Summary
הפרוטוקול המתואר מתאר את ההליך לייצור קומפלקס חלבון תחום מחייב קולטן HiBiT ויישום שלו לזיהוי מהיר ורגיש של נוגדני SARS-CoV-2.
Abstract
הופעתה של מגפת COVID-19 הגבירה את הצורך בשיטות זיהוי סרולוגיות טובות יותר כדי לקבוע את ההשפעה האפידמיולוגית של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2). המספר ההולך וגדל של זיהומי SARS-CoV-2 מעלה את הצורך בגילוי נוגדנים טוב יותר. שיטות זיהוי הנוגדנים הנוכחיות פוגעות ברגישות למהירות או רגישות אך גוזלות זמן רב. חלק גדול מהנוגדנים המנטרלים SARS-CoV-2 מכוונים לתחום איגוד הקולטן (RBD), אחד התאים האימונוגניים העיקריים של SARS-CoV-2. לאחרונה עיצבנו ופיתחנו RBD רגיש מאוד, מתויג ביו-זוהר (NanoLuc HiBiT-RBD) כדי לזהות נוגדנים SARS-CoV-2. הטקסט הבא מתאר את ההליך לייצור קומפלקס HiBiT-RBD ובחינת הפעלה מהירה כדי להעריך את נוכחותם של נוגדנים המיועדים ל-RBD באמצעות כלי זה. בשל עמידותו של מוצר חלבון HiBiT-RBD על פני מגוון רחב של טמפרטורות ואת ההליך הניסיוני הקצר יותר שניתן להשלים בתוך 1 שעות, הפרוטוקול יכול להיחשב כחלופה יעילה יותר לזיהוי נוגדנים SARS-CoV-2 בדגימות סרום המטופל.
Introduction
הופעתו האחרונה של נגיף הקורונה החדש, SARS-CoV21, גרמה ליותר מ-2,800,000 מקרי מוות ו-128 מיליון זיהומים נכון ל-30 במרץ 20212. בשל היעדר הליך טיפול אמין ומבוסס היטב לטיפולים קליניים SARS-CoV-2, נעשו מאמצים רבים להגביל העברה ויראלית נוספת וחשוב מכך, לפתח טיפול יעיל וחזק או חיסון3. עד כה, ישנם יותר מ -50 מועמדים לחיסון COVID-19 בניסויים שדווחו על ידי ארגון הבריאות העולמי4. איתור נוגדנים נגד SARS-CoV-2 הוא בעל חשיבות עליונה לקבוע את היציבות ארוכת הטווח של תגובה הומוריסטית בעת מתן החיסון, כמו גם בחולים שהחלימו מ- COVID-195. מספר מחקרים הראו כי קיימת אפשרות כי חולי SARS-CoV-2 התאושש לאבד את רוב נוגדנים מחייב RBD לאחר שנה אחת5,6,7,8,9. דרושה חקירה נוספת כדי להבין טוב יותר את החסינות המתמשכת, ופלטפורמות רגישות יותר לזיהוי נוגדנים יכולות לסייע בהמשך עבודה כזו. דיווחים על חסינות מתמשכת של זיהומים מתונים SARS-CoV-2, המציעים תגובות נוגדנים לטווח ארוך, הוא גם תחום מחקר מעניין וכדאי. שיטת זיהוי מהירה ומדויקת חיונית לניטור נוגדנים בסרה של אנשים כדי לספק מידע נוסף על חסינות באוכלוסייה.
