Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62488
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Biotechnology, University of Tehran

Summary

Det skisserade protokollet beskriver förfarandet för att producera HiBiT-receptor-bindande domänproteinkomplexet och dess tillämpning för snabb och känslig detektion av SARS-CoV-2 antikroppar.

Abstract

Uppkomsten av COVID-19-pandemin har ökat behovet av bättre serologiska detektionsmetoder för att fastställa den epidemiologiska effekten av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det ökande antalet SARS-CoV-2 infektioner ökar behovet av bättre antikroppsdetekteringsanalyser. Nuvarande antikroppsdetekteringsmetoder äventyrar känsligheten för hastighet eller är känsliga men tidskrävande. En stor andel sars-cov-2-neutraliserande antikroppar riktar sig mot det receptorbindande området (RBD), ett av de primära immunogena facken i SARS-CoV-2. Vi har nyligen designat och utvecklat en mycket känslig, bioluminescerande taggad RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) för att upptäcka SARS-CoV-2-antikroppar. I följande text beskrivs proceduren för att producera HiBiT-RBD-komplexet och en snabb analys för att utvärdera förekomsten av RBD-inriktade antikroppar med det här verktyget. På grund av hållbarheten hos HiBiT-RBD-proteinprodukten över ett brett spektrum av temperaturer och det kortare experimentella förfarandet som kan slutföras inom 1 h, kan protokollet betraktas som ett effektivare alternativ för att upptäcka SARS-CoV-2-antikroppar i patientserumprover.

Introduction

Den senaste tidens uppkomst av ett nytt coronavirus, SARS-CoV21, har orsakat mer än 2 800 000 dödsfall och 128 miljoner infektioner per den 30 mars 20212. På grund av bristen på ett tillförlitligt och väletablerat behandlingsförfarande för sars-cov-2 kliniska terapier, många ansträngningar har gjorts för att begränsa ytterligare viral överföring och ännu viktigare, att utveckla en effektiv och robust behandling eller ett vaccin3. Hittills finns det mer än 50 COVID-19 vaccinkandidater i prövningar som rapporterats av Världshälsoorganisationen4. Påvisande av antikroppar mot SARS-CoV-2 är av största vikt för att fastställa den långsiktiga stabiliteten i humoral respons vid administrering av vaccinet samt hos tillfrisknade patienter med covid-195. Vissa studier har visat att det finns en möjlighet att tillfrisknade SARS- CoV-2-patienter förlorar de flesta av de RBD-bindande antikropparna efter 1 år5,6,7,8,9. Ytterligare undersökningar krävs för att bättre förstå varaktig immunitet, och känsligare antikroppsdetekteringsplattformar kan bidra till att främja sådant arbete. Rapporter om ihållande immunitet av milda SARS-CoV-2 infektioner, som tyder på långsiktiga antikroppssvar, är också ett intressant och värdefullt studieområde. En snabb och exakt detektionsmetod är avgörande för övervakning av antikroppar i individers serum för att ge mer information om immunitet i befolkningen.

Liksom andra coronavirus använder SARS-CoV-2 utskjutande spikglykoprotein för att binda till angiotensinkonverterande enzym-2 (ACE2) för att initiera en kaskad av händelser som leder till fusion av virus- och cellmembranen6,7. Flera studier har nyligen visat att SPIKE-proteinets RBD har en avgörande roll för att framkalla kraftfullt och specifikt antikroppssvar mot SARS-CoV28,9,10,11. I synnerhet överensstämmer korrelationer som observerats av Premkumar et al. mellan titer av RBD-bindande antikropp och SARS-CoV-2 neutraliseringsstyrka hos patienternas plasma med RBD som ett immunogent fack i virusstrukturen9. Med detta i åtanke är många diagnostiska tester tillgängliga för sars-cov-2 antikroppsdetektering tids- och kostnadsintensiva, kräver ett långt förfarande för inkubation och tvätt (enzymlänkad immunosorbentanalys [ELISA]), eller saknar känslighet och noggrannhet (lateralt flöde immunoassay [LFIA])12. Därför skulle en kvantitativ och snabb kompletterande serologisk metod för covid-19-härledd antikroppsdetektering med hög känslighet, snabb respons och relativt låg kostnad tjäna behovet av ett tillförlitligt serologiskt test för sars-cov-2 epidemiologisk övervakning.

