Summary
Le protocole décrit la procédure de production du complexe protéique du domaine de liaison au récepteur HiBiT et son application pour la détection rapide et sensible des anticorps anti-SARS-CoV-2.
Abstract
L’émergence de la pandémie de COVID-19 a accru le besoin de meilleures méthodes de détection sérologique pour déterminer l’impact épidémiologique du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). Le nombre croissant d’infections par le SRAS-CoV-2 soulève la nécessité de meilleurs tests de détection des anticorps. Les méthodes actuelles de détection des anticorps compromettent la sensibilité pour la vitesse ou sont sensibles mais prennent beaucoup de temps. Une grande partie des anticorps neutralisant le SRAS-CoV-2 ciblent le domaine de liaison aux récepteurs (RBD), l’un des principaux compartiments immunogènes du SARS-CoV-2. Nous avons récemment conçu et développé un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) hautement sensible et marqué au bioluminescent pour détecter les anticorps du SRAS-CoV-2. Le texte suivant décrit la procédure à suivre pour produire le complexe HiBiT-RBD et un test rapide pour évaluer la présence d’anticorps ciblant rbD à l’aide de cet outil. En raison de la durabilité du produit protéique HiBiT-RBD sur une large plage de températures et de la procédure expérimentale plus courte qui peut être achevée en 1 h, le protocole peut être considéré comme une alternative plus efficace pour détecter les anticorps du SRAS-CoV-2 dans les échantillons de sérum des patients.
Introduction
L’émergence récente d’un nouveau coronavirus, le SRAS-CoV21, a causé plus de 2 800 000 décès et 128 millions d’infections au 30 mars 20212. En raison de l’absence d’une procédure de traitement fiable et bien établie pour les thérapies cliniques du SRAS-CoV-2, de nombreux efforts ont été déployés pour limiter la transmission virale et, plus important encore, pour développer un traitement efficace et robuste ou un vaccin3. À ce jour, plus de 50 candidats vaccins contre la COVID-19 font l’objet d’essais rapportés par l’Organisation mondiale de la Santé4. La détection d’anticorps contre le SARS-CoV-2 est d’une importance capitale pour déterminer la stabilité à long terme de la réponse humorale lors de l’administration du vaccin ainsi que chez les patients guéris de la COVID-195. Certaines études ont démontré qu’il est possible que les patients guéris du SRAS-CoV-2 perdent la plupart des anticorps de liaison à la RBD après 1 an5,6,7,8,9. Des recherches plus approfondies sont nécessaires pour mieux comprendre l’immunité durable, et des plates-formes de détection d’anticorps plus sensibles peuvent aider à poursuivre ces travaux. Les rapports sur l’immunité soutenue des infections légères par le SRAS-CoV-2, qui suggèrent des réponses anticorps à long terme, constituent également un domaine d’étude intéressant et utile. Une méthode de détection rapide et précise est essentielle pour surveiller les anticorps dans le sérum des individus afin de fournir plus d’informations sur l’immunité dans la population.
Comme d’autres coronavirus, le SARS-CoV-2 utilise la glycoprotéine de pointe saillante pour se lier à l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 (ACE2) afin d’initier une cascade d’événements qui conduisent à la fusion des membranes virale et cellulaire6,7. Plusieurs études ont récemment prouvé que la RBD de la protéine Spike joue un rôle crucial dans l’obtention d’une réponse anticorps puissante et spécifique contre le SARS-CoV28,9,10,11. En particulier, les corrélations observées par Premkumar et coll. entre le titre d’anticorps liant la RBD et la puissance de neutralisation du plasma des patients par le SRAS-CoV-2 sont compatibles avec le fait que la RBD est un compartiment immunogène de la structure du virus9. Dans cet esprit, de nombreux tests diagnostiques disponibles pour la détection des anticorps sars-CoV-2 sont longs et coûteux, nécessitent une longue procédure d’incubation et de lavage (test immuno-enzymatique [ELISA]), ou manquent de sensibilité et de précision (test immunologique à flux latéral [LFIA])12. Par conséquent, une méthode sérologique complémentaire quantitative et rapide de détection des anticorps dérivés de la COVID-19 avec une sensibilité élevée, une réponse rapide et un coût relativement faible répondrait au besoin d’un test sérologique fiable pour la surveillance épidémiologique du SRAS-CoV-2.
