Summary
यहां, हम हिस्टोन संशोधनों के जीनोम-व्यापी वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो एम ओरिज़ी और अन्य फिलामेंटस कवक के रोगजनन में नए लक्ष्य जीन की पहचान कर सकता है।
Abstract
क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन अनुक्रमण अनुक्रमण (ChIP-seq) ट्रांसक्रिप्शन कारकों (टीएफएस), क्रोमेटिन नियामकों और हिस्टोन संशोधनों के पूरे जीनोम स्थानों के मानचित्रण के लिए एक शक्तिशाली और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली आणविक तकनीक है, साथ ही टीएफ बाध्यकारी पैटर्न और हाईस्टोन पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों को उजागर करने के लिए पूरे जीनोम का पता लगाना है। क्रोमेटिन-संशोधित गतिविधियों, जैसे हिस्टोन मिथाइलेशन, अक्सर विशिष्ट जीन नियामक दृश्यों में भर्ती किए जाते हैं, जिससे क्रोमेटिन संरचनाओं में स्थानीय परिवर्तन होते हैं और जिसके परिणामस्वरूप विशिष्ट प्रतिलेखन प्रभाव होते हैं। चावल विस्फोट दुनिया भर में चावल पर एक विनाशकारी कवक रोग है और कवक संयंत्र बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली है । हालांकि, कैसे हिस्टोन संशोधनों Magnaporthe oryzae में उनके उग्रता जीन को विनियमित में आणविक तंत्र मायावी रहते हैं । अधिक शोधकर्ताओं को यह अध्ययन करने के लिए ChIP-seq का उपयोग करने की आवश्यकता है कि कैसे हिस्टोन एपिजेनेटिक संशोधन उनके लक्षित जीन को नियंत्रित करता है। ChIP-seq भी व्यापक रूप से जानवरों और पौधों में प्रोटीन और डीएनए के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह संयंत्र विकृति के क्षेत्र में कम प्रयोग किया जाता है और अच्छी तरह से विकसित नहीं किया गया है । इस पेपर में, हम एम ओरिज़े में कार्यात्मक लक्ष्य जीन से बांधने वाले हिस्टोन मिथाइलेशन (जैसे एच3के4मे3) के जीनोम-वाइड वितरण की पहचान करने के लिए ChIP-seq की प्रयोगात्मक प्रक्रिया और संचालन विधि का वर्णन करते हैं। यहां, हम हिस्टोन संशोधनों के जीनोम-व्यापी वितरण का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो एम ओरिज़ी और अन्य फिलामेंटस कवक के रोगजनन में नए लक्ष्य जीन की पहचान कर सकता है।
Introduction
एपिजेनेटिक्स आनुवंशिक अनुसंधान की एक शाखा है जो जीन के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को बदले बिना जीन अभिव्यक्ति के वंशानुगत परिवर्तन को संदर्भित करती है। अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चला है कि एपीजेनेटिक विनियमन यूकेरियोटिक कोशिकाओं के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें क्रोमेटिन शामिल है जो तह और असेंबली की गतिशील प्रक्रिया के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को उच्च-क्रम संरचनाओं में नियंत्रित और प्रभावित करता है1,2। क्रोमेटिन रीमॉडलिंग और सहसंयोजक हिस्टोन संशोधन क्रोमेटिन पॉलिमर की भिन्नता के माध्यम से क्रोमेटिन के कार्य और संरचना को प्रभावित और विनियमित करता है,जिससे जीन अभिव्यक्ति3,4,5, 6को विनियमित करने का कार्य प्राप्तहोताहै। हिस्टोन के पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों में एसिटिलेशन, फॉस्फोरिलेशन, मिथाइलेशन, मोनोफिक्विटिनेशन, सूमोइलेशन और एडीपी रिबोसाइलेशन7,8,9शामिल हैं। हिस्टोन एच 3के4 मिथाइलेशन, विशेष रूप से ट्राइमेथाइलेशन को ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइटों पर मैप किया गया है जहां यह यूकेरियोट्स10, 11में ट्रांसक्रिप्शन प्रतिकृति, पुनर्संयोजन, मरम्मत और आरएनए प्रसंस्करण से जुड़ा हुआ है।
2007 में सीआईपी-एसईक्यू तकनीक शुरू की गई थी और यह ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन और एपिजेनेटिक मैकेनिज्म12, 13के जीनोम-वाइड विश्लेषण के लिए प्रायोगिक मानक बन गया है। यह विधि जीनोम-व्यापी पैमाने पर और डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के डीएनए खंडों सहित हिस्टोन या ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर इंटरैक्शन जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है। रुचि के प्रोटीन से क्रॉसलिंक किए गए किसी भी डीएनए दृश्यों को क्रोमेटिन परिसर के एक हिस्से के रूप में सहप्रेषित किया जाएगा । नई पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों का उपयोग डीएनए के 36-100 बीपी को अनुक्रम करने के लिए भी किया जाता है, जो तब इसी लक्ष्य जीनोम से मेल खाते हैं।