Sammantaget föranledde begränsningarna i nuvarande serologiska analyser undersökningen av det bioluminescerande rapporteringssystemet som ett potentiellt diagnostiskt medel i framtida serosurveys. Bioluminescens är en naturligt förekommande enzym-/substratreaktion, med ljusemission. Nanoluc luciferas är det minsta (19 kDa), men ändå det ljusaste systemet jämfört med Renilla och firefly luciferas (36 kDa respektive 61 kDa)13,14. Dessutom har Nanoluc det högsta signal-till-brusförhållandet och stabiliteten bland de tidigare nämnda systemen. Nanolucs höga signalintensitet stöder upptäckten av även mycket låga mängder reporterfusioner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) är en delad version av Nanoluc-systemet, som består av två segment: små BiT (11 aminosyror; SmBiT) och stor BiT (LgBiT) med relativt låg affinitet interaktioner (KD = 190 μM ) för att bilda ett självlysande komplex16. NanoBiT används i stor utsträckning i olika studier som involverar identifiering av protein-proteininteraktioner15,17,18,19 och cellulära signalvägar11,20,21.

Nyligen introducerades en annan liten peptid med en tydligt högre affinitet till LgBiT (KD = 0,7 nM ), nämligen HiBiT Nano-Glo-systemet, i stället för SmBiT. Nano-Glos analys av nano-glo "add-mix-read" gör HiBiT till en lämplig, kvantitativ, självlysande peptidtagg. I detta tillvägagångssätt läggs HiBiT-taggen till målproteinet genom att utveckla en konstruktion som medför minimal strukturell interferens. HibT-proteinfusion skulle aktivt binda till LgBiT-motsvarigheten och producera ett mycket aktivt luciferasenzym för att generera detekterbar bioluminescens i närvaro av detektionsreagenser (figur 1). På samma sätt utvecklade vi ett HiBiT Nano-Glo-baserat system för att enkelt mäta den neutraliserande antikroppstiter i serumet hos SARS-CoV-2 återvunna individer och utvecklade nyligen en HiBiT-märkt SARS-CoV-2 RBD. Detta dokument beskriver protokollet för att producera HiBiT-RBD bioreporter med hjälp av vanliga laboratorieprocedurer och utrustning, och visar hur denna bioreporter kan användas i en snabb och effektiv analys för att upptäcka SARS-CoV-2 RBD-mål antikroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Protokollet som beskrivs nedan följer alla etiska riktlinjer enligt protokollkod 20200371-01H.

