiskemekanismer 12,13. Denne metoden er egnet i genomomskalaen og for å innhente informasjon om interaksjon med histone eller transkripsjonsfaktor, inkludert DNA-segmenter av DNA-bindende proteiner. Eventuelle DNA-sekvenser krysskoblet til proteiner av interesse vil coprecipitate som en del av kromatinkomplekset. Ny generasjon sekvenseringsteknikker brukes også til å sekvensere 36-100 bp DNA, som deretter tilpasses det tilsvarende målgenomet.
I fytopatogeniske sopp har forskning nylig begynt å studere hvordan histone metyleringsmodifikasjoner regulerer deres målgener i prosessen med patogenitet. Noen tidligere studier viste at reguleringen av histone metylaserelaterte gener hovedsakelig gjenspeiles i genaktivering og katalysering av produksjonen av sekundære metabolitter (SM). MoSet1 er H3K4-metylase i M. oryzae. Knockout av dette genet resulterer i fullstendig sletting av H3K4me3 modifikasjon14. Sammenlignet med den ville stammen, er uttrykket av genet MoCEL7C i mutanten hemmet i CMC-indusert tilstand og i ikke-indusert tilstand (glukose eller cellobiose), økte uttrykket av MoCEL7C 15. I Fusarium graminearumkan KMT6 katalysere metyleringsmodifiseringen av H3K27me3, regulere den normale utviklingen av sopp og bidra til å regulere det "kryptiske genomet" som inneholder SM-genklyngen16,17,18,19. I 2013 rapporterte Connolly at H3K9 og H3K27 metylering regulerer den patogene prosessen med sopp gjennom sekundære metabolitter og effektfaktorer som regulerer hemmingen av målgener20. I Aspergilluser modifikasjonen av histoner H3K4me2 og H3K4me3 relatert til genaktivering og spiller en viktig rolle i å kontrollere kromatinnivåreguleringen av SM-genklynger21. I M. oryzaeer Tig1 (homolog til Tig1 i gjær og pattedyr) en HADC (histone deacetylase)22. Knockout av Tig1-genet fører til fullstendig tap av patogenitet og sporeproduksjonsevne i nullmutanten. Det er mer følsomt for et peroksygenmiljø, som ikke kan produsere infektiv hyphae22.
Riseksplosjonen forårsaket av M. oryzae. er en av de mest alvorlige rissykdommene i de fleste risvoksende områder i verden19. På grunn av sin representative infeksjonsprosess ligner M. oryzae infeksjonsprosessen til mange viktige patogene sopp. Som det lett kan utføre molekylære genetiske operasjoner, har soppen blitt en modellorganisme for å studere soppplanteinteraksjoner23. Blokkering av hvert trinn i infeksjonsprosessen til M. oryzae kan føre til mislykket infeksjon. De morfologiske endringene under infeksjonsprosessen er strengt regulert av hele genomfunksjonen og gentranskripsjonen. Blant dem spiller epigenetiske modifikasjoner som histone metylering en viktig rolle i transkripsjonsreguleringen av funksjonelle gener24,25. Men så langt har det blitt gjort få studier på den molekylære mekanismen for epigenetiske modifikasjoner som histonmetylering og histonacetylering i transkripsjonen av patogenesegener i M. oryzae. Derfor vil videreutvikling av den epigenetiske reguleringsmekanismen til risblåse soppen mens forskning på oppstrøms og nedstrøms regulatorisk nettverk av disse patogene relaterte genene bidra til å utvikle risblåseforebygging og kontrollstrategier.
Med utviklingen av funksjonell genomikk som ChIP-seq, spesielt i epigenetikk, har denne datainnsamlingsmetoden med høy gjennomstrømning akselerert forskning på kromosomer. Ved hjelp av ChIP-seq eksperimentell teknologi kan genom-wide distribusjon av histonmetylering (som H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) i M. oryzae og andre filamentøse sopp identifiseres. Derfor kan denne metoden bidra til å belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn for hvordan epigenetiske modifikasjoner regulerer deres kandidatmålgener under sopppatogenese i plantepatologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning av protoplaster fra M. oryzae
- Forbered havregryn-tomatagaren (OTA).