फाइटोपैथोजेनिक कवक में, अनुसंधान ने हाल ही में यह अध्ययन करना शुरू कर दिया है कि कैसे हिस्टोन मिथाइलेशन संशोधन रोगजनकता की प्रक्रिया में अपने लक्षित जीन को विनियमित करते हैं। पिछले कुछ अध्ययनों ने साबित कर दिया कि हिस्टोन मिथाइलेज से संबंधित जीन का नियमन मुख्य रूप से जीन चुप्पी और माध्यमिक मेटाबोलाइट्स (एसएम) के उत्पादन को उत्प्रेरित करने में परिलक्षित होता है । MoSet1 एम ओरिज़ा में H3K4 मिथाइलेज है। इस जीन के नॉकआउट के परिणामस्वरूप H3K4me3 संशोधन14को पूरी तरह से हटा दिया जाता है । जंगली प्रकार के तनाव की तुलना में, उत्परिवर्ती में जीन MoCEL7C की अभिव्यक्ति सीएमसी-प्रेरित राज्य में और गैर-प्रेरित राज्य (ग्लूकोज या सेलोबीओज़) में बाधित होती है, MoCEL7C की अभिव्यक्ति15बढ़ गई। फ्यूसरियम ग्रामीणमें, केएमटी6 H3K27me3 के मिथाइलेशन संशोधन को उत्प्रेरित कर सकता है, कवक के सामान्य विकास को विनियमित कर सकता है, और एसएम जीन क्लस्टर16, 17, 18,19वाले "गुप्त जीनोम" को विनियमित करने में मदद कर सकता है। 2013 में, कॉनोली ने बताया कि एच 3के9 और एच 3के27 मिथाइलेशन माध्यमिक मेटाबोलाइट्स और प्रभावकार कारकों के माध्यम से कवक की रोगजनक प्रक्रिया को नियंत्रित करता है जो लक्ष्य जीन20के अवरोध को विनियमित करता है। एस्परगिलसमें हिस्टन एच3के4मे2 और एच3के4मे3 का संशोधन जीन सक्रियण से संबंधित है और एसएम जीन क्लस्टर21के क्रोमेटिन स्तर के नियमन को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एम ओरिज़ामें, Tig1 (खमीर और स्तनधारियों में Tig1 के मुताबिक) एक एचडीसी (हिस्टोन डेसेटिलीज)22है। Tig1 जीन के नॉकआउट शून्य उत्परिवर्ती में रोगजनकता और बीजाणु उत्पादन क्षमता का पूरा नुकसान होता है। यह एक पेरोक्सीजन वातावरण के प्रति अधिक संवेदनशील है, जो संक्रमित हाइफा22का उत्पादन नहीं कर सकता है।
एम ओरिज़ा के कारण चावल का विस्फोट दुनिया में चावल उगाने वाले अधिकांश क्षेत्रों में चावल की सबसे गंभीर बीमारियों में से एकहै। इसकी प्रतिनिधि संक्रमण प्रक्रिया के कारण, एम ओरिज़े कई महत्वपूर्ण रोगजनक कवक की संक्रमण प्रक्रिया के समान है। चूंकि यह आसानी से आणविक आनुवंशिक संचालन कर सकता है, इसलिए कवक-पौधे की बातचीत23का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श जीव बन गया है। एम ओरिज़े की संक्रमण प्रक्रिया के हर कदम को अवरुद्ध करने से असफल संक्रमण हो सकता है। संक्रमण प्रक्रिया के दौरान रूपात्मक परिवर्तन पूरे जीनोम समारोह और जीन प्रतिलेखन द्वारा कड़ाई से विनियमित होते हैं। उनमें से, हिस्टोन मिथाइलेशन जैसे एपिजेनेटिक संशोधन कार्यात्मक जीन24 , 25के प्रतिलेखन नियमन में एक आवश्यक भूमिकानिभातेहैं । हालांकि, अब तक, एम ओरिज़ा में रोगजनन जीन के प्रतिलेखन में हिस्टोन मेथिलेशन और हिस्टोन एसिटिलेशन जैसे एपिजेनेटिक संशोधनों के आणविक तंत्र पर कुछ अध्ययन किए गए हैं। इसलिए, चावल विस्फोट कवक के एपिजेनेटिक विनियमन तंत्र को और विकसित करना, जबकि इन रोगजनक संबंधित जीनों के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम नियामक नेटवर्क पर शोध करने से चावल विस्फोट की रोकथाम और नियंत्रण रणनीतियों को विकसित करने में मदद मिलेगी ।
विशेष रूप से एपिजेनेटिक्स में, चिपिंपी-सेक्यू जैसे कार्यात्मक जीनोमिक्स के विकास के साथ, इस उच्च थ्रूपुट डेटा अधिग्रहण विधि ने गुणसूत्रों पर अनुसंधान में तेजी लाई है। ChIP-seq प्रयोगात्मक प्रौद्योगिकी का उपयोग करके, एम ओरिज़े और अन्य फिलामेंटस कवक में हिस्टोन मेथिलेशन (जैसे एच3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) के जीनोम-वाइड वितरण की पहचान की जा सकती है। इसलिए, यह विधि आणविक तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है कि कैसे एपिजेनेटिक संशोधन पौधे की विकृति में फंगल रोगजनन के दौरान अपने उम्मीदवार लक्ष्य जीन को विनियमित करते हैं।
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Protocol
1. एम ओरिज़े से प्रोटोप्लास्ट की तैयारी
- दलिया तैयार करें- टमाटर आगर (ओटीए)।
- दलिया के 30-50 ग्राम वजन और20मिनट के लिए पानी की 800 एमएल (ddH 2 O) में फोड़ा। धुंध की दो परतों के माध्यम से फ़िल्टर करें और फिलट्रेट लें।