1. Produktion och utvärdering av bioreportören för HiBiT-RBD

  1. Producera en tillräcklig mängd HibT-RBD bioreporter
    1. Förbered dig för cellkultur
      1. Förbered komplett Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) som innehåller 10% fetala nötkreatur serum och 1% penicillin/streptomycin. Värm sedan media i ett vattenbad på 37 °C.
      2. Slå på det biologiska säkerhetsskåpet (BSC) och använd 70% v/v etanol för sterilisering av skåpytan.
    2. Odla cellinjen.
      1. Ta ut cellinjen från -80 °C eller flytande kväve och tina upp den i ett 37 °C vattenbad.
        OBS: En lämplig cellinje är lätt att underhålla i kulturen, har hög transfekteringseffektivitet och är lämplig för exogen proteinproduktion. Mänskliga embryonala njure, HEK293 celler användes för detta protokoll.
      2. Blanda de tinade cellerna med minst 10 ml komplett medium, pipettera cellupphängningen till en 10 cm Petriskål och snurra plattan för att fördela cellerna i skålen jämnt. Placera skålen i en cellodlingsinkubator vid 37 °C, 5% CO2 och 85-95% luftfuktighet.
      3. Observera cellerna under mikroskopet tills sammanflödet når 80-90%. Vid hög sammanflöde, ta bort mediet, tvätta cellerna med varm fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 1 ml 0,25% trypsinetylendiamintetraättiksyra för att lossa cellerna från ytan.
        OBS: HEK293-cellerna är ganska lätta att lossna. Därför bör tvättsteget göras mycket försiktigt för att förhindra oavsiktlig avlossning och förlust av celler.
      4. Efter ca 5 min, titta på cellerna under ett mikroskop. Om alla celler flyter, tillsätt minst 4 ml medium och överför cellupphängningen till ett nytt sterilt rör. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och tillsätt 1 × 106 celler i varje brunn på en 6-brunnsplatta för transfektering.
        OBS: Efter 24 timmar ska cellerna vara vid 80% eller mer konflöde.
    3. Transfektion av HibT-RBD-plasmiden
      1. Använd 1 μg av HiBiT-RBD-uttrycksplasmiden med ett lämpligt transfekteringsreagens. Inkubera i 10-15 min vid rumstemperatur och lägg sedan till den totala volymen till varje brunn på plattan, droppmässigt.
        OBS: Följ tillverkarens transfekteringsprotokoll. I detta fall tillsattes en blandning (en angiven mängd) av transfektreagenset med DMEM till den utspädda plasmiden (1 μg) i DMEM (se tabellen över material). Använd en markör som innehåller (t.ex. grönt fluorescerande protein [GFP]) plasmid som en kontroll för att övervaka transfekteringseffektiviteten.
      2. På nästa dag, byt ut mediet som innehåller transfektblandningen med komplett medium. Observera transfekteringskontrollen väl 48 h efter transfektion.
        OBS: Om transfektionen var positiv och effektiv (mer än 80% GFP-positiv), bör cellerna vara redo för skörd av HiBiT-RBD bioreporter. Konstruktionen innehåller också His-tag, som kan användas för att erhålla renat protein i stället för den totala supernatanten.
      3. Samla supernatanten i 1,5 ml mikrorör. Tillsätt 500 μL 1x passiv lysbuffert (PLB) till cellerna; inkubera och skaka plattan i 15 minuter vid rumstemperatur för celllys.
        OBS: Supernatanten och lysatelösningen kan bevaras vid -20 °C med mindre integritetsförlust i minst 6 månader. Enligt Azad et al.22 är reportern stabil vid ett brett spektrum av pH (4-12) och temperatur (4-42 °C).
  2. Utvärdering av den självlysande signalen från biorapporteringen genom luciferasanalys
    1. Förbereda reaktionskomponenterna
      1. Använd supernatanten som källa till biorapporteringen.
        OBS: Både supernatant och lysate innehåller HiBiT-RBD bioreporter och kan användas för analysen. Supernatanten rekommenderas dock som källa av skäl som förklaras i följande anteckningar.
      2. Späd LgBiT och substratet till 1x före användning (lagerkoncentrationen är 100x).
        OBS: Se tabellen över material för mer information om LgBiT.
    2. Luciferas analys
      1. Överför 50 μL av supernatanten från varje brunn eller rör till en 96-välplatta och tillsätt 50 μL 1x LgBiT till varje brunn. Inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
      2. Öppna luminometerprogramvaran, tillsätt 50 μL 1x substrat (furimazin) till varje brunn, placera plattan i luminometern och kör programvaran.
        OBS: Tillsätt substratet omedelbart innan du läser plattan för att förhindra att substratet konsumeras av de aktiva enzymerna före signalmätning.

2. Påvisande av anti-RBD-antikroppar med en snabb och känslig analys

  1. Analys av HibT-RBD-antikroppsdetektion
    1. Förbered HiBiT-RBD bioreporter enligt beskrivningen i avsnitt 1.1 i protokollet.
      OBS : Det rekommenderas att använda supernatanten för följande analys eftersom det är enklare att samla in och innehåller den mogna glykosylerade versionen av proteinet. Dessutom har lysat flera andra proteiner som kan störa HiBiT-RBD-antikroppsinteraktionen.
    2. Kombinera 50 μL av den HiBiT-RBD-innehållande supernatanten med 1 μg av den kommersiella SARS-CoV-2-RBD-antikroppen i ett 1,5 ml mikrorör. Tillsätt 20 μL immunglobulinbindande protein (protein G) till lösningen. Öka den totala volymen till 300 μL genom att tillsätta PBS.
      OBS: Blandningens totala volym kan minskas till 150 μL. Lägre totala volymer rekommenderas inte eftersom det kan leda till otillräcklig blandning av antikroppar med biorapporteringen.
    3. Inkubera rören på en rörskakapparat eller rotator i 30 minuter. Centrifugera vid 12 000 × g i 30 s, kassera supernatanten och tvätta med PBS. Upprepa processen tre gånger för att ta bort gratis HiBiT-RBD. Sätt tillbaka i 50 μL PBS och överför till en 96-brunnsplatta.
    4. Tillsätt 50 μL 1x LgBiT och vänta i 5 min. Tillsätt sedan 50 μL 1x NanoLuc-substrat. Läs omedelbart av den självlysande signalen med en luminometer.

