Summary
ويصف البروتوكول المحدد إجراءات إنتاج مجمع بروتين المجال الملزم لمستقبلات HiBiT وتطبيقه للكشف السريع والحساس عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2.
Abstract
وقد أدى ظهور وباء COVID-19 إلى زيادة الحاجة إلى طرق أفضل للكشف المصلي لتحديد الأثر الوبائي للفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (سارس-كوف-2). ويثير العدد المتزايد من الإصابات بالسارس-CoV-2 الحاجة إلى فحوصات أفضل للكشف عن الأجسام المضادة. طرق الكشف عن الأجسام المضادة الحالية تهدد الحساسية للسرعة أو حساسة ولكنها تستغرق وقتا طويلا. وتستهدف نسبة كبيرة من الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 المجال الملزم للمستقبلات، وهو أحد المقصورات المناعية الأولية للسارس-كوف-2. لقد قمنا مؤخرا بتصميم وتطوير نظام RBD شديد الحساسية وموسوم بيومونسنت (NanoLuc HiBiT-RBD) للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2. يصف النص التالي الإجراء لإنتاج مجمع HiBiT-RBD وإجراء تقييم سريع لتقييم وجود الأجسام المضادة المستهدفة RBD باستخدام هذه الأداة. ونظرا لمتانة منتج بروتين HiBiT-RBD على مدى مجموعة واسعة من درجات الحرارة والإجراءات التجريبية الأقصر التي يمكن إكمالها في غضون ساعة واحدة، يمكن اعتبار البروتوكول بديلا أكثر كفاءة للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 في عينات مصل المريض.
Introduction
وقد تسبب ظهور فيروس كورونا الجديد، سارس-CoV21، في وفاة أكثر من 2,800,000 شخص و128 مليون إصابة حتى 30 مارس 2022. ونظرا لعدم وجود إجراءات علاج موثوقة وراسخة للعلاجات السريرية للسارس-CoV-2، بذلت العديد من الجهود لتقييد المزيد من انتقال الفيروس، والأهم من ذلك، تطوير علاج فعال وقوي أو لقاح3. حتى الآن، هناك أكثر من 50 مرشحا للقاح COVID-19 في التجارب التي أبلغت عنها منظمة الصحة العالمية4. يعد اكتشاف الأجسام المضادة ضد السارس - فيروس نقص الفيروس - 2 ذا أهمية قصوى لتحديد الاستقرار طويل الأجل للاستجابة الفكاهية عند إعطاء اللقاح وكذلك في المرضى الذين تم انتشالهم من COVID-195. وقد اثبتت بعض الدراسات ان هناك امكانية ان يفقد المرضى الذين تم انتشالهم من السارس - كو فى - 2 معظم الاجسام المضادة الملزمة للسارب بعد عام واحد ، وهو 6،7، 8،9 . ويلزم إجراء مزيد من التحقيقات من أجل فهم أفضل للمناعة الدائمة، ويمكن لمنصات الكشف عن الأجسام المضادة الأكثر حساسية أن تساعد في زيادة هذا العمل. كما أن التقارير عن استمرار مناعة العدوى الخفيفة بالسارس-CoV-2، والتي تشير إلى استجابات طويلة الأجل للأجسام المضادة، هي أيضا مجال مثير للاهتمام وجدير بالاهتمام للدراسة. طريقة سريعة ودقيقة للكشف أمر ضروري لرصد الأجسام المضادة في سيرا الأفراد لتوفير المزيد من المعلومات حول الحصانة في السكان.