- पके टमाटर उठाओ और उन्हें छील। रस निचोड़ें, और फ़िल्टर किए गए रस के 150 एमएल को इकट्ठा करने के लिए धुंध की दो परतों के माध्यम से फ़िल्टर करें।
- टमाटर का सारा रस और तैयार ओट फिल्ट्रेट को अच्छी तरह मिलाएं और 1000 एमएल तक डीडीएच2ओ डालें।
- ओटीए के 250 एमएल और 2.5 ग्राम एगर पाउडर को 500 एमएल शंकुल फ्लास्क में जोड़ें, और 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करें। 25 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- ऑटोक्लेवेड ओटीए के 25 एमएल को एक ग्लास 5 सेमी x 5 सेमी पेट्री डिश में डालें। कुल इन पेट्री व्यंजनों में से 10 तैयार करें। पेट्री डिश पर ओटीए जम जाने के बाद, व्यंजनों को 25 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा स्टोर करें।
- एम ओरिज़े (जंगली प्रकार के तनाव P131, नॉकआउट उपभेदों 1mobre2, 1mospp1, और Τmoswd2)से माइसीलियम का एक छोटा सा टुकड़ा खोदने के लिए एक निष्फल टूथपिक का उपयोग करें और उन्हें तैयार ओटीए व्यंजनों पर रखें। प्रकाश की स्थिति में 28 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 दिनों के लिए उन्हें संस्कृति।
नोट: प्रदूषण को रोकने के लिए पेट्री डिश को उल्टा करें। - 1000 माइक्रोन पाइपेट का उपयोग करके ओटीए व्यंजनों में तरल पूर्ण माध्यम (सीएम) (0.6% खमीर निकालने, 0.3% एंजाइमेटिक केसिन हाइड्रोलिट, 0.3% अम्लीय कैसिन हाइड्रोलिट, 1% ग्लूकोज) जोड़ें।
नोट: हाइफा 4-6 दिनों के लिए ओटीए व्यंजनों पर बढ़ी। - एक टीका पाश के साथ जंगली प्रकार के तनाव और नॉकआउट तनाव के mycelia परिमार्जन।
- माइसेलिया मलबे को इकट्ठा करें और उन्हें तरल पूर्ण माध्यम (सीएम) के 250 एमएल में स्थानांतरित करें।
- 150 आरपीएम पर मिलाते हुए 36 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर एक त्रिकोणीय फ्लास्क में फंगल मलबे को बढ़ाएं।
- फ़िल्टर और फंगल हाइफाई इकट्ठा करने के लिए एक कीप का उपयोग करें।
- 0.7 एम एनएसीएल समाधान के 500 एमएल के साथ फंगल हाइफा को धोएं।
- फंगल माइसेलियम को इकट्ठा करें और इसका वजन करें।
नोट: माइसेलियम को तौलने से पहले सूखने की जरूरत नहीं है। - फंगल माइसेलियम के 1 ग्राम प्रति लाइसिस एंजाइम परिधि समाधान के ~ 1 एमएल जोड़ें।
- 07 एम एनएसीएल में ट्राइकोडर्मा हर्ज़ियानम से लाइसिस एंजाइम को भंग करके 20 मिलीग्राम/एमएल लाइसिस एंजाइम पर्मेशन समाधान तैयार करें।
- 150 आरपीएम पर मिलाते हुए 3-4 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर lysing के लिए हाइफाई रखें।
- 0.7 एम एनएसीएल समाधान के 50 एमएल के साथ lysed हाइफा को धोएं।
- 2,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए प्रोटोप्लास्ट और सेंट्रलाइज लीजिए।
- अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को सावधानी से त्यागें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.7 एम एनएसीआई बफर के 20 एमएल में प्रोटोप्लास्ट को फिर से रीसस्ट करें।
2. वीवो क्रॉसलिंकिंग और सोनिकेशन में
- 37% फॉर्मलडिहाइड के 55 माइक्रोन जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 1%) तक ड्रॉप करके फॉर्मलडिहाइड ड्रॉप जोड़ें) एनएसीआई बफर के 2 मिलील में क्रॉसलिंकिंग के लिए प्रोटोप्लास्ट युक्त।
- 10 मिनट के लिए प्रोटोप्लास्ट को 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 20x ग्लाइसिन के 20 माइक्रोल को प्रत्येक ट्यूब में जोड़ें ताकि बिना किसी फॉर्मलडिहाइड को बुझाया जा सके।
- 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण और इनक्यूबेट करने के लिए भंवर।
- 2,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
- अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को सावधानी से त्यागें। 0.7 एम NaCI समाधान के 1 ml में गोली को फिर से खर्च करें।
- 2,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
- अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को सावधानी से त्यागें। रिपा बफर के 750 माइक्रोन में गोली को फिर से पेंड करें (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8, 150 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम ईडीटीए पीएच 8, 1% एनपी-40, 0.5% सोडियम डेऑक्सीकोटलेट, 0.1% एसडीएस और प्रोटीज अवरोधक)।