כמו נגיפי קורונה אחרים, SARS-CoV-2 משתמש בגליקופרוטאין ספייק בולט כדי להיקשר לאנגי-טנסין-ממיר אנזים-2 (ACE2) כדי ליזום מפל של אירועים שמובילים להיתוך של קרום הנגיפי והתא6,7. מספר מחקרים הוכיחו לאחרונה כי ל-RBD של חלבון ספייק יש תפקיד מכריע בהצתת תגובת נוגדנים עוצמתית וספציפית נגד SARS-CoV28,9,10,11. בפרט, קורלציות שנצפו על ידי Premkumar ואח ' בין titer של נוגדן מחייב RBD ועוצמה נטרול SARS-CoV-2 של פלזמה של חולים עולים בקנה אחד עם RBD להיות תא אימונוגני של מבנה הנגיף9. עם זאת, בדיקות אבחון רבות הזמינות לזיהוי נוגדנים SARS-CoV-2 הן זמן ועלויות אינטנסיביות, דורשות הליך ממושך של דגירה ושטיפה (בדיקת חיסונים הקשורה לאנזים [ELISA]), או חוסר רגישות ודיוק (אימונואוסי זרימה לרוחב [LFIA])12. לכן, שיטה סרולוגית משלימה כמותית ומהירה של זיהוי נוגדנים שמקורו ב- COVID-19 עם רגישות גבוהה, תגובה מהירה ועלות נמוכה יחסית תשרת את הצורך בבדיקה סרולוגית אמינה למעקב אפידמיולוגי SARS-CoV-2.
באופן קולקטיבי, המגבלות של הבדיקות הסרולוגיות הנוכחיות הובילו לחקירת מערכת הדיווח הביו-זוהרת כסוכן אבחון פוטנציאלי בסרוסוריים עתידיים. ביולומינציה היא תגובת אנזים/מצע טבעית, עם פליטת אור. Nanoluc לוציפראז הוא הקטן ביותר (19 kDa), עדיין המערכת הבהירה ביותר בהשוואה רנילה ולוציפראז גחלילית (36 kDa ו 61 kDa, בהתאמה)13,14. יתר על כן, Nanoluc יש את יחס האות לרעש הגבוה ביותר ויציבות בין המערכות שהוזכרו קודם לכן. עוצמת האות הגבוהה של Nanoluc תומכת בזיהוי כמויות נמוכות מאוד של היתוך כתבים15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) היא גרסה מפוצלת של מערכת Nanoluc, המורכבת משני מקטעים: BiT קטן (11 חומצות אמינו; SmBiT) ו- BiT גדול (LgBiT) עם אינטראקציות זיקה נמוכה יחסית (KD = 190 מיקרומטר ) כדי ליצור קומפלקס זוהר16. NanoBiT נמצא בשימוש נרחב במחקרים שונים הכוללים זיהוי של אינטראקציות חלבון חלבון15,17,18,19 ומסלולי איתות תאיים11,20,21.
לאחרונה, פפטיד קטן נוסף עם זיקה גבוהה יותר באופן מובהק LgBiT (KD = 0.7 nM) הוצג, כלומר מערכת HiBiT Nano-Glo, במקום SmBiT. הזיקה הגבוהה והאות החזק של ננו-גלו "להוסיף-לערבב-לקרוא" אסאי עושה HiBiT מתאים, כמותי, תג פפטיד זוהר. בגישה זו, תג HiBiT מצורף לחלבון היעד על ידי פיתוח מבנה המטיל הפרעה מבנית מינימלית. היתוך חלבון HiBiT ייקשר באופן פעיל למקבילו LgBiT, ויפיק אנזים לוציפראז פעיל מאוד כדי ליצור ביו-לומינציה הניתנת לזיהוי בנוכחות ריאגנטים לזיהוי (איור 1). באופן דומה, פיתחנו מערכת מבוססת HiBiT Nano-Glo כדי למדוד בקלות את טיטר הנוגדנים המנטרל בסרה של אנשים שהתאוששו SARS-CoV-2 ולאחרונה פיתחנו RBD SARS-CoV-2 מתויג HiBiT. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לייצור bioreporter HiBiT-RBD באמצעות נהלי מעבדה סטנדרטיים וציוד, ומראה כיצד ניתן להשתמש ב- bioreporter זה בבוחן מהיר ויעיל לזיהוי נוגדנים המיועדים ל- SARS-CoV-2 RBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול המתואר להלן דבק בכל הנחיות האתיקה על פי קוד הפרוטוקול 20200371-01H.