Collectivement, les limites des essais sérologiques actuels ont incité à étudier le système de déclaration bioluminescente en tant qu’agent de diagnostic potentiel dans les futures enquêtes sérologiques. La bioluminescence est une réaction enzyme/substrat naturelle, avec émission de lumière. La nanoluc luciférase est la plus petite (19 kDa), mais le système le plus brillant par rapport à Renilla et à la luciole luciférase (36 kDa et 61 kDa, respectivement)13,14. En outre, Nanoluc a le rapport signal / bruit le plus élevé et la stabilité parmi les systèmes mentionnés précédemment. L’intensité de signal élevée de Nanoluc prend en charge la détection de très faibles quantités de fusions rapporteures15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) est une version divisée du système Nanoluc, qui est composé de deux segments: petit BiT (11 acides aminés; SmBiT) et grand BiT (LgBiT) avec des interactions d’affinité relativement faible (KD = 190 μM) pour former un complexe luminescent16. NanoBiT est largement utilisé dans diverses études impliquant l’identification des interactions protéine-protéine15,17,18,19 et des voies de signalisation cellulaire11,20,21.
Récemment, un autre petit peptide avec une affinité nettement plus élevée pour LgBiT (KD = 0,7 nM) a été introduit, à savoir le système HiBiT Nano-Glo, à la place de SmBiT. La haute affinité et le signal fort du test Nano-Glo « add-mix-read » font de HiBiT une étiquette peptidique luminescente quantitative appropriée. Dans cette approche, la balise HiBiT est ajoutée à la protéine cible en développant une construction imposant une interférence structurelle minimale. La fusion de la protéine HiBiT se lierait activement à la contrepartie LgBiT, produisant une enzyme luciférase hautement active pour générer une bioluminescence détectable en présence de réactifs de détection (Figure 1). De même, nous avons développé un système basé sur HiBiT Nano-Glo pour mesurer facilement le titre d’anticorps neutralisants dans le sérum des individus guéris du SRAS-CoV-2 et avons récemment développé un RBD SARS-CoV-2 marqué HiBiT. Cet article décrit le protocole de production du biorapporteur HiBiT-RBD à l’aide de procédures et d’équipements de laboratoire standard, et montre comment ce biorapporteur peut être utilisé dans un test rapide et efficace pour détecter les anticorps ciblant le SARS-CoV-2 RBD.
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Protocol
REMARQUE: Le protocole décrit ci-dessous adhère à toutes les directives d’éthique conformément au code de protocole 20200371-01H.
1. Production et évaluation du bioreporter HiBiT-RBD
- Produire une quantité suffisante de bioreporter HiBiT-RBD
- Se préparer à la culture cellulaire
- Préparer le milieu Eagle modifié (DMEM) complet de Dulbecco contenant 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine. Ensuite, réchauffez le média dans un bain-marie à 37 °C.
- Allumez l’armoire de sécurité biologique (ESB) et utilisez de l’éthanol à 70 % v/v pour stériliser la surface de l’armoire.
- Cultivez la lignée cellulaire.
- Retirez la lignée cellulaire de -80 °C ou de l’azote liquide et décongelez-la dans un bain-marie à 37 °C.
REMARQUE: Une lignée cellulaire appropriée est facile à maintenir en culture, a une efficacité de transfection élevée et convient à la production de protéines exogènes. Rein embryonnaire humain, cellules HEK293 ont été utilisés pour ce protocole. - Mélanger les cellules décongelées avec au moins 10 mL de milieu complet, pipeter la suspension cellulaire dans une boîte de Petri de 10 cm et faire tourbillonner la plaque pour répartir uniformément les cellules dans la boîte. Placez le plat dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5 % de CO2 et 85 à 95 % d’humidité.
- Observez les cellules au microscope jusqu’à ce que le niveau de confluence atteigne 80-90%. À haute confluence, retirez le milieu, lavez les cellules avec une solution saline chaude tamponnée au phosphate (PBS) et ajoutez 1 mL d’acide tétraacétique à 0,25 % de trypsine-éthylènediamine pour détacher les cellules de la surface.
REMARQUE: Les cellules HEK293 se détachent assez facilement. Par conséquent, l’étape de lavage doit être effectuée très doucement pour éviter le détachement accidentel et la perte de cellules. - Après environ 5 minutes, regardez les cellules au microscope. Si toutes les cellules flottent, ajoutez au moins 4 mL de milieu et transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube stérile. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajoutez 1 × 106 cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pour la transfection.