مثل الفيروسات التاجية الأخرى، يستخدم السارس-CoV-2 بروتين الجليكوبروتين البارز لربط الإنزيم-2 المحول لأنجيوتنسين (ACE2) لبدء سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى دمج أغشية الفيروسات والخلايا6,7. وقد أثبتت العديد من الدراسات مؤخرا RBD من بروتين سبايك أن يكون لها دور حاسم في الحصول على استجابة قوية ومحددة للأجسام المضادة ضد السارس-CoV28,9,10,11. وعلى وجه الخصوص، فإن الارتباطات التي لاحظها بريمكومار وآخرون بين تأليه الأجسام المضادة الملزمة لل RBD وفعالية تحييد السارس-CoV-2 في بلازما المرضى تتسق مع كون RBD حجرة مناعية لهيكل الفيروس9. ومع وضع ذلك في الاعتبار، فإن العديد من الاختبارات التشخيصية المتاحة للكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 هي اختبارات تستغرق وقتا طويلا وكثيفة التكلفة، وتتطلب إجراء طويلا للحضانة والغسيل (فحص مناعة مرتبط بالإنزيم [ELISA])، أو تفتقر إلى الحساسية والدقة (الفحص المناعي للتدفق الجانبي [LFIA])12. ولذلك، فإن الطريقة الكمية والسريعة التكميلية للكشف عن الأجسام المضادة المشتقة من COVID-19 مع حساسية عالية واستجابة سريعة وتكلفة منخفضة نسبيا من شأنها أن تخدم الحاجة إلى اختبار مصلي موثوق به للمراقبة الوبائية سارس-كوف-2.
وقد أدت القيود المفروضة على المقايسات المصلية الحالية مجتمعة إلى إجراء تحقيق في نظام الإبلاغ عن الإنارة الحيوية كعامل تشخيصي محتمل في عمليات التحري المصلي في المستقبل. الإضاءة الحيوية هي تفاعل إنزيم/ركيزة طبيعي، مع انبعاث الضوء. Nanoluc luciferase هو أصغر (19 كيلودا) ، ومع ذلك ألمع نظام مقارنة رينيلا واليراع لوسيفيراز (36 كدا و 61 كدا ، على التوالي)13،14. علاوة على ذلك ، Nanoluc لديه أعلى نسبة إشارة إلى الضوضاء والاستقرار بين الأنظمة المذكورة سابقا. تدعم كثافة الإشارة العالية ل Nanoluc اكتشاف كميات منخفضة جدا من اندماج المراسلين15. تقنية Nanoluc الثنائية (NanoBiT) هي نسخة مقسمة من نظام Nanoluc ، والتي تتألف من جزأين: BiT الصغيرة (11 حمض أميني؛ ثنائية الأحماض الصغيرة (11 حمض أميني؛ 1998). SmBiT) وBiT كبيرة (LgBiT) مع التفاعلات منخفضة نسبيا تقارب (دينار كويتي = 190 ميكرومتر) لتشكيل مجمع الإنارة16. يستخدم NanoBiT على نطاق واسع في دراسات مختلفة تنطوي على تحديد التفاعلات البروتين البروتين15,17,18,19 ومسارات الإشارات الخلوية11,20,21.
في الآونة الأخيرة ، تم تقديم ببتيد صغير آخر مع تقارب أعلى بشكل واضح إلى LgBiT (KD = 0.7 nM) ، وهو نظام HiBiT Nano-Glo ، بدلا من SmBiT. تقارب عالية وإشارة قوية من نانو غلو "إضافة مزيج قراءة" المقايسة يجعل HiBiT مناسبة، كمية، علامة الببتيد الإنارة. في هذا النهج ، يتم إلحاق علامة HiBiT بالبروتين المستهدف من خلال تطوير بناء يفرض الحد الأدنى من التداخل الهيكلي. ومن شأن اندماج بروتين HiBiT أن يرتبط بنشاط بنظيره LgBiT، وينتج إنزيم لوسيفيراز نشط للغاية لتوليد الإضاءة الحيوية القابلة للكشف في وجود كاشفات الكشف (الشكل 1). وبالمثل، قمنا بتطوير نظام قائم على HiBiT Nano-Glo لقياس تاتر الأجسام المضادة المحايدة بسهولة في سيرا الأفراد المتعافين من السارس-CoV-2 وطورنا مؤخرا جهازا موسوما بالسارس-CoV-2 RBD. تصف هذه الورقة بروتوكول إنتاج التقرير الحيوي HiBiT-RBD باستخدام الإجراءات والمعدات المختبرية القياسية، وتبين كيف يمكن استخدام هذا المبلغ الحيوي في فحص سريع وفعال للكشف عن الأجسام المضادة المستهدفة بالسارس-CoV-2 RBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: البروتوكول الموضح أدناه يلتزم بكافة إرشادات الأخلاقيات وفقا لمدونة البروتوكول 20200371-01H.