- 20x प्रोटीज अवरोधक के 37.5 माइक्रोन जोड़ें।
- प्रोटोप्लास्ट को पिछले चरण से 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- लगभग 10 मिनट के लिए एक सोनिकेटर के साथ तुरंत सोनीशन (25% डब्ल्यू, आउटपुट 3 एस, स्टॉप 5 एस, 4 डिग्री सेल्सियस) करें। इस कदम का उद्देश्य सबसे अच्छी परिस्थितियों का निर्धारण करने के लिए समय की अवधि के लिए क्रॉस-लिंक्ड लिस्एट को कम करना है।
नोट: इस कदम पर -80 डिग्री सेल्सियस पर lysate जमे हुए किया जा सकता है। - यदि सोनीशन के लिए इष्टतम शर्तों को पहले ही निर्धारित किया जा चुका है, तो अगले चरण पर आगे बढ़ें।
- यदि वांछित है, तो एगर उठे जेल विश्लेषण (अनशीर डीएनए) के लिए प्रोटोप्लास्ट के 5 माइक्रोन निकालें।
- 8 मिनट (25% डब्ल्यू, आउटपुट 3 एस, स्टॉप 5 एस, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए अल्ट्रासोनिक होमोजेनाइजर के साथ सोनीसेशन द्वारा क्रोमेटिन कतरनी।
- नमूना अल्ट्रासोनिक रूप से टूट जाने के बाद, नमूने का एक हिस्सा "इनपुट" के रूप में लें। इनपुट ChIP प्रयोग नहीं करता है और नमूना ध्वनियुक्त होने के बाद जारी सभी डीएनए और प्रोटीन होता है।
- सोनीफिकेशन के बाद, डीएनए टुकड़ों की लंबाई का विश्लेषण करने के लिए 1% एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं।
नोट: एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के परिणाम बताते हैं कि डीएनए के टुकड़े की लंबाई 200-500 बीपी(चित्रा 4)है। - प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए ध्वनियुक्त ट्यूब को बर्फ पर रखें।
- 10,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
- अपकेंद्रित्र के बाद, अपकेंद्री सुपरनेट को एक नए 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और बाद में उपयोग के लिए इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस चरण में प्राप्त क्रोमेटिन समाधान का उपयोग बाद के आईपी के लिए किया जा सकता है।
- आईपी प्रयोग करने से पहले, प्रत्येक क्रोमेटिन नमूने को 1x रिपा बफर के साथ 1:10 के अनुपात में पतला करें (उदाहरण के लिए, क्रोमेटिन नमूने के 10 माइक्रोल को 1×ripa बफर के 1 μL में जोड़ें)।
3. क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन/डीएनए का आईपी
- एक 2 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में सुपरपरामैग्नेटिक प्रोटीन मोतियों के पिपेट 50 माइक्रोन। ट्यूबों को चुंबकीय स्टैंड पर रखें। चुंबकीय मोतियों को वर्षा करने दें। सुपरनिट निकालें।
- ट्यूब में 1x रिपा बफर (बर्फ पर प्री-कूल्ड) का 1 एमएल जोड़ें और तीन बार सुपरपरामैग्नेटिक प्रोटीन मोतियों को धोएं। धोने के बाद ट्यूबों को मैग्नेटिक स्टैंड पर रखें और सुपरनेट निकाल दें। प्रत्येक ट्यूब में 1x रिपा बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें।
- कोरमैटिन नमूने के 300 माइक्रोन जोड़ें (2 x 107 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था), सुपरपरामैग्नेटिक प्रोटीन मोतियों के 100 माइक्रोन और ट्यूब में एच 3K4me3 एंटीबॉडी के 4 माइक्रोन जोड़ें।
- नकारात्मक नियंत्रण के रूप में माउस आईजीजी के साथ नमूनों का उपयोग करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले माउस आईजीजी में 0.01 एम फॉस्फेट बफर और 0.15 एम एनएसीएल शामिल हैं, और 20 डिग्री सेल्सियस से नीचे जमे रहेंगे (सामग्री की तालिकादेखें)। - अच्छी तरह से मिश्रण करने के बाद, नमूनों को रोटरी शेकर पर रखें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस, 30 x ग्रामपर इनक्यूबेट करें।
नोट: इम्यूनोप्रिपिटेशन (आईपी) के इनक्यूबेशन समय को कम करना संभव हो सकता है। इनक्यूबेशन समय विभिन्न कारकों (जैसे, एंटीबॉडी, जीन लक्ष्य, सेल प्रकार, आदि) पर निर्भर करता है और अनुभवजन्य परीक्षण करने की आवश्यकता होगी।
4. आईपी उत्पादों को इकट्ठा करना और धोना
- सुपरपरामैग्नेटिक प्रोटीन मोतियों को चुंबकीय स्टैंड पर रखकर गोली मार दें। अधिष्ठाता को त्यागें और त्यागें।
- 1x रिपा बफर के 1 एमएल में मोतियों को फिर से खर्च करके सुपरपेरामैग्नेटिक प्रोटीन मनका-एंटीबॉडी/क्रोमेटिन कॉम्प्लेक्स को धोएं।
- 5 मिनट के लिए एक रोटरी शेखर पर ट्यूब कुल्ला और 30 x ग्रामपर सुपरनैंट निकालें ।