REMARQUE: Après 24 h, les cellules doivent être à 80% ou plus de confluent.
- Retirez la lignée cellulaire de -80 °C ou de l’azote liquide et décongelez-la dans un bain-marie à 37 °C.
- Transfection du plasmide HiBiT-RBD
- Utilisez 1 μg du plasmide d’expression HiBiT-RBD avec un réactif de transfection approprié. Incuber pendant 10-15 min à température ambiante, puis ajouter le volume total à chaque puits de la plaque, en forme de goutte.
REMARQUE: Suivez le protocole de transfection du fabricant. Dans ce cas, un mélange (une quantité spécifiée) du réactif de transfection avec du DMEM a été ajouté au plasmide dilué (1 μg) dans le DMEM (voir le tableau des matériaux). Utiliser un marqueur contenant (p. ex. protéine fluorescente verte [GFP]) du plasmide comme témoin pour surveiller l’efficacité de la transfection. - Le lendemain, remplacer le milieu contenant le mélange de transfection par un milieu complet. Observez bien le contrôle de la transfection 48 h après la transfection.
REMARQUE: Si la transfection a été positive et efficace (plus de 80% GFP-positif), les cellules doivent être prêtes pour la récolte du biorapporteur HiBiT-RBD. La construction contient également His-tag, qui peut être utilisé pour obtenir une protéine purifiée à la place du surnageant total. - Recueillir le surnageant dans des microtubes de 1,5 mL. Ajouter 500 μL de 1x tampon de lyse passive (PLB) aux cellules; incuber et agiter la plaque pendant 15 min à température ambiante pour la lyse cellulaire.
REMARQUE: Le surnageant et la solution de lysat peuvent être conservés à -20 °C avec une perte d’intégrité mineure pendant au moins 6 mois. Selon Azad et al.22, le rapporteur est stable à une large plage de pH (4-12) et de température (4-42 °C).
- Utilisez 1 μg du plasmide d’expression HiBiT-RBD avec un réactif de transfection approprié. Incuber pendant 10-15 min à température ambiante, puis ajouter le volume total à chaque puits de la plaque, en forme de goutte.
- Se préparer à la culture cellulaire
- Évaluation du signal luminescent du bioreporter par dosage de la luciférase
- Préparation des composants de la réaction
- Utilisez le surnageant comme source du biorapporteur.
REMARQUE: Le surnageant et le lysat contiennent tous deux le biorapporteur HiBiT-RBD et peuvent être utilisés pour le test. Cependant, le surnageant est recommandé comme source pour des raisons expliquées dans les notes suivantes. - Diluer le LgBiT et le substrat à 1x avant utilisation (la concentration en stock est de 100x).
REMARQUE: Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur le LgBiT.
- Utilisez le surnageant comme source du biorapporteur.
- Dosage de la luciférase
- Transférer 50 μL du surnageant de chaque puits ou tube vers une plaque de 96 puits et ajouter 50 μL de 1x LgBiT à chaque puits. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ouvrez le logiciel du luminomètre, ajoutez 50 μL de substrat 1x (furimazine) à chaque puits, placez la plaque dans le luminomètre et exécutez le logiciel.
REMARQUE: Ajouter le substrat immédiatement avant de lire la plaque pour éviter la consommation du substrat par les enzymes actives avant la mesure du signal.
- Préparation des composants de la réaction
2. Détection des anticorps anti-RBD avec un test rapide et sensible
- Test de détection d’anticorps HiBiT-RBD
- Préparez le biorapporteur HiBiT-RBD comme décrit à la section 1.1 du protocole.
NOTE : Il est recommandé d’utiliser le surnageant pour le test suivant car il est plus simple à collecter et contient la version glycosylée mature de la protéine. De plus, le lysat contient plusieurs autres protéines qui pourraient interférer avec l’interaction HiBiT-RBD-anticorps. - Combiner 50 μL du surnageant contenant du HiBiT-RBD avec 1 μg de l’anticorps commercial SARS-CoV-2-RBD dans un microtube de 1,5 mL. Ajouter 20 μL de protéine de liaison aux immunoglobulines (protéine G) à la solution. Augmentez le volume total à 300 μL en ajoutant PBS.