- Vei 30-50 g havregryn og kok det i 800 ml vann (ddH2O) i 20 min. Filtrer gjennom to lag gasbind og ta filtratet.
- Velg modne tomater og skrell dem. Klem saften, og filtrer gjennom to lag gasbind for å samle 150 ml av den filtrerte saften.
- Bland all tomatjuice og tilberedt havrefiltrat grundig og tilsett ddH2O opptil 1000 ml.
- Tilsett 250 ml OTA og 2,5 g agarpulver til en konisk kolbe på 500 ml og autoklaver i 20 minutter. Oppbevars ved 25 °C.
- Hell 25 ml av den autoklavede OTA i et glass 5 cm x 5 cm Petri-tallerken. Forbered 10 av disse Petri-rettene totalt. Etter at OTA har størknet på Petri-rettene, lagre oppvasken opp ned ved 25 °C.
- Bruk en sterilisert tannpirker til å grave ut et lite stykke mycelium fra M. oryzae (den ville stammen P131, knockout stammer Δmobre2, Δmospp1 og Δmoswd2) og legg dem på de tilberedte OTA-rettene. Kultur dem i 4-6 dager ved 28 °C under lette forhold.
MERK: Snu Petri-retten opp ned for å unngå forurensning. - Tilsett 1000 μL flytende Komplett medium (CM) (0,6% gjærekstrakt, 0,3% enzymatisk kaseinhydrolysat, 0,3% surt kaseinhydrolysat, 1% glukose) til OTA-rettene ved hjelp av en 1000 μL pipette.
MERK: Hyphae vokste på OTA-rettene i 4-6 dager. - Skrap mycelia av villtypestammen og knockout-stammen med en inokulasjonssløyfe.
- Samle mycelia rusk og overfør dem til 250 ml flytende Komplett Medium (CM).
- Voks soppavfallet i en trekantet kolbe ved 28 °C i 36 timer med risting ved 150 o/min.
- Bruk en trakt til å filtrere og samle sopphyfasen.
- Vask sopphyfasen med 500 ml 0,7 M NaCl-oppløsning.
- Samle sopp myceliet og vei det.
MERK: Myceliet trenger ikke tørkes før veiing. - Tilsett ~1 ml lysis enzym permeasjonsoppløsning per 1 g soppmelcelium.
- Forbered 20 mg / ml lysis enzym permeasjonsløsning ved å oppløse lysis-enzymet fra Trichoderma harzianum i 0,7 M NaCl.
- Plasser hyphae for lysing ved 28 °C i 3-4 timer med risting ved 150 o/min.
- Vask den lysede hyphae med 50 ml 0,7 M NaCl-oppløsning.
- Samle protoplaster og sentrifuge i 15 min ved 2000 x g og 4 °C.
- Etter sentrifugering, kast supernatanten forsiktig. Resuspend protoplastene i 20 ml 0,7 M NaCI buffer ved 4 °C.
2. In vivo krysskobling og sonikering
- Tilsett 55 μL 37% formaldehyd (tilsett formaldehyddråpe for dråpe til den endelige konsentrasjonen er 1%) til 2 ml NaCI-buffer som inneholder protoplast for krysskobling.
- Inkuber protoplastene ved 25 °C i 10 min.
- Tilsett 20 μL 10x glycin til hvert rør for å slukke den ikke-utførte formaldehyden.
- Virvle for å blande og inkubere ved 25 °C i 5 minutter.
- Sentrifuge i 15 min ved 2000 x g og 4 °C.
- Etter sentrifugering, kast supernatanten forsiktig. Resuspend pellets i 1 ml 0,7 M NaCI-oppløsning.