- कम नमक प्रतिरक्षा परिसर धोने बफर के 1 मिलीएल जोड़ें (0.1% एसडीएस, 1% ट्राइटन एक्स-100, 2 m EDTA, 20 mM Tris-HCl पीएच 8.1, और 150 mM NaCl)।
- 5 मिनट के लिए एक रोटरी शेखर पर ट्यूब कुल्ला और सुपरनैंट निकालें।
- सेंट्रलाइज ट्यूब में हाई सॉल्ट इम्यून कॉम्प्लेक्स वॉश बफर (0.1% एसडीएस, 1% ट्राइटन एक्स-100, 2 एमएम ईडीटीए, 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.1, और 500 mM NaCl) का 1 एमएल जोड़ें।
- ट्यूब को 5 मिनट के लिए रोटरी शेकर पर रखें और सुपरनेट निकालें।
- सेंट्रलाइज ट्यूब में एलसीएल (0.25 एम एलआईसीएल, 1% एनपी-40, 1% डिऑक्सीकोलिक एसिड, 1 एमएम ईडीटीए, और 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.1) के साथ कुल्ला।
- ट्यूब को 5 मिनट के लिए रोटरी शेकर पर रखें और सुपरनेट निकालें।
- 0.25 एम एलसीआई बफर के 1 एमसीएल के साथ फिर से टेस्ट ट्यूब कुल्ला, एक पिपेट के साथ सुपरनैट्ट को हटा दें, और फिर सुपरनेट को त्याग दें।
- ते बफर के 1 एमसीएल जोड़ें (10 mM Tris-HCl pH 8.1, 1 m EDTA)।
- 30 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए एक रोटरी शेखर पर ट्यूब रखें ।
- ट्यूब को फिर से 1 एमएल टीई बफर से धोएं और एक पिपेट के साथ सुपरनेट निकालें।
- मोतियों को इकट्ठा करें।
5. प्रोटीन/डीएनए परिसरों का उन्मूलन
- सभी आईपी और इनपुट ट्यूब के लिए एल्यूशन बफर (20% एसडीएस के 10 माइक्रोन, 1 एम एनएएचसीओ3के20माइक्रोन, बाँझ आसुत एच 2 ओ के 170 माइक्रोन) तैयार करें।
- प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब में 100 μl एल्यूशन बफर जोड़ें।
- 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर Elution।
- 10,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को नई सेंट्रलाइज ट्यूब्स में इकट्ठा करें।
- चरण 5.2 - 5.4 दोहराएं और एलुट्स को मिलाएं। इनपुट डीएनए के 10 माइक्रोन में 190 μL एल्यूशन बफर जोड़ें। (कुल मात्रा = 200 माइक्रोन)।
6. प्रोटीन/डीएनए परिसरों की रिवर्स क्रॉसलिंकिंग
- डीएनए-प्रोटीन क्रॉसलिंक को रिवर्स करने के लिए सभी ट्यूबों में 5 एम एनएसीएल का 8 माइक्रोन जोड़ें और 4-5 घंटे या रात भर के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: इस चरण के बाद, नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और यदि आवश्यक हो तो अगले दिन प्रोटोकॉल जारी रखें। - 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए RNase A और इनक्यूबेट के 1 माइक्रोल जोड़ें।
- प्रत्येक ट्यूब में 4 माइक्रोनल प्रोटीनेज के (एच2ओ में भंग और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) जोड़ें और 1-2 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
7. शुद्धि और डीएनए की वसूली
- अपकेंद्रित्र ट्यूब में फिनोल/क्लोरोफॉर्म/आइसोअमिल अल्कोहल मिश्रण (25:24:1 का अनुपात) का 550 माइक्रोल जोड़ें।
- मिश्रण को 1 मिनट तक अच्छी तरह से भंवर से रखें।
- 10,000 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
- निकाले गए सुपरनेट को पिछले चरण से एक नए 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- ट्यूब में 3 एम सोडियम एसीटेट समाधान की 1/10 मात्रा, पूर्ण इथेनॉल की 2.5 मात्रा, और ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम/एमएल) की 3 माइक्रोल जोड़ें।
- वर्षा के लिए रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर में नमूना रखें।
- 10,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
- अपकेंद्रित्र के बाद सुपरनेट को त्याग दें। 10,000 x ग्राम पर 75% इथेनॉल (ताजा तैयार करने की आवश्यकता) के 1 मिलील के साथ तीन बार गोली धोएं।
- शराब को सूखने देने के लिए धुले हुए वर्षा को एक साफ बेंच पर रखें।
- 50 μL बाँझ deionized एच2ओ जोड़ने के लिए पर्याप्त रूप से तेज़ भंग।
- डीएनए टुकड़े करने के लिए अनुक्रमण एडाप्टर लिगेट और डीएनए अनुक्रम करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट अनुक्रम मंच का उपयोग करें ।
8. डीएनए मरम्मत और Solexa पुस्तकालय निर्माण
- डीएनए की मरम्मत डीएनए एंड-रिपेयर किट (1-34 माइक्रोन डीएनए, 10x एंड-रिपेयर बफर के 5 माइक्रोन, 2.5 mm प्रत्येक डीएनटीपी के 5 माइक्रोन, 10 mM एटीपी के 5 माइक्रोन, एंड-रिपेयर एंजाइम मिक्स के 1 माइक्रोन, और एच2ओ का उपयोग करके कुंद-समाप्त डीएनए उत्पन्न करने के लिए समाप्त होता है)।