1. ייצור והערכה של הדו"ח הביולוגי HiBiT-RBD
- ייצור כמות מספקת של ביו-סרבטור HiBiT-RBD
- הכנה לתרבות תאים
- הכן את מדיום הנשר (DMEM) המותאם של Dulbecco המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לאחר מכן, לחמם את התקשורת באמבט מים 37 °C (37 °F).
- הפעל את ארון הבטיחות הביולוגי (BSC) והשתמש ב-70% v/v אתנול לחיטוי משטח הארון.
- תרבית את קו התא.
- מוציאים את קו התא מ -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי, ומפשירים אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: קו תאים מתאים קל לתחזוקה בתרבות, בעל יעילות transfection גבוהה, והוא מתאים לייצור חלבון אקסוגני. כליה עוברית אנושית, תאי HEK293 שימשו לפרוטוקול זה. - מערבבים את התאים המופשרים עם לפחות 10 מ"ל של מדיום שלם, pipette את השעיית התא לצלחת פטרי 10 ס"מ, ומערבבים את הצלחת כדי להפיץ תאים בצלחת באופן אחיד. מניחים את המנה באינקובטור תרבית תאים ב 37 °C (5°F), 5% CO2, ו 85-95% לחות.
- שימו לב לתאים שמתחת למיקרוסקופ עד שרמת ההשפעה מגיעה ל-80-90%. במפגש גבוה, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם תמיסת מלח חמה חוצץ פוספט (PBS), ולהוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-אתילנדיאמין חומצה טטראצטית לנתק את התאים מפני השטח.
הערה: תאי HEK293 מנותקים די בקלות. לפיכך, שלב הכביסה צריך להיעשות בעדינות רבה כדי למנוע ניתוק מקרי ואובדן תאים. - לאחר כ 5 דקות, להסתכל על התאים תחת מיקרוסקופ. אם כל התאים צפים, להוסיף לפחות 4 מ"ל של בינוני, ולהעביר את השעיית התא לתוך צינור סטרילי חדש. לספור את התאים באמצעות hemocytometer, ולהוסיף 1 × 106 תאים לתוך כל באר של צלחת 6-באר עבור transfection.
הערה: לאחר 24 שעות, תאים צריכים להיות ב 80% או יותר.
- מוציאים את קו התא מ -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי, ומפשירים אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- טרנספקטו של הפלסמיד HiBiT-RBD
- השתמש 1 מיקרוגרם של ביטוי HiBiT-RBD plasmid עם ריאגנט transfection מתאים. דגירה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף את הנפח הכולל לכל באר של הצלחת, טיפה חכם.
הערה: פעל בהתאם לפרוטוקול ההדבקה של היצרן. במקרה זה, תערובת (כמות שצוינה) של ריאגנט transfection עם DMEM נוספה plasmid מדולל (1 מיקרוגרם) ב- DMEM (ראה טבלת החומרים). השתמש סמן המכיל (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]) plasmid כמו בקרה כדי לפקח על יעילות transfection. - למחרת, להחליף את המדיום המכיל את תערובת transfection עם מדיום מלא. שים לב בקרת transfection גם 48 שעות לאחר transfection.
הערה: אם transfection היה חיובי ויעיל (יותר מ 80% GFP חיובי), התאים צריכים להיות מוכנים לקטיף את bioreporter HiBiT-RBD. המבנה מכיל גם את התג שלו, אשר ניתן להשתמש בו כדי להשיג חלבון מטוהר במקום supernatant הכולל. - לאסוף את supernatant ב microtubes 1.5 מ"ל. הוסף 500 μL של 1x מאגר תמה פסיבית (PLB) לתאים; לדגור ולנער את הצלחת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עבור תמיסת התא.
הערה: פתרון supernatant ואת פתרון lysate ניתן לשמר ב -20 °C (50 °F) עם אובדן קל של שלמות לפחות 6 חודשים. על פי Azad et al.22, הכתב יציב במגוון רחב של pH (4-12) וטמפרטורה (4-42 °C (4-42 °F).
- השתמש 1 מיקרוגרם של ביטוי HiBiT-RBD plasmid עם ריאגנט transfection מתאים. דגירה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף את הנפח הכולל לכל באר של הצלחת, טיפה חכם.