- Sentrifuge i 10 min ved 2000 x g og 4 °C.
- Etter sentrifugering, kast supernatanten forsiktig. Resuspend pellet i 750 μL RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS og proteasehemmere).
- Tilsett 37,5 μL 20x proteasehemmer.
- Overfør protoplastene fra forrige trinn til et 1,5 ml sentrifugerør.
- Utfør sonikering (25% W, utgang 3 s, stopp 5 s, 4 °C) umiddelbart med en soniker i ca. 10 minutter. Formålet med dette trinnet er å sonikere den krysskoblede lysate i en periode for å bestemme de beste forholdene.
MERK: Lysatet kan fryses ved -80 °C på dette trinnet. - Hvis optimale forhold for sonikering allerede er bestemt, fortsett til neste trinn.
- Fjern eventuelt 5 μL protoplaster for agarosegelanalyse (uarkert DNA).
- Skjær kromatin ved sonikering med en ultralyd homogenisator i 8 min (25% W, utgang 3 s, stopp 5 s, 4 °C).
- Etter at prøven er ultrasonisk ødelagt, ta ut en del av prøven som "input".. Inngangen utfører ikke ChIP-eksperimentet og inneholder alt DNA og protein som frigjøres etter at prøven er sonikert.
- Etter sonikering, kjør en 1% agarose gel elektroforese for å analysere lengden på DNA-fragmentene.
MERK: Resultatene av agarosegelelektroforesen viser at lengden på DNA-fragmentet er 200-500 bp (figur 4). - Plasser det sonikerte røret på isen for å forhindre proteinforringelse.
- Sentrifuge i 10 min ved 10.000 x g og 4 °C.
- Etter sentrifugering, overfør sentrifugert supernatant til et nytt 1,5 ml sentrifugerør og oppbevar det ved -80 °C for senere bruk. Kromatinoppløsningen oppnådd i dette trinnet kan brukes til etterfølgende IP.
- Før du utfører IP-eksperimentet, fortynn hver kromatinprøve til et forhold på 1:10 med 1x RIPA-buffer (f.eks. tilsett 10 μL kromatinprøve til 1 μL 1×RIPA-buffer).
3. IP av krysskoblet protein/DNA
- Pipette 50 μL superparamagnetisk proteinperler i et 2 ml sentrifugerør. Plasser rørene på et magnetisk stativ. La de magnetiske perlene utfelle. Fjern supernatanten.
- Tilsett 1 ml 1x RIPA buffer (forkjølt på is) til røret og vask superparamagnetiske proteinperler tre ganger. Etter vasken plasserer du rørene på et magnetisk stativ og fjerner supernatanten. Tilsett 100 μL 1x RIPA-buffer i hvert rør.
- Tilsett 300 μL chormatinprøve (2 x 107 celler ble brukt), 100 μL superparamagnetiske proteinperler og 4 μL H3K4me3 antistoff mot røret.
- Bruk eksempler med Muse-IgG som negativ kontroll.
MERK: Mus IgG som brukes i denne protokollen inneholder 0,01 M fosfatbuffer og 0,15 M NaCl, og vil forbli frosset under 20 °C (se Materialfortegnelser). - Etter å ha blandet godt, plasser prøvene på en roterende shaker og inkuber over natten ved 4 °C, 30 x g.
MERK: Det kan være mulig å redusere inkubasjonstiden for immunoprecipitation (IP). Inkubasjonstiden avhenger av ulike faktorer (f.eks. antistoffet, genmålet, celletypen osv.) og må testes empirisk.
4. Innsamling og skylling av IP-produktene
- Pellet de superparamagnetiske proteinperlene ved å plassere dem på et magnetisk stativ. Aspirer og kast supernatanten.
- Vask det superparamagnetiske proteinperle-antistoff/kromatinkomplekset ved å resuspendere perlene i 1 ml 1x RIPA-buffer.