- डीएनए को शुद्ध करने के लिए पीसीआर शुद्धिकरण किट या फिनॉल का उपयोग करें: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण। एल्यूट या 1x TE पीएच 7.4 के 30 माइक्रोल में डीएनए को फिर से रीस करें।
- 3 ' सिरों में "ए" जोड़ें (चरण 2 से डीएनए का 30 माइक्रोन, एच 2 ओ का2माइक्रोन, 10x ताक़ बफर का 5 माइक्रोन, 1 m dATP का 10 माइक्रोन, और Taq डीएनए बहुलक के 3 माइक्रोन) । रिएजेंट्स को 0.2 एमएल पीसीआर सेंट्रलाइज ट्यूब में जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर मशीन में प्रतिक्रिया करें।
- डीएनए के 10 माइक्रोन, एच2ओ के 9.9 माइक्रोन, टी 4 डीएनए लिगाज़ बफर के 2.5 माइक्रोन, एडाप्टर ओलिगो मिक्स के 0.1 माइक्रोन और टी4 डीएनए लिगाज़ के 2.5 माइक्रोन को मिलाकर लिंकर लिगेशन करें। रिएजेंट्स को 0.2 एमएल पीसीआर सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें और अच्छी तरह से मिलाएं। उन्हें 4 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करें। एल्यूशन बफर के 20-25 माइक्रोन के साथ Elute।
- डीएनए पुस्तकालय की स्थापना से पहले, बाद के अनुक्रमण प्रयोगों के लिए इसके उपयोग की पुष्टि करने के लिए शुद्ध डीएनए की एकाग्रता की पहचान करें।
- फ्लोरोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता का पता लगाएं। बर्फ पर सैंपल पिघलने के बाद इसे अच्छी तरह से मिलाएं और 1000 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए सेंट्रलाइज करें। फिर नमूना की एक उचित मात्रा में ले और 260 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ एक फ्लोरोमीटर में इसे मापने।
- अनुक्रमण के लिए Illumina अनुक्रमण मंच पर योग्य गुणवत्ता और एकाग्रता के साथ डीएनए नमूने रखें।
- अनुक्रमण से पहले, पीसीआर प्राइमर, पीई 1.0 और पीई 2.0, और 2x उच्च निष्ठा मास्टर मिश्रण (डीएनए के 10.5 माइक्रोन, 2x उच्च निष्ठा मास्टर मिश्रण के 12.5 माइक्रोन, पीसीआर प्राइमर PE1.0 के 1 माइक्रोन, और पीसीआर प्राइमर पीईआर के 1 μL) का उपयोग करके डीएनए को बढ़ाना। रिएजेंट्स को 0.2 एमएल पीसीआर सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें और अच्छी तरह से मिलाएं।
- पीसीआर मशीन में पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस प्रीडेटेरेशन; फिर 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 15 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, 5 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार। अंत में, प्रतिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- क्लस्टर पीढ़ी के लिए डीएनए का उपयोग करें और एक Illumina Hiseq 2000 पर अनुक्रमण-द्वारा संश्लेषण करते हैं।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, इलुमिना प्रवाह कोशिकाओं का उपयोग क्लस्टर पीढ़ी के लिए किया जाता था। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक इलुमिना जीनोम एनालाइजर पर अनुक्रमण-बाय-संश्लेषण किया गया था।
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Representative Results
चिप-सेक्यू विधि का पूरा प्रवाह चार्ट चित्र 1में दिखाया गया है। चिप-सेक्यू प्रयोग जंगली प्रकार के तनाव P131 में H3K4me3 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके किए गए थे और तीन शून्य उत्परिवर्ती उपभेद जो मोबरे2, mospp1और moswd2 जीन से रहित थे, जो एम ओरिज़ेमें हिस्टोन एच 3K4me3 वितरण के पूरे जीनोम-वाइड प्रोफाइल को सत्यापित करने के लिए थे। जंगली प्रकार के तनाव के प्रोटोप्लास्ट, 4 डिग्रीसेल्सियसपर25%डब्ल्यू, आउटपुट 3 एस, स्टॉप 5 एस पर तैयार और ध्वनिकृत किए गए थे। इसके अलावा, क्रोमेटिन को H3K4me3 एंटीबॉडी और डायनेबएड प्रोटीन ए/जी के साथ इम्यूनोपुरिफाइड किया गया था । बाद में, डीएनए के टुकड़ों को अनुक्रमण पुस्तकालय के निर्माण के लिए फिनोल-क्लोरोफॉर्म विधि का उपयोग करके निकाला गया और एक उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण मंच पर एकल सिरों के साथ अनुक्रमित किया गया।