1. إنتاج وتقييم HiBiT-RBD التقرير البيولوجي
- إنتاج كمية كافية من HiBiT-RBD المبلغ الحيوي
- الاستعداد لثقافة الخلايا
- إعداد كامل دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنين و 1٪ البنسلين / العقدية. ثم، دافئة وسائل الإعلام في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- تشغيل خزانة السلامة البيولوجية (BSC) واستخدام الإيثانول 70٪ v/v لتعقيم سطح الخزانة.
- ثقافة خط الخلية.
- أخرج خط الخلية من -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل، وذابه في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظة: خط الخلية المناسبة من السهل الحفاظ عليها في الثقافة، وكفاءة عالية في العدوى، ومناسبة لإنتاج البروتين الخارجي. الكلى الجنينية البشرية، تم استخدام خلايا HEK293 لهذا البروتوكول. - خلط الخلايا المذابة مع ما لا يقل عن 10 مل من المتوسطة كاملة، ماصة تعليق الخلية إلى طبق بيتري 10 سم، ودوامة لوحة لتوزيع الخلايا في الطبق بشكل موحد. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 ورطوبة 85-95٪.
- مراقبة الخلايا تحت المجهر حتى يصل مستوى الالتقاء إلى 80-90٪. عند التقاء عالية، وإزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مع المالحة الدافئة الفوسفات العازلة (PBS)، وإضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين-إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك لفصل الخلايا من السطح.
ملاحظة: يتم فصل خلايا HEK293 بسهولة إلى حد ما. وبالتالي، ينبغي أن يتم خطوة الغسيل بلطف شديد لمنع انفصال عرضي وفقدان الخلايا. - بعد ما يقرب من 5 دقائق، ننظر في الخلايا تحت المجهر. إذا كانت جميع الخلايا عائمة، أضف ما لا يقل عن 4 مل من المتوسط، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم جديد. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم، وإضافة 1 × 106 خلايا في كل بئر من لوحة 6-جيدا لtransfection.
ملاحظة: بعد 24 ساعة، يجب أن تكون الخلايا في التقاء 80٪ أو أكثر.
- أخرج خط الخلية من -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل، وذابه في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إصابة بلازميد HiBiT-RBD
- استخدام 1 ميكروغرام من HiBiT-RBD التعبير البلازميد مع كاشف transfection مناسبة. احتضان لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم إضافة الحجم الإجمالي إلى كل بئر من لوحة، قطرة الحكمة.
ملاحظة: اتبع بروتوكول العدوى الشركة المصنعة. في هذه الحالة، أضيف خليط (كمية محددة) من كاشف العدوى مع DMEM إلى البلازميد المخفف (1 ميكروغرام) في DMEM (انظر جدول المواد). استخدم علامة تحتوي على (على سبيل المثال، البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) البلازميد كعنصر تحكم لمراقبة كفاءة العدوى. - في اليوم التالي، استبدل الوسط الذي يحتوي على خليط العدوى بمتوسط كامل. مراقبة التحكم في العدوى جيدا 48 ساعة بعد transfection.
ملاحظة: إذا كان التحويل إيجابيا وفعالا (أكثر من 80٪ من GFP-positive)، فيجب أن تكون الخلايا جاهزة لحصاد المبلغ الحيوي HiBiT-RBD. يحتوي البناء أيضا على علامة له ، والتي يمكن استخدامها للحصول على البروتين النقي بدلا من الناسخ الكلي. - جمع supernatant في 1.5 مل الأنابيب الدقيقة. إضافة 500 ميكرولتر من 1x تحلل السلبي المخزن المؤقت (PLB) إلى الخلايا; احتضان ويهز لوحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحلل الخلية.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على supernatant والحل lysate عند -20 درجة مئوية مع فقدان بسيط للنزاهة لمدة 6 أشهر على الأقل. وفقا ل Azad et al.22، فإن المراسل مستقر في نطاق واسع من درجة الحموضة (4-12) ودرجة الحرارة (4-42 درجة مئوية).
- استخدام 1 ميكروغرام من HiBiT-RBD التعبير البلازميد مع كاشف transfection مناسبة. احتضان لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم إضافة الحجم الإجمالي إلى كل بئر من لوحة، قطرة الحكمة.