3. Hög genomströmningsdetektering av sars-cov-2-specifika antikroppar från patientserumprover

  1. Förbered större mängder av HiBiT-RBD bioreporter för en hög genomströmningsanalys genom att följa avsnitt 1.1 i protokollet.
  2. Kombinera 20 μL magnetiskt protein G med 50 μL av HiBiT-RBD-supernatanten i en brunn med 96-brunnsplatta för varje prov. Tillsätt 10 μL av serumprovet till varje brunn och öka den totala volymen till 150 μL genom att tillsätta PBS.
    OBS: Använd både ospecificerad IgG (negativ kontroll) och neutraliserande SARS-CoV-2 antikropp (positiv kontroll) vid 1 μg/ml-koncentration enligt beskrivningen i steg 2.1.2. Dessutom kan serumprover från vaccinerade möss också bedömas för antikroppar. I detta test erhölls serumprover från Ottawa Hospital General Campus enligt ett godkänt förfarande och med informerat samtycke från individer.
  3. Inkubera i 30 min på en shaker vid rumstemperatur. Placera plattan på en magnetbricka för att fälla ut proteinet G-antikroppskomplex.
    OBS: Den magnetiska brickans specifika struktur fäller ut komplexet på sidoväggarna på varje brunn.
  4. Kassera lösningen i mitten av varje brunn och tillsätt PBS för tvätt. Upprepa tvättsteget minst tre gånger för att ta bort överflödigt HiBiT-RBD. Tillsätt 50 μL 1x PBS och 50 μL 1x LgBiT. Inkubera i minst 5 min vid rumstemperatur.
  5. Förbered luminometerprogramvaran och tillsätt sedan 50 μL 1x substrat. Placera plattan i maskinen, kör programvaran och registrera signalerna. Jämför signalerna från serumprover, kontrollprover och bakgrund (tomma brunnar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Signalerna från både HiBit-RBD-innehållande cell lysate och supernatant av de transfected cellerna registrerades (figur 2) för att utvärdera lämplig proteinkälla. HiBiT-RBD och LgBit användes separat som kontroller, och data visade låg bakgrund jämfört med en stark signal när båda delarna kombinerades. Därför är HiBiT-RBD-interaktion med LgBiT nödvändig för att generera aktivt enzym för substratrötning och bioluminescensaktivitet (figur 1).

Tillsats av protein G kommer att bidra till antikroppsutfällning (figur 3). Analysen användes för att jämföra signalen från en kommersiell SARS-CoV-2-neutraliserande antikropp med en kontroll-IgG. Den specifika antikroppssignalen var robust, medan kontrollantikroppen hade nära den självlysande bakgrundsnivån (figur 4A). Rekombinant försvagade oncolytic vesicular stomatitis virus (VSV) med en mutation vid position 51 av M proteinet (Δ51) uttrycker exogen RBD användes för att vaccinera möss. Serumet som samlats in från vaccinerade möss gav en robust signal jämfört med ingen signal hos möss som injicerats med kontroll VSV (figur 4B).

Figure 1
Bild 1: LgBiT-interaktion med HiBiT ansluten till RBD. Vid interaktion mellan den lilla delen av nanoluciferaset, HiBiT, med enzymets stora underenhet, LgBiT, kan det aktiva enzymkomplexet producera en självlysande signal efter substratförbrukning. RBD stör inte den här processen. Förkortningar: RBD = receptorbindande domän. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Robust reporteraktivitet från både lysate och supernatant av transfekterade celler. Proteinet finns i både supernatant och lysate och ger en stark signal. Kontrollgruppernas självlysande signaler var nära bakgrunden. Felstaplar representerar standardavvikelse (SD). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Schematisk av HiBiT-RBD-interaktionen med antikroppar som är bundna till protein G. Schemat visar antikroppens utfällning med protein G och interaktion med HiBiT-RBD. Tillsatsen av LgBit till blandningen ger en robust signal när antikroppen är specifik för RBD. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: HiBiT-RBD bioreporter genererar stark bioluminescens med rena neutraliserande antikroppar, vaccinerat musserum och patientserumprover. (A) HiBiT-RBD interagerar med RBD-specifika neutraliserande antikroppar och genererar signifikant hög signal jämfört med den försumbara signalen för ospecificerad IgG. (B) Biorapporteraren kan detektera SARS-CoV-2-antikroppar i vaccinerat musserum. Förkortningar: RBD = receptorbindande domän; IgG = immunglobulin G; Ab = antikropp; VSV = vesikulärt stomatitvirus; Fluc = firefly luciferas. C) Påvisande av sars-cov-2-antikropparna i patientserumprover, som återges från Azad m.fl.22. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det ökande antalet personer som smittats med SARS-CoV-2 och den pågående ansträngningen för global vaccination kräver känsliga och snabba serologiska tester som kan användas i storskaliga serosurveys. Ny forskning visar att split nanoluciferase-baserade biorapporter kan användas för att utveckla sådana analyser. Vi utvecklade nyligen HiBiT-RBD bioreporter för att utforma ett test som kan användas för att upptäcka SARS-CoV-2-specifika antikroppar i patientserum på ett snabbt och tillförlitligt sätt (figur 4C).