एच3K4me3 एंटीबॉडी का उपयोग करके चिप-सेक्यू विधि के साथ जंगली प्रकार, एमोबरे2,एmospp1,और 1moswd2 उपभेदों के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2में दिखाए गए हैं। इसके कार्यात्मक लक्ष्य क्षेत्रों मेंएम़ायर 2,1mospp1और 1moswd2 हटाने वाले म्यूटेंट के H3K4me3 संकेतों में काफी कमी आई थी। जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, MGG_14897, MGG_04237, MGG_04236 और MGG_04235 सहित कुछ चयनित उम्मीदवार लक्ष्य जीन को H3K4me3 वितरण के लिए मैप किया गया था। जंगली प्रकार के तनाव P131 की तुलना में, समृद्ध H3K4me3-ChIP-seq के संकेतों को Τmobre2 में पढ़ता है, 1mospp1,औरmoswd2 हटाने म्यूटेंट काफी हद तक कम हो गए थे(चित्रा 2)26। इन परिणामों से पता चलता है कि H3K4me3 संशोधन एम oryzae में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।
चित्रा 1। एम ओरिजे में चिप-सेक्यू विधि का प्रवाह चार्ट। (क) एम ओरिज़ा के जीनोमिक डीएनए को 1% फॉर्मलडिहाइडके साथ क्रॉसलिंक किया गया था । (ख) Lysed ब्लास्ट कवक कोशिकाओं, टूटे डीएनए, मुक्त डीएनए, और हिस्टोन बाध्यकारी डीएनए बाद में प्राप्त किया गया । (ग) डीएनए के टुकड़े हिस्टन से बंधे होते हैं और एच3के4मे3 एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट बाध्यकारी द्वारा निकाले गए थे । (घ) रिवर्स क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से, शुद्ध डीएनए ने बाद में H3K4me3 हियोंटोन द्वारा संशोधित डीएनए के टुकड़े प्राप्त किए । (ई-एफ) डीएनए के टुकड़ों को अनुक्रमित किया गया, अनुक्रमण परिणामों की तुलना की गई, और एम ओरिज़े डीएनए समूह में दृश्यों की पहचान की गई । (जी) एम ओरिज़ा में एच3के4मे3 हिकटोन के विशिष्ट जीन और लोकी को पुनः प्राप्त किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। इसके बाद से हीउनकेलक्षित क्षेत्रों में एच3K4me3 प्रोफाइल में काफी कमी आई है। 3K4me3-ChIP-seq में छा जीन के कोडिंग क्षेत्रों के आसपास समृद्ध चोटियों के वितरण,Τ.mospp1, औरmoswd2 हटाने म्यूटेंट MGG_14897,MGG_04237, MGG_04236 और MGG_04235 जीन26में जंगली प्रकार के तनाव की तुलना में decresased हैं । WT (इनपुट) में संख्या [0-2074] के रूप में लेबल का अर्थ है जीनोमिक डीएनए [0-2074] की सीमा में ChIP के परिणाम । [0-2074] गुणसूत्र 6 के 0-2074bp को संदर्भित करता है । यह आंकड़ा अनुक्रमण परिणामों का एक यादृच्छिक चयन दिखाता है, जो केवल गुणसूत्र 6 पर डीएनए वितरण का प्रतिनिधित्व करता है । पूरा अनुक्रमण परिणाम जेनबैंक को प्रस्तुत किया गया है । (https//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/परिग्रहण 649321) 26. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| सीरियल नंबर | नमूना नाम | नमूना अनुक्रम संख्या | ट्यूबों की संख्या | कुल (μg) | खंड वितरण | डेटाबेस प्रकार | टिप्पणियां | ||||
| 1 | निवेश | WH1703004169 | 1 | 2.7948 | मुख्य चोटी 100bp से नीचे है, लेकिन 100bp-500bp के बीच डीएनए वितरण है | सीआईपी-सेक्यू | टुकड़ा बहुत छोटा है | ||||
| P131 (2) | |||||||||||
| 2 | निवेश | WH1703004170 | 1 | 2.4748 | मुख्य चोटी 100bp से नीचे है, लेकिन 100bp-500bp के बीच डीएनए वितरण है | सीआईपी-सेक्यू | टुकड़ा बहुत छोटा है | ||||
| इसके बाद 2014 में 3 | |||||||||||
| 3 | इनपुट 1 (4) | WH1703004171 | 1 | 3.22 | मुख्य चोटी 100bp से नीचे है, लेकिन 100bp-500bp के बीच डीएनए वितरण है | सीआईपी-सेक्यू | टुकड़ा बहुत छोटा है | ||||
| 4 | इनपुट 1000 (5) | WH1703004172 | 1 | 3.97 | मुख्य चोटी 100bp से नीचे है, लेकिन 100bp-500bp के बीच डीएनए वितरण है | सीआईपी-सेक्यू | टुकड़ा बहुत छोटा है | ||||
| 5 | P131 (2) | WH1703004174 | 1 | 0.0735 | मुख्य चोटी 100bp-500bp के बीच है | सीआईपी-सेक्यू | |||||
| 6 | इसके बाद 2014 में 3 | WH1703004175 | 1 | 0.0491 | मुख्य चोटी 100bp-500bp के बीच है | सीआईपी-सेक्यू | |||||
| 7 | इसके बाद 101000 | WH1703004176 | 1 | 0.0288 | मुख्य चोटी 100bp-500bp के बीच है | सीआईपी-सेक्यू | |||||
| 8 | 5 | WH1703004177 | 1 | 0.0527 | मुख्य चोटी 100bp-500bp के बीच है | सीआईपी-सेक्यू | |||||
तालिका 1. इस प्रयोग में डीएनए की कुल मात्रा। इनपुट P131 (2) की कुल राशि 2.7948 माइक्रोन है, कुल मात्रा मेंमोबरे2(3) (इनपुट) 2.4748 माइक्रोन है, 1mospp1(4) (इनपुट) की कुल राशि 3.22 माइक्रोन है, 3.97 माइक्रोग्राम (इनपुट) की कुल राशि 3.97 माइक्रोन है, और P131 (2) की कुल राशि 0.0735μg है,10.0491μg की कुल राशि, 0.0491μg है। 1mospp1(4) की कुल राशि 0.0288 माइक्रोन है,0.0527 माइक्रोग्राम की कुल राशि 0.0527 माइक्रोन है।