- Skyll røret på en roterende shaker i 5 min og fjern supernatanten ved 30 x g.
- Tilsett 1 ml lav salt immunkompleks vaskebuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 og 150 mM NaCl).
- Skyll røret på en roterende shaker i 5 min og fjern supernatanten.
- Tilsett 1 ml høy salt immunkompleks vaskebuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 og 500 mM NaCl) til sentrifugerøret.
- Plasser røret på en roterende shaker i 5 min og fjern supernatanten.
- Skyll med 1 ml LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoksykolsyre, 1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl pH 8.1) i sentrifugerøret.
- Plasser røret på en roterende shaker i 5 min og fjern supernatanten.
- Skyll reagensglasset igjen med 1 ml 0,25 M LiCI-buffer, fjern supernatanten med en pipette, og kast deretter supernatanten.
- Legg til 1 ml TE-buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).
- Plasser røret på en roterende shaker i 5 min ved 30 x g.
- Vask røret igjen med 1 ml TE-buffer og fjern supernatanten med en pipette.
- Samle perlene.
5. Elution av protein/DNA-komplekser
- Klargjør elutionbufferen (10 μL 20 % SDS, 20 μL 1 M NaHCO3, 170 μL steril destillert H2O) for alle IP- og inngangsrørene.
- Tilsett 100 μL elutionbuffer i hvert sentrifugerør.
- Elution ved 65 °C i 15 minutter.
- Sentrifuge i 1 min ved 10.000 x g og 4 °C og samle supernatanten i nye sentrifugerør.
- Gjenta trinn 5.2 - 5.4 og kombiner eluates. Tilsett 190 μL elutionbuffer til 10 μL av inngangs-DNA-et. (totalt volum = 200 μL).
6. Omvendt krysskobling av protein/DNA-komplekser
- Tilsett 8 μL 5 M NaCl til alle rørene og inkuber ved 65 °C i 4-5 timer eller over natten for å reversere DNA-protein-krysskoblingene.
MERK: Etter dette trinnet lagrer du prøvene ved -20 °C, og fortsetter protokollen neste dag, om nødvendig. - Tilsett 1 μL RNase A og inkuber i 30 min ved 37 °C.
- Tilsett 4 μL Proteinase K (oppløst i H2O ved 20 mg/ml og lagret ved -20 °C) i hvert rør og inkuber ved 45 °C i 1-2 timer.
7. Rensing og gjenoppretting av DNA
- Tilsett 550 μL fenol/kloroform/isoamylalkoholblanding (forholdet 25:24:1) til sentrifugerøret.
- Virvel blandingen grundig i 1 min.
- Sentrifuge i 15 min ved 10.000 x g og aspirere supernatanten.
- Overfør den ekstraherte supernatanten fra forrige trinn til et nytt 1,5 ml sentrifugerør.
- Tilsett 1/10 volum 3 M natriumacetatoppløsning, 2,5 volumer absolutt etanol og 3 μL glykogen (20 mg/ml) til røret.
- Plasser prøven i kjøleskap ved -20 °C over natten for nedbør.
- Sentrifuge i 15 min ved 10.000 x g og 4 °C.
- Kast supernatanten etter sentrifugering. Vask pellet tre ganger med 1 ml 75% etanol (må tilberedes friskt) ved 10.000 x g.
- Plasser det vaskede bunnfallet på en ren benk for å la alkoholen tørke.
- Tilsett 50 μL steril deionisert H2O for å oppløse bunnfallet tilstrekkelig.
- Ligater sekvenseringsadapteren til DNA-fragmentet og bruk en sekvenseringsplattform med høy gjennomstrømning for å sekvensere DNA-et.
8. DNA-reparasjon og Solexa bibliotekkonstruksjon
- Reparer DNA-endene for å generere sløvt DNA ved hjelp av et DNA-endereparasjonssett (1-34 μL DNA, 5 μL 10x endereparasjonsbuffer, 5 μL 2,5 ml hver dNTP, 5 μL 10 mM ATP, 1 μL end-repair enzymblanding og H2O for å justere reaksjonsvolumet til 49 μL).