- הכנה לתרבות תאים
- הערכה של האות הזוהר מהביודר מדווח על ידי לוציפראז
- הכנת רכיבי התגובה
- השתמש בסופר-טבעי כמקור של הביו-ריאלפורטר.
הערה: הן סופר-טבעי והן ליסאט מכילים את הדו"ץ הביולוגי HiBiT-RBD וניתן להשתמש בהם לבדיקה. עם זאת, סופר-נטנטי מומלץ כמקור מסיבות המוסברות בהתרים הבאים. - לדלל את LgBiT ואת המצע ל 1x לפני השימוש (ריכוז מלאי הוא 100x).
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות LgBiT.
- השתמש בסופר-טבעי כמקור של הביו-ריאלפורטר.
- לוציפראזה אסאי
- העבר 50 μL של supernatant מכל באר או צינור לצלחת 96-well, ולהוסיף 50 μL של 1x LgBiT לכל באר. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- פתח את תוכנת לומינומטר, הוסף 50 μL של מצע 1x (furimazine) לכל באר, למקם את הצלחת ב luminometer, ולהפעיל את התוכנה.
הערה: הוסף את המצע מיד לפני קריאת הצלחת כדי למנוע את צריכת המצע על ידי האנזימים הפעילים לפני מדידת האות.
- הכנת רכיבי התגובה
2. זיהוי נוגדן נגד RBD עם מדיקה מהירה ורגישה
- HiBiT-RBD זיהוי נוגדנים
- הכן את הביו-דיווח HiBiT-RBD כמתואר בסעיף 1.1 של הפרוטוקול.
הערה : מומלץ להשתמש supernatant עבור בדיקת הבא כפי שהוא פשוט יותר לאסוף ומכיל את הגירסה הגליקוסילית הבוגרת של החלבון. יתר על כן, ליסאט יש כמה חלבונים אחרים שיכולים להפריע אינטראקציה HiBiT-RBD-נוגדנים. - שלבו 50 מיקרו-אל של חומר-על המכיל HiBiT-RBD עם מיקרוגרם אחד של נוגדן SARS-CoV-2-RBD מסחרי במיקרו-טוב של 1.5 מ"ל. הוסיפו לתמיסה 20 מיקרו-אל של חלבון המחייב אימונוגלובולין (חלבון G). העלה את הנפח הכולל ל- 300 μL על-ידי הוספת PBS.
הערה: ניתן להקטין את הנפח הכולל של התערובת ל 150 μL. נפחים כוללים נמוכים יותר אינם מומלצים כפי שהוא עלול לגרום ערבוב לקוי של נוגדנים עם bioreporter. - לדגור את הצינורות על שייקר צינור או סיבוב במשך 30 דקות. צנטריפוגה ב 12,000 × g עבור 30 s, להשליך את supernatant, ולשטוף עם PBS. חזור על התהליך שלוש פעמים כדי להסיר HiBiT-RBD בחינם. resuspend ב 50 μL של PBS ולהעביר לצלחת 96-well.
- הוסף 50 μL של 1x LgBiT ולחכות 5 דקות. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של 1x NanoLuc מצע. מיד לקרוא את האות הזוהר עם לומינומטר.
- הכן את הביו-דיווח HiBiT-RBD כמתואר בסעיף 1.1 של הפרוטוקול.
3. זיהוי תפוקה גבוהה של נוגדנים ספציפיים SARS-CoV-2 מדגימות סרום המטופל
- הכן כמויות גדולות יותר של bioreporter HiBiT-RBD לבדיקה בתפוקה גבוהה על-ידי ביצוע סעיף 1.1 של הפרוטוקול.
- שלבו 20 מיקרו-אל של חלבון מגנטי G עם 50 מיקרו-אל של סופר-נט HiBiT-RBD בבאר של 96-באר עבור כל דגימה. הוסף 10 μL של דגימת הסרום לכל באר ולהעלות את הנפח הכולל ל 150 μL על ידי הוספת PBS.