चित्रा 3। अल्ट्रासाउंड के बाद डीएनए का इलेक्ट्रोफोरेसिस डिटेक्शन। अल्ट्रासाउंड सोनीफिकेशन के बाद, डीएनए को डीएनए के टुकड़ों की लंबाई का विश्लेषण करने के लिए 1% एगर उठे जेल प्रयोग के अधीन किया जाता है। सोनिकेटेड डीएनए टुकड़े की लंबाई 200-500 बीपी से है, और इन डीएनए टुकड़ों का उपयोग ChIP-seq के निम्नलिखित चरणों के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4। इनपुट और ChIP नमूनों का बायोएनालाइजर ट्रेस। आंकड़ा प्रत्येक नमूने के टुकड़े वितरण से पता चलता है, जहां abscissa टुकड़ा आकार का प्रतिनिधित्व करता है, और समन्वय चोटी के आकार का प्रतिनिधित्व करता है । बायोएनालाइजर पर चल रहे नमूने इनपुट P131 (2), 1.mobre2(3) (इनपुट), 1mospp1(4) (इनपुट),131(5) (इनपुट), P131 (2), 131(2), 131 (2), 1mospp1(4), एकmoswd(5) हैं । इनमें से इनपुट P131 (2),100-3) (इनपुट), 1mospp1(4) (इनपुट),100बीपी से नीचे मुख्य चोटी का पता चलता है, लेकिन 100-500 बीपी पर डीएनए वितरण होता है। P131 (2), Τmobre2(3), Τmospp1(4), और 1moswd2(5) का सही वितरण मुख्य चोटी26के रूप में 100-500 बीपी के बीच है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हाल ही में, ChIP-seq विशिष्ट हिस्टोन द्वारा संशोधित टीएफएस या संवर्धन साइटों की बाध्यकारी साइटों का निर्धारण करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला जीनोमिक विश्लेषण विधि बन गया है। पिछली ChIP-seq तकनीक की तुलना में, नई ChIP-seq प्रौद्योगिकी अत्यधिक संवेदनशील और लचीला है । परिणाम नकारात्मक प्रभाव के बिना उच्च संकल्प में प्रदान किए जाते हैं, जैसे कि न्यूक्लिक एसिड के गैर-विशिष्ट संकरण के कारण शोर संकेत। हालांकि यह एक आम जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण है, कई कम्प्यूटेशनल तरीकों को मान्य किया गया है, और शोर और परिवर्तनशीलता के मामले में ChIP-seq डेटा की जटिलता इस समस्या को विशेष रूप से मुश्किल बना देती है ChIP-seq को दूर करने के लिए । डेटा विश्लेषण के संदर्भ में, सीआईपी-एसईक्यू प्रयोगों द्वारा उत्पन्न बड़ी मात्रा में डेटा का प्रबंधन और विश्लेषण करना भी एक चुनौती है जिसे अभी तक पर्याप्त रूप से संबोधित किया जाना है ।
ChIP-seq प्रयोग में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, प्रोटोप्लास्ट की तैयारी बहुत महत्वपूर्ण है। पतन के समय को नियंत्रित करना आवश्यक है ताकि उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटोप्लास्ट एकत्र किए जा सकें। अल्ट्रासाउंड भी बहुत महत्वपूर्ण है, अल्ट्रासाउंड समय को नियंत्रित किया जाना चाहिए, बहुत लंबा या बहुत कम काम नहीं करेगा। दूसरे, प्रोटीन से बांधने वाले अधिक डीएनए टुकड़ों के संवर्धन को सुगम बनाने के लिए एंटीबॉडी की मात्रा पर्याप्त होनी चाहिए । सीआईपी-सेक्यू प्रयोग कुबिट फ्लोरोमीटर में उपजी डीएनए की गुणवत्ता और मात्रा की पुष्टि करते समय इसका उपयोग किया गया था। फुर्तीला 2100 का उपयोग डीएनए के बड़े पैमाने पर एकाग्रता और खंड वितरण का पता लगाने के लिए किया गया था, जो इस बात का आधार प्रदान करता है कि नमूने का उपयोग बाद के पुस्तकालय प्रतिष्ठान और अनुक्रमण प्रयोगों के लिए किया जा सकता है या नहीं।
कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल रोगजनक संक्रमण के दौरान रोगजनक जीन को विनियमित करने वाले एपिजेनेटिक संशोधनों के पूरे जीनोम-व्यापी वितरण की समझ को बढ़ाता है। यह विधि एपिजेनेटिक संशोधनों के आणविक तंत्र की पहचान करने और एम ओरिज़ा और अन्य फिलामेंटस कवक में कवक विकास और रोगजनक-प्रेरित रोगजनकों के दौरान नए लक्ष्य जीन की पहचान करने में योगदान देगी।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर 31871638), बीजिंग एग्रीकल्चर यूनिवर्सिटी (YQ201603), बीजिंग एजुकेशनल कमिटी (KM201610020005) की वैज्ञानिक परियोजना, बीयूए (GJB2021005) की उच्च स्तरीय वैज्ञानिक अनुसंधान खेती परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
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