- Bruk et PCR-rensesett eller fenol: kloroformutvinning for å rense DNA-et. Elute eller resuspend DNA i 30 μL av 1x TE pH 7.4.
- Legg "A" til 3' ender (30 μL DNA fra trinn 2, 2 μL H2O, 5 μL 10x Taq buffer, 10 μL 1 mM dATP og 3 μL Taq DNA-polymerase). Legg reagensene til et 0,2 ml PCR sentrifugerør, bland godt og reager i en PCR-maskin ved 72 °C i 10 minutter.
- Utfør linker ligation ved å blande 10 μL DNA, 9,9 μL H2O, 2,5 μL T4 DNA-ligasebuffer, 0,1 μL adapter oligo-blanding og 2,5 μL T4 DNA-ligase. Legg reagensene til et 0,2 ml PCR sentrifugerør og bland godt. Inkuber dem ved 16 °C i 4 timer.
- Rens DNA-et ved hjelp av et PCR-rensesett i henhold til produsentens protokoll. Elute med 20-25 μL elutionbuffer.
- Før DNA-biblioteket etableres, identifiser konsentrasjonen av det rensede DNA-et for å bekrefte bruken av det påfølgende sekvenseringsforsøkene.
- Oppdag DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et fluorometer. Etter å ha smeltet prøven på is, bland den grundig og sentrifuger i 30 s ved 1000 x g og 4 °C. Ta deretter en passende mengde prøve og mål den i et fluorometer med en bølgelengde på 260 nm.
- Plasser DNA-prøver med kvalifisert kvalitet og konsentrasjon på Illumina sekvenseringsplattform for sekvensering.
- Før sekvensering, forsterke DNA ved hjelp av PCR primere, PE1.0 og PE2.0, og 2x high fidelity master mix (10.5 μL av DNA, 12.5 μL av 2x high fidelity master mix, 1 μL AV PCR primer PE1.0, og 1 μL av PCR primer PE2.0). Legg reagensene til et 0,2 ml PCR sentrifugerør og bland godt.
- Kjør PCR-reaksjonen i PCR-maskinen: 95 °C predenaturering i 2 minutter; deretter 35 sykluser med 95 °C denaturering i 10 s, gløding ved 60 °C i 15 s, forlengelse ved 72 °C i 5 s; en endelig forlengelse ved 72 °C i 5 min. Til slutt inkuberer du reaksjonen ved 4 °C.
- Bruk DNA for klyngegenerering og utfør sekvensering-for-syntese på en Illumina Hiseq 2000.
MERK: I denne protokollen ble Illumina strømningsceller brukt til klyngegenerering. Sekvensering-ved-syntesen ble utført på en Illumina Genome Analyzer etter produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele flytskjemaet for ChIP-seq -metoden vises i figur 1. ChIP-seq eksperimenter ble utført ved hjelp av antistoffer mot H3K4me3 i wild-type stammen P131 og tre null mutant stammer som var blottet for mobre2, mospp1, og moswd2 genet for å verifisere hele genom-wide profilen av histone H3K4me3 distribusjon i M. oryzae. Protoplastene til den ville stammen, Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2, ble forberedt og sonikert ved 25% W, utgang 3 s, stopp 5 s, ved 4 °C. Videre ble kromatin immunopurifisert med H3K4me3 antistoff og Dynabeads protein A / G. Deretter ble DNA-fragmenter ekstrahert ved hjelp av fenol-kloroformmetoden for å konstruere et sekvenseringsbibliotek og sekvensert med enkle ender på en sekvenseringsplattform med høy gjennomstrømning.