הערה: השתמש הן IgG לאspecific (שליטה שלילית) ונטרול נוגדן SARS-CoV-2 (שליטה חיובית) בריכוז 1 מיקרוגרם / מ"ל כמתואר בשלב 2.1.2. יתר על כן, דגימות סרום מעכברים מחוסנים ניתן גם להעריך עבור נוגדנים. בבדיקה זו התקבלו דגימות סרום מהקמפוס הכללי של בית החולים אוטווה תחת הליך מאושר ובהסכמה מדעת של אנשים. - דגירה במשך 30 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר. מניחים את הצלחת על מכונת כביסה מגנטית כדי לזרז את קומפלקס החלבון G-נוגדנים.
הערה: המבנה הספציפי של מכונת הכביסה המגנטית יזרז את המתחם על הקירות הצדדיים של כל באר. - יש להשליך את הפתרון בחלק האמצעי של כל באר ולהוסיף PBS לכביסה. חזור על שלב הכביסה לפחות שלוש פעמים כדי להסיר עודף HiBiT-RBD. הוסף 50 μL של 1x PBS ו 50 μL של 1x LgBiT. דגירה במשך 5 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
- הכן את תוכנת לומינומטר ולאחר מכן הוסף 50 μL של מצע 1x. הנח את הלוח במכונה, הפעל את התוכנה והקלט את האותות. השווה את האותות מדגימות סרום, דגימות בקרה ורקע (בארות ריקות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האותות הן מהתאים המכילים HiBit-RBD והן מ-supernatant של התאים שהודבקו נרשמו (איור 2) כדי להעריך את מקור החלבון המתאים. HiBiT-RBD ו- LgBit שימשו בנפרד כפקדים, והנתונים הראו רקע נמוך בהשוואה לאות חזק כאשר שני החלקים שולבו. לפיכך, אינטראקציה HiBiT-RBD עם LgBiT הכרחית כדי ליצור אנזים פעיל לעיכול מצע ופעילות ביו-לומינציה (איור 1).
תוספת של חלבון G תסייע למשפכי נוגדנים (איור 3). ההבחנה שימשה כדי להשוות את האות מנוגדן מנטרל SARS-CoV-2 מסחרי עם IgG שליטה. אות הנוגדנים הספציפי היה חזק, ואילו נוגדן הבקרה היה קרוב לרמת הרקע הזוהרת (איור 4A). רקומביננט מוחלש אונקוליטי וירוס stomatitis (VSV) עם מוטציה במיקום 51 של חלבון M (Δ51) ביטוי RBD אקסוגני שימש לחיסון עכברים. הנסיוב שנאסף מעכברים מחוסנים יצר אות חזק בהשוואה ללא אות בעכברים שהוזרקו עם בקרת VSV (איור 4B).
איור 1: אינטראקציית LgBiT עם HiBiT המחוברת ל-RBD. לאחר אינטראקציה של החלק הקטן של nanoluciferase, HiBiT, עם subunit הגדול של האנזים, LgBiT, קומפלקס האנזים הפעיל יכול לייצר אות זוהר לאחר צריכת מצע. ה- RBD אינו מפריע לתהליך זה. קיצורים: RBD = תחום איגוד קולטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פעילות עיתונאית איתנה הן של ליסאט והן של תאים שהודבקו. החלבון נמצא הן בסופר-טבעי והן בליסאט ומייצר אות חזק. האותות הזוהרים של קבוצות הביקורת היו קרובים לרקע. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שרטוט של אינטראקציית HiBiT-RBD עם נוגדנים הקשורים לחלבון G. השרטוט מתאר את משקעים נוגדנים על ידי חלבון G ואינטראקציה עם HiBiT-RBD. התוספת של LgBit לתערובת תפיק אות חזק כאשר הנוגדן הוא ספציפי עבור RBD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביו-ספורט HiBiT-RBD מייצר ביו-לומינציה חזקה עם נוגדנים מנטרלים מטוהרים, סרום עכבר מחוסן ודגימות סרום מטופלים. (A) HiBiT-RBD מקיים אינטראקציה עם נוגדן מנטרל ספציפי ל-RBD ומייצר אות גבוה משמעותית בהשוואה לאות זניח עבור IgG לא ספציפי. (B) הביו-דו"ח יכול לזהות נוגדני SARS-CoV-2 בסרום עכבר מחוסן. קיצורים: RBD = תחום איגוד קולטן; IgG = אימונוגלובולין G; Ab = נוגדן; VSV = וירוס סטומטיטיס ארסית; Fluc = לוציפראז גחלילית. (ג) זיהוי נוגדני SARS-CoV-2 בדגימות סרום מטופלים, שהועתקו מ-Azad et al.22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המספר ההולך וגדל של אנשים שנדבקו ב- SARS-CoV-2 והמאמץ המתמשך לחיסון גלובלי מחייבים בדיקות סרולוגיות רגישות ומהירות שניתן להשתמש בהן בסרוסוריבים בקנה מידה גדול. מחקר שנערך לאחרונה מראה כי bioreporters מבוסס ננו-לוציפראז מפוצלים ניתן להשתמש כדי לפתח מותנים כאלה. לאחרונה פיתחנו את הביו-דו"ח HiBiT-RBD כדי לעצב בדיקה שניתן להשתמש בה כדי לזהות נוגדנים ספציפיים לסארס-CoV-2 בסרום המטופל בצורה מהירה ואמינה (איור 4C).
יש כמה צעדים קריטיים בהצהרה הזאת. מכיוון שהיעילות של המערכת תלויה בביטוי חלבון RBD, רמות החלבון צריכות להיות מאומתות על ידי סופג מערבי. יתר על כן, יש צורך להשתמש בשליטה חיובית, כגון נוגדן מסחרי נגד RBD, ונוגדן שליטה שלילית. תוספת של חלבון Nanoluciferase מומלץ לשמש בקרה חיובית לגילוי ביולומינציה. מוצר החלבון מכיל גם תג שלו, אשר יכול לשמש לטיהור עבור מספר רב של דגימות סרום.
ישנם מספר יתרונות לשימוש ב- bioreporter זה בהשוואה לשיטות מתחרות אחרות. ראשית, משתמש מנוסה יכול לבצע את הליך הבדיקה המלא בפחות משעה, שהוא הרבה יותר מהר מאשר בדיקות קיימות כגון ELISA. שנית, דרישות ההכנה והבדיקה המינימליות הופכות את הבדיקה הזו לבעלת ערך רב לייצור בקנה מידה גדול בעלות נמוכה. יתר על כן, מגבלת הזיהוי של ה- assay נמוכה כמו 1 ננוגרם מנטרל SARS-CoV-2 כפי שתואר על ידי Azad et al.22. החיסרון של גישה זו הוא חוסר היכולת להבדיל בין איזוטיפים נוגדנים שונים. במבט קדימה, יש להשוות את רגישות הבדיקה לבדיקות סרולוגיות אחרות הנמצאות בשימוש שגרתי.
אזאד ואח. 22 השתמשו בדגימות סרום מחולים כדי להעריך את תחולת ההסתה. זה גם חיוני כי המערכת נבדקת לזיהוי נוגדנים בדגימות דם מחולים. כלי זה יכול גם להיות בעל השפעה רבה בהערכת הקשר בין חומרת COVID-19 לבין נוכחותם של נוגדנים ספציפיים SARS-CoV-2. בסך הכל, בדיקות סרולוגיות כאלה יכולות להיות בעלות השפעה משמעותית בהערכת ההשפעה האפידמיולוגית של ה- SARS-CoV-2 ויכולות להוות תחליף נוח לשיטות זיהוי גוזלות זמן ופחות רגישות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מעריכים ומודים לסיוע הטכני של שיאוהונג הוא, ריקרדו מריוס, ג'וליה פטריק, בראדלי אוסטין וכריסטיאנו טאנזה דה סוזה. אנו מודים גם למינה גהרמני על עיצוב גרפי. ברצוננו גם להודות לכל האנשים שהשתתפו ותרמו את דגימות הדם שלהם למחקר זה. DWC נתמך בחלקו על ידי הפקולטה uOttawa והמחלקה לרפואה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