REMARQUE: Le volume total du mélange peut être réduit à 150 μL. Des volumes totaux plus faibles ne sont pas recommandés car cela pourrait entraîner un mélange inadéquat d’anticorps avec le biorapporteur. - Incuber le(s) tube(s) sur un agitateur à tube ou un rotateur pendant 30 min. Centrifuger à 12 000 × g pendant 30 s, jeter le surnageant et laver avec du PBS. Répétez le processus trois fois pour supprimer HiBiT-RBD libre. Remettre en suspension dans 50 μL de PBS et transférer sur une plaque de 96 puits.
- Ajouter 50 μL de 1x LgBiT et attendre 5 min. Ensuite, ajoutez 50 μL de 1x substrat NanoLuc. Lisez immédiatement le signal luminescent avec un luminomètre.
- Préparez le biorapporteur HiBiT-RBD comme décrit à la section 1.1 du protocole.
3. Détection à haut débit des anticorps spécifiques du SARS-CoV-2 à partir d’échantillons de sérum de patients
- Préparez de plus grandes quantités du biorapporteur HiBiT-RBD pour un test à haut débit en suivant la section 1.1 du protocole.
- Combiner 20 μL de protéine magnétique G avec 50 μL du surnageant HiBiT-RBD dans un puits de plaque de 96 puits pour chaque échantillon. Ajouter 10 μL de l’échantillon de sérum à chaque puits et porter le volume total à 150 μL en ajoutant du PBS.
REMARQUE : Utiliser à la fois des IgG non spécifiques (témoin négatif) et des anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 (témoin positif) à une concentration de 1 μg/mL, comme décrit à l’étape 2.1.2. De plus, des échantillons de sérum de souris vaccinées peuvent également être évalués pour les anticorps. Dans le cadre de ce test, des échantillons de sérum ont été prélevés au Campus général de l’Hôpital d’Ottawa selon une procédure approuvée et avec le consentement éclairé de personnes. - Incuber pendant 30 min sur un shaker à température ambiante. Placez la plaque sur une rondelle magnétique pour précipiter le complexe protéine G-anticorps.
REMARQUE: La structure spécifique de la laveuse magnétique précipitera le complexe sur les parois latérales de chaque puits. - Jetez la solution dans la section centrale de chaque puits et ajoutez PBS pour le lavage. Répétez l’étape de lavage au moins trois fois pour éliminer l’excès de HiBiT-RBD. Ajouter 50 μL de 1x PBS et 50 μL de 1x LgBiT. Incuber pendant au moins 5 min à température ambiante.
- Préparez le logiciel du luminomètre, puis ajoutez 50 μL de substrat 1x. Placez la plaque dans la machine, exécutez le logiciel et enregistrez les signaux. Comparez les signaux des échantillons de sérum, des échantillons témoins et du fond (puits vides).
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Representative Results
Les signaux provenant à la fois du lysat cellulaire contenant du HiBit-RBD et du surnageant des cellules transfectées ont été enregistrés (Figure 2) pour évaluer la source de protéines appropriée. HiBiT-RBD et LgBit ont été utilisés séparément comme contrôles, et les données ont montré un faible arrière-plan par rapport à un signal fort lorsque les deux parties ont été combinées. Par conséquent, l’interaction HiBiT-RBD avec LgBiT est nécessaire pour générer une enzyme active pour la digestion du substrat et l’activité de bioluminescence (Figure 1).
L’ajout de la protéine G aidera à la précipitation des anticorps (figure 3). Le test a été utilisé pour comparer le signal d’un anticorps neutralisant le SRAS-CoV-2 commercial avec une IgG témoin. Le signal d’anticorps spécifique était robuste, tandis que l’anticorps témoin était proche du niveau de fond luminescent (figure 4A). Le virus de la stomatite vésiculeuse vésiculeuse atténuée recombinante (VSV) avec une mutation à la position 51 de la protéine M (Δ51) exprimant la RBD exogène a été utilisé pour vacciner les souris. Le sérum prélevé sur des souris vaccinées a produit un signal robuste par rapport à aucun signal chez les souris injectées avec vsV témoin (Figure 4B).