- الاستعداد لثقافة الخلايا
- تقييم الإشارة الإنارة من المبلغ البيولوجي بواسطة المقايسة لوسيفيراز
- إعداد مكونات التفاعل
- استخدام supernatant كمصدر لbioreporter.
ملاحظة: يحتوي كل من supernatant و lysate على التقرير الحيوي HiBiT-RBD ويمكن استخدامه في الفحص. ومع ذلك ، يوصى بالناسخ الخارق كمصدر لأسباب موضحة في الملاحظات التالية. - تمييع LgBiT والركيزة إلى 1x قبل الاستخدام (تركيز المخزون هو 100x).
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول LgBiT.
- استخدام supernatant كمصدر لbioreporter.
- فحص لوسيفراز
- نقل 50 ميكرولتر من supernatant من كل بئر أو أنبوب إلى لوحة 96 جيدا، وإضافة 50 ميكروغرام من LgBiT 1x إلى كل بئر. حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- افتح برنامج قياس اللمعان، وأضف 50 ميكرولتر من الركيزة 1x (furimazine) إلى كل بئر، وضع اللوحة في مقياس الإنارة، وتشغيل البرنامج.
ملاحظة: أضف الركيزة مباشرة قبل قراءة اللوحة لمنع استهلاك الركيزة بواسطة الإنزيمات النشطة قبل قياس الإشارة.
- إعداد مكونات التفاعل
2. الكشف عن الأجسام المضادة RBD مع سريع وحساسة المقايسة
- HiBiT-RBD فحص الكشف عن الأجسام المضادة
- إعداد التقرير الحيوي HiBiT-RBD كما هو موضح في القسم 1.1 من البروتوكول.
ملاحظة : من المستحسن استخدام supernatant للمقايسة التالية كما هو أبسط لجمع ويحتوي على نسخة جليكوسيلاتed ناضجة من البروتين. وعلاوة على ذلك، فإن ليسات لديها العديد من البروتينات الأخرى التي يمكن أن تتداخل مع التفاعل HiBiT-RBD-الأجسام المضادة. - الجمع بين 50 ميكرولتر من الناتات المحتوية على HiBiT-RBD مع 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة التجارية سارس-CoV-2-RBD في الأنابيب الدقيقة 1.5 مل. أضف 20 ميكرولتر من البروتين المناعي الملزم للغلوبولين (البروتين G) إلى المحلول. رفع إجمالي حجم إلى 300 ميكرولتر عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يمكن تخفيض الحجم الإجمالي للخليط إلى 150 ميكرولتر. لا يوصى بكميات إجمالية أقل لأنه يمكن أن يؤدي إلى خلط غير كاف للأجسام المضادة مع المبلغ الحيوي. - احتضان أنبوب (ق) على أنبوب شاكر أو الدوار لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي في 12,000 × غرام لمدة 30 s, تجاهل supernatant, ويغسل مع برنامج تلفزيوني. كرر العملية ثلاث مرات لإزالة HiBiT-RBD مجانا. Resuspend في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى لوحة 96 جيدا.
- إضافة 50 ميكرولتر من LgBiT 1x وانتظر لمدة 5 دقائق. ثم، إضافة 50 ميكرولتر من 1x ركيزة نانولوك. اقرأ على الفور إشارة الإنارة مع مقياس الإنارة.
- إعداد التقرير الحيوي HiBiT-RBD كما هو موضح في القسم 1.1 من البروتوكول.
3. الكشف عن الإنتاجية العالية للأجسام المضادة الخاصة بالسارس-CoV-2 من عينات مصل المريض
- إعداد كميات أكبر من HiBiT-RBD تقرير حيوي لإجراء فحص الإنتاجية العالية باتباع المقطع 1.1 من البروتوكول.