De representative resultatene av den ville typen, Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2 stammer med ChIP-seq-metoden ved hjelp av H3K4me3-antistoffet, er vist i figur 2. H3K4me3-signalene fra Δmobre2, Δmospp1og Δ moswd2-slettingsmutantene ble betydelig redusert i sine funksjonelle målregioner. Som vist i figur 2ble noen utvalgte kandidatmålgener, inkludert MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 og MGG_04235, kartlagt for H3K4me3-distribusjon. Sammenlignet med den ville stammen P131, ble signalene til beriket H3K4me3-ChIP-seq lest i Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2 sletting mutanter i stor grad redusert (Figur 2)26. Disse resultatene tyder på at H3K4me3-modifikasjonen spiller viktige roller i reguleringen av målgenuttrykket i M. oryzae.
Figur 1. Flytskjemaet for ChIP-seq -metoden i M. oryzae. (A) Det genomiske DNA-et til M. oryzae blekrysskoblet med 1% formaldehyd. (B) Lysed blast soppceller, ødelagt DNA, fritt DNA og histone bindende DNA ble senere oppnådd. (C) DNA-fragmenter bundet til histoner og ble ekstrahert ved spesifikk binding til H3K4me3-antistoffet. (D) Gjennom omvendt krysskobling fikk renset DNA senere DNA-fragmenter modifisert av H3K4me3-histoner. (E-F) DNA-fragmenter ble sekvensert, sekvenseringsresultatene ble sammenlignet, og sekvenser ble identifisert i M. oryzae DNA-gruppen. (G) Spesifikke gener og loci av H3K4me3 histoner i M. oryzae ble hentet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2 sletting mutanter reduserte H3K4me3-profilene betydelig i sine målregioner. H3K4me3-ChIP-seq-fordelingen av berikede topper rundt kodeområdene til overlappende gener i Δmobre2, Δmospp1og Δ moswd2-slettingsmutanter blir decresased sammenlignet med villtypestammen i MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 og MGG_04235 gener26. Tallet i WT (input) merket som [0-2074] betyr resultatene av ChIP i området genomisk DNA [0-2074]. [0-2074] refererer til 0-2074bp av kromosom 6.Figuren viser et tilfeldig utvalg av sekvenseringsresultatene, som bare representerer DNA-fordelingen på kromosom 6. De fullstendige sekvenseringsresultatene er sendt til Genbank. (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/ tiltredelse 649321) 26. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Serienummer | Navn på eksempel | Eksempel på serienummer | Antall rør | Totalt (μg) | Fragmentfordeling | Databasetype | Merknader | ||||
| 1 | innspill | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | Hovedtoppen er under 100bp, men det er DNA-distribusjon mellom 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmentet er for lite | ||||
| P131(2) | |||||||||||
| 2 | Innspill | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | Hovedtoppen er under 100bp, men det er DNA-distribusjon mellom 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmentet er for lite | ||||
| Δmobre2(3) | |||||||||||
| 3 | inngang Δmospp1(4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | Hovedtoppen er under 100bp, men det er DNA-distribusjon mellom 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmentet er for lite | ||||
| 4 | inngang Δmoswd(5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | Hovedtoppen er under 100bp, men det er DNA-distribusjon mellom 100bp-500bp | ChIP-seq | Fragmentet er for lite | ||||
| 5 | P131(2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | Hovedtoppen er mellom 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 6 | Δmobre2(3) | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | Hovedtoppen er mellom 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 7 | Δmospp1(4) | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | Hovedtoppen er mellom 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
| 8 | Δmoswd(5) | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | Hovedtoppen er mellom 100bp-500bp | ChIP-seq | |||||
Tabell 1. Den totale mengden DNA i dette eksperimentet. Den totale mengden inngang P131(2) er 2,7948 μg, den totale mengden Δmobre2(3) (inngang) er 2,4748 μg, den totale mengden Δmospp1(4) (inngang) er 3,22 μg, den totale mengden Δmoswd2 (5) (inngang) er 3,97 μg, og den totale mengden P131(2) er 0,0735 μg, den totale mengden Δmobre2(3) er 0,0491μg, den totale mengden Δmospp1(4) er 0,0288 μg, den totale mengden Δmoswd2(5) er 0,0527 μg.