Figure 1 : interaction LgBiT avec HiBiT connecté à RBD. Lors de l’interaction de la petite partie de la nanoluciférase, HiBiT, avec la grande sous-unité de l’enzyme, LgBiT, le complexe enzymatique actif peut produire un signal luminescent après la consommation du substrat. Le RBD n’interfère pas avec ce processus. Abréviations : RBD = domaine de liaison aux récepteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Activité rapporteure robuste du lysat et du surnageant des cellules transfectées. La protéine est présente à la fois dans le surnageant et le lysat et produit un signal fort. Les signaux luminescents des groupes témoins étaient proches de l’arrière-plan. Les barres d’erreur représentent l’écart type (SD). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Schéma de l’interaction HiBiT-RBD avec des anticorps liés à la protéine G. Le schéma représente la précipitation des anticorps par la protéine G et l’interaction avec HiBiT-RBD. L’ajout du LgBit au mélange produira un signal robuste lorsque l’anticorps est spécifique à rbD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Le biorapporteur HiBiT-RBD génère une forte bioluminescence avec des anticorps neutralisants purifiés, du sérum de souris vacciné et des échantillons de sérum de patients. (A) HiBiT-RBD interagit avec les anticorps neutralisants spécifiques à rbD et génère un signal significativement élevé par rapport au signal négligeable pour les IgG non spécifiques. (B) Le biorapporteur peut détecter les anticorps anti-SRAS-CoV-2 dans le sérum de souris vacciné. Abréviations : RBD = domaine de liaison aux récepteurs ; IgG = immunoglobuline G; Ab = anticorps; VSV = virus de la stomatite vésiculeuse; Fluc = luciole luciférase. (C) Détection des anticorps anti-SARS-CoV-2 dans des échantillons de sérum de patients, reproduits à partir d’Azad et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le nombre croissant de personnes infectées par le SARS-CoV-2 et les efforts continus pour la vaccination mondiale nécessitent des tests sérologiques sensibles et rapides qui peuvent être utilisés dans les enquêtes sérologiques à grande échelle. Des recherches récentes montrent que les biorapporteurs à base de nanoluciférase fractionnée peuvent être utilisés pour développer de tels tests. Nous avons récemment développé le biorapporteur HiBiT-RBD pour concevoir un test qui peut être utilisé pour détecter rapidement et de manière fiable les anticorps spécifiques du SRAS-CoV-2 dans le sérum des patients (Figure 4C).
Il y a quelques étapes critiques dans ce test. Étant donné que l’efficacité du système dépend de l’expression de la protéine RBD, les niveaux de protéines doivent être validés par transfert western. De plus, il est nécessaire d’utiliser un témoin positif, tel qu’un anticorps commercial contre rbD, et un anticorps témoin négatif. L’ajout d’une protéine nanoluciférase est recommandé pour être utilisé comme témoin positif pour la détection de la bioluminescence. Le produit protéique contient également une étiquette His, qui peut être utilisée pour la purification d’un grand nombre d’échantillons de sérum.
L’utilisation de ce biorapporteur présente plusieurs avantages par rapport à d’autres méthodes concurrentes. Tout d’abord, un utilisateur expérimenté peut effectuer la procédure de test complète en moins d’une heure, ce qui est considérablement plus rapide que les tests existants tels que ELISA. Deuxièmement, les exigences minimales de préparation et de test rendent ce test très précieux pour la production à grande échelle à faible coût. De plus, la limite de détection du test est aussi basse que 1 ng de l’anticorps neutralisant le SARS-CoV-2 tel que décrit par Azad et al.22. Un inconvénient de cette approche est l’incapacité de différencier les différents isotypes d’anticorps. À l’avenir, la sensibilité du test devrait être comparée à d’autres tests sérologiques couramment utilisés.
Azad et al. 22 avaient utilisé des échantillons de sérum de patients pour évaluer l’applicabilité du test. Il est également essentiel que le système soit testé pour la détection d’anticorps dans des échantillons de sang de patients. Cet outil pourrait également avoir un impact considérable sur l’évaluation de la corrélation entre la gravité de la COVID-19 et la présence d’anticorps spécifiques au SRAS-CoV-2. Dans l’ensemble, de tels tests sérologiques pourraient avoir un impact substantiel sur l’estimation de l’impact épidémiologique du SARS-CoV-2 et pourraient être un substitut pratique aux méthodes de détection longues et moins sensibles.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous apprécions et remercions l’assistance technique de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin et Christiano Tanese De Souza. Nous remercions également Mina Ghahremani pour la conception graphique. Nous tenons également à remercier toutes les personnes qui ont participé et donné leurs échantillons de sang pour cette étude. DWC est soutenu en partie par la faculté et le département de médecine de l’Université d’Ottawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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