- الجمع بين 20 ميكرولتر من البروتين المغناطيسي G مع 50 ميكرولتر من HiBiT-RBD supernatant في بئر من 96-جيدا لوحة لكل عينة. إضافة 10 ميكرولتر من عينة المصل إلى كل بئر وإحضار الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: استخدم كلا من IgG غير المحدد (التحكم السلبي) وتحييد الأجسام المضادة سارس-CoV-2 (التحكم الإيجابي) بتركيز 1 ميكروغرام/مل كما هو موضح في الخطوة 2.1.2. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تقييم عينات المصل من الفئران الملقحين للأجسام المضادة. في هذا الاختبار، تم الحصول على عينات المصل من الحرم الجامعي العام مستشفى أوتاوا بموجب إجراء معتمد وبموافقة مستنيرة من الأفراد. - احتضان لمدة 30 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة على غسالة مغناطيسية لتسريع مجمع البروتين G-الأجسام المضادة.
ملاحظة: الهيكل المحدد للغسالة المغناطيسية سوف يعجل المجمع على الجدران الجانبية لكل بئر. - تجاهل الحل في القسم الأوسط من كل بئر، وإضافة برنامج تلفزيوني للغسيل. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات على الأقل لإزالة HiBiT-RBD الزائدة. إضافة 50 ميكرولتر من 1x برنامج تلفزيوني و 50 ميكرولتر من 1x LgBiT. حضانة لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإعداد برنامج قياس اللمعان، ثم أضف 50 ميكرولتر من الركيزة 1x. ضع اللوحة في الجهاز، وتشغيل البرنامج، وتسجيل الإشارات. قارن الإشارات من عينات المصل وعينات التحكم والخلفية (الآبار الفارغة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تسجيل الإشارات من كل من lysate الخلية المحتوية على HiBit-RBD وsupernatant من الخلايا المصابة (الشكل 2) لتقييم مصدر البروتين المناسب. تم استخدام HiBiT-RBD و LgBit بشكل منفصل كعناصر تحكم ، وأظهرت البيانات خلفية منخفضة مقارنة بإشارة قوية عندما تم الجمع بين كلا الجزءين. وبالتالي، فإن تفاعل HiBiT-RBD مع LgBiT ضروري لتوليد إنزيم نشط لهضم الركيزة ونشاط الإضاءة الحيوية (الشكل 1).
إضافة البروتين G سوف تساعد الأجسام المضادة هطول الأمطار (الشكل 3). وقد استخدم هذا الفحص لمقارنة الاشارة من جهاز مضاد تجارى لتحييد السارس - كو فى - 2 مع جهاز ايجى جى للسيطرة . كانت إشارة الجسم المضاد المحددة قوية ، في حين أن الجسم المضاد للتحكم كان قريبا من مستوى الخلفية الإنارة (الشكل 4A). تم استخدام فيروس التهاب الفم الوهن الملتح (VSV) المتماسك مع طفرة في الموضع 51 من بروتين M (Δ51) الذي يعبر عن RBD الخارجي لتطعيم الفئران. أنتج المصل الذي تم جمعه من الفئران الملقحة إشارة قوية مقارنة مع عدم وجود إشارة في الفئران التي تم حقنها باستخدام VSV التحكم (الشكل 4B).
الشكل 1: تفاعل LgBiT مع HiBiT المتصل ب RBD. عند تفاعل الجزء الصغير من النانولوسيفراز ، HiBiT ، مع الوحدة الفرعية الكبيرة للانزيم ، LgBiT ، يمكن لمجمع الإنزيم النشط إنتاج إشارة مضيئة بعد استهلاك الركيزة. لا تتداخل RBD مع هذه العملية. الاختصارات: RBD = مجال ربط المستقبلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نشاط مراسل قوي من كل من الخلايا المصابة بالإصابة والخلايا الفائقة. البروتين موجود في كل من supernatant وlysate وتنتج إشارة قوية. وكانت إشارات الإنارة لمجموعات التحكم قريبة من الخلفية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تخطيطي للتفاعل HiBiT-RBD مع الأجسام المضادة المرتبطة بالبروتين G. يصور التخطيطي هطول الأمطار على الأجسام المضادة عن طريق البروتين G والتفاعل مع HiBiT-RBD. إضافة LgBit إلى الخليط سوف تنتج إشارة قوية عندما يكون الجسم المضاد محددة لRBD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تولد HiBiT-RBD bioluminescence قوية مع الأجسام المضادة تحييد تنقية، مصل الماوس تطعيم، وعينات مصل المريض. (أ) يتفاعل HiBiT-RBD مع الأجسام المضادة المحايدة الخاصة ب RBD ويولد إشارة عالية بشكل ملحوظ مقارنة بالإشارة التي لا تذكر ل IgG غير المحدد. (ب) يمكن للمراسب الحيوي الكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 في مصل الفأر الملقح. المختصرات: RBD = مجال ربط المستقبلات؛ IgG = الغلوبولين المناعي G; Ab = الأجسام المضادة; VSV = فيروس التهاب الفم الرسغي; فلوك = اليراعة لوسيفراز. (ج) الكشف عن الأجسام المضادة للسارس-CoV-2 في عينات مصل المريض، المستنسخة من آزاد وآخرون.22. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتطلب العدد المتزايد من المصابين بالسارس-فيروس الكواد-2 والجهود الجارية للتطعيم العالمي إجراء اختبارات مصلية حساسة وسريعة يمكن استخدامها في عمليات مسح المصل على نطاق واسع. وتبين البحوث الحديثة أنه يمكن استخدام التقارير البيولوجية القائمة على النانولوسيفراز لتطوير مثل هذه المقايسات. قمنا مؤخرا بتطوير HiBiT-RBD بيوبورتر لتصميم اختبار يمكن استخدامه للكشف عن الأجسام المضادة الخاصة بالسارس-CoV-2 في مصل المريض بطريقة سريعة وموثوقة (الشكل 4C).
هناك بعض الخطوات الحاسمة في هذا المقايسة. لأن كفاءة النظام يعتمد على التعبير البروتين RBD, وينبغي التحقق من صحة مستويات البروتين عن طريق النشاف الغربية. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري استخدام السيطرة الإيجابية، مثل الأجسام المضادة التجارية ضد RBD، والأجسام المضادة للسيطرة السلبية. يوصى باستخدام إضافة بروتين Nanoluciferase كتحكم إيجابي للكشف عن الإضاءة الحيوية. يحتوي منتج البروتين أيضا على علامة His ، والتي يمكن استخدامها لتنقية عدد كبير من عينات المصل.
هناك العديد من المزايا لاستخدام هذا التقرير الحيوي مقارنة بالطرق المتنافسة الأخرى. أولا، يمكن للمستخدم ذو الخبرة إجراء الفحص الكامل في أقل من ساعة واحدة، وهو أسرع بكثير من الاختبارات الموجودة مثل ELISA. ثانيا، إن متطلبات الإعداد والاختبار الدنيا تجعل هذا الاختبار ذا قيمة عالية للإنتاج على نطاق واسع بتكلفة منخفضة. وعلاوة على ذلك، فإن حد الكشف عن المقايسة منخفض يصل إلى 1 نانوغرام من الجسم المضاد المحايد للسارس-CoV-2 كما وصفها آزاد وآخرون.22. عيب هذا النهج هو عدم القدرة على التفريق بين مختلف isotypes الأجسام المضادة. للمضي قدما، ينبغي مقارنة حساسية الاختبار إلى غيرها من الاختبارات المصلية المستخدمة بشكل روتيني.
آزاد وآخرون. 22 قد استخدمت عينات المصل من المرضى لتقييم إمكانية تطبيق المقايسة. ومن الضروري أيضا أن يتم اختبار النظام للكشف عن الأجسام المضادة في عينات الدم من المرضى. ويمكن أن تكون هذه الأداة أيضا مؤثرة جدا في تقييم العلاقة بين شدة COVID-19 ووجود الأجسام المضادة الخاصة بالسارس-CoV-2. وعموما، يمكن أن يكون لهذه الاختبارات المصلية تأثير كبير في تقدير الأثر الوبائي للسارس-CoV-2 ويمكن أن تكون بديلا مناسبا لطرق الكشف التي تستغرق وقتا طويلا وأقل حساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن نقدر ونشكر المساعدة التقنية التي يقدمها شياوهونغ هي، وريكاردو ماريوس، وجوليا بيتريك، وبرادلي أوستن، وكريستيانو تانيزي دي سوزا. نشكر أيضا مينا قريماني على التصميم الجرافيكي. كما نود أن نشكر جميع الأفراد الذين شاركوا وتبرعوا بعينات دمهم لهذه الدراسة. ويدعم DWC جزئيا من قبل كلية uOttawa وقسم الطب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