Figur 3. Elektroforesedeteksjon av DNA etter ultralyd. Etter ultralyd sonikering blir DNA utsatt for et 1% agarose geleksperiment for å analysere lengden på DNA-fragmenter. Den sonikerte DNA-fragmentlengden er fra 200-500 bp, og disse DNA-fragmentene kan brukes til følgende trinn i ChIP-seq. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Bioanalysespor av Input- og ChIP-prøver. Figuren viser fragmentfordelingen av hver prøve, hvor abscissa representerer fragmentstørrelsen, og ordinatet representerer toppstørrelsen. Prøvene som kjører på bioanalysen er inngang P131(2), Δmobre2(3) (inngang), Δmospp1(4) (inngang), Δmoswd2(5) (inngang), P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4), Δmoswd(5). Blant dem viser fordelingen av inngang P131(2), Δmobre2(3) (inngang), Δmospp1(4) (inngang), Δmoswd2(5) (inngang) hovedtoppen under 100 bp, men det er DNA-distribusjon ved 100-500 bp. Den virkelige fordelingen av P131(2), Δmobre2(3), Δmospp1(4) og Δmoswd2(5) er mellom 100-500 bp som hovedtoppen26. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nylig har ChIP-seq blitt en mye brukt genomisk analysemetode for å bestemme bindingsstedene til TFer eller berikelsessteder modifisert av spesifikke histoner. Sammenlignet med tidligere ChIP-seq-teknologi er ny ChIP-seq-teknologi svært følsom og fleksibel. Resultatene leveres i høy oppløsning uten negative effekter, for eksempel støysignalet forårsaket av ikke-spesifikk hybridisering av nukleinsyrer. Selv om dette er en vanlig genuttrykksanalyse, har mange beregningsmetoder blitt validert, og kompleksiteten til ChIP-seq-data når det gjelder støy og variasjon gjør dette problemet spesielt vanskelig for ChIP-seq å overvinne. Når det gjelder dataanalyse, er administrasjon og analyse av den store mengden data generert av ChIP-seq-eksperimenter også en utfordring som ennå ikke er tilstrekkelig adressert.
Det er flere viktige trinn i ChIP-seq-eksperimentet. Først av alt er forberedelsen av protoplastene svært viktig. Det er nødvendig å kontrollere kollapstiden slik at protoplaster av høy kvalitet kan samles inn. Ultralyd er også svært viktig, ultralydtiden skal kontrolleres, for lang eller for kort vil ikke fungere. For det andre bør mengden antistoff som tilsetts være tilstrekkelig til å lette berikelsen av flere DNA-fragmenter som binder seg til proteinet. Ved verifisering av kvalitet og mengde DNA utfelt i ChIP-seq eksperimentet ble Qubit Fluorometer brukt. Agilent 2100 ble brukt til å oppdage massekonsentrasjonen og fragmentfordelingen av DNA, noe som gir grunnlag for om prøven kan brukes til etterfølgende biblioteksetablissement og sekvenseringseksperimenter.
Totalt sett forbedrer denne protokollen forståelsen av hele genom-brede fordelingen av epigenetiske modifikasjoner som regulerer patogene gener under patogen infeksjon. Denne metoden vil bidra til å identifisere molekylære mekanismer for epigenetiske modifikasjoner og identifisere nye målgener under sopputvikling og patogenindusert patogenese i M. oryzae og andre filamentøse sopp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklært at det ikke finnes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant no. 31871638), Special Scientific Research Project of Beijing Agriculture University (YQ201603), Scientific Project of Beijing Educational Committee (KM201610020005), High-level scientific research cultivation project of BUA (GJB2021005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al.
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T.
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