Det finns några kritiska steg i denna analys. Eftersom systemets effektivitet beror på RBD-proteinuttryck bör proteinnivåerna valideras genom western blotting. Dessutom är det nödvändigt att använda en positiv kontroll, såsom en kommersiell antikropp mot RBD, och en negativ kontrollantikropp. Tillsats av ett nanoluciferasprotein rekommenderas att användas som en positiv kontroll för bioluminescensdetektering. Proteinprodukten innehåller också en His-tag, som kan användas för rening för ett stort antal serumprover.

Det finns flera fördelar med att använda denna bioreporter jämfört med andra konkurrerande metoder. För det första kan en erfaren användare utföra hela analysproceduren på mindre än en timme, vilket är betydligt snabbare än befintliga tester som ELISA. För det andra gör minimikraven för förberedelse och testning detta test mycket värdefullt för storskalig produktion till en låg kostnad. Dessutom är detektionsgränsen för analysen så låg som 1 ng av den SARS-CoV-2-neutraliserande antikroppen enligt Azad et al.22. En nackdel med detta tillvägagångssätt är oförmågan att skilja mellan olika antikroppsisotyper. Framöver bör testets känslighet jämföras med andra rutinmässigt använda serologiska tester.

Azad et al. 22 hade använt serumprover från patienter för att utvärdera analysens tillämplighet. Det är också viktigt att systemet testas för antikroppsdetektion i blodprover från patienter. Detta verktyg skulle också kunna ha stor inverkan på bedömningen av sambandet mellan covid-19:s svårighetsgrad och förekomsten av sars-cov-2-specifika antikroppar. Sammantaget kan sådana serologiska tester ha en betydande inverkan på uppskattningen av de epidemiologiska effekterna av SARS-CoV-2 och kan vara en lämplig ersättning för tidskrävande och mindre känsliga detektionsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi uppskattar och tackar den tekniska hjälpen från Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin och Christiano Tanese De Souza. Vi tackar också Mina Ghahremani för grafisk design. Vi vill också tacka alla individer som deltog och donerade sina blodprover för denna studie. DWC stöds delvis av uOttawa-fakulteten och Institutionen för medicin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x Passive Lysis Buffer Promega E194A 30 mL
Bio-Plex Handheld Magnetic Washer Bio-Rad 171020100
DMEM Sigma D6429-500ml
Dual-Glo luciferase Assay System Promega E2940 100 mL kit
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
HiBiT-RBD Plasmid gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc
LgBiT Promega N3030
penicillin Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pierce Protein G Magnetic Beads Thermo Fisher Scientific 88848
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent Signagen SL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Synergy Mx Microplate Reader BioTek 96-well plate reader luminometer
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 2520056 0.25%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
  2. Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
  3. Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
  4. World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
  5. Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
  6. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  7. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  8. Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
  9. Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
  10. Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
  11. Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
  12. Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
  13. Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
  14. Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
  15. Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
  16. Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
  17. Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
  18. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  19. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  20. Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
  21. Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
  22. Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).

Tags

Immunologi och infektion nummer 174
Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rezaei, R., Surendran, A.,… More

Rezaei, R., Surendran, A., Singaravelu, R., Jamieson, T. R., Taklifi, P., Poutou, J., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter. J. Vis. Exp. (174), e62488, doi:10.3791/62488 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter