Summary
El protocolo descrito describe el procedimiento para producir el complejo de proteínas de dominio de unión al receptor HiBiT y su aplicación para la detección rápida y sensible de anticuerpos contra el SARS-CoV-2.
Abstract
La aparición de la pandemia de COVID-19 ha aumentado la necesidad de mejores métodos de detección serológica para determinar el impacto epidemiológico del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2). El creciente número de infecciones por SARS-CoV-2 plantea la necesidad de mejores ensayos de detección de anticuerpos. Los métodos actuales de detección de anticuerpos comprometen la sensibilidad a la velocidad o son sensibles pero requieren mucho tiempo. Una gran proporción de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 se dirigen al dominio de unión al receptor (RBD), uno de los principales compartimentos inmunogénicos del SARS-CoV-2. Recientemente hemos diseñado y desarrollado un RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) altamente sensible y marcado como bioluminiscente para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2. El siguiente texto describe el procedimiento para producir el complejo HiBiT-RBD y un ensayo rápido para evaluar la presencia de anticuerpos dirigidos a RBD utilizando esta herramienta. Debido a la durabilidad del producto de proteína HiBiT-RBD en un amplio rango de temperaturas y al procedimiento experimental más corto que se puede completar en 1 h, el protocolo puede considerarse como una alternativa más eficiente para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en muestras de suero de pacientes.
Introduction
La reciente aparición de un nuevo coronavirus, el SARS-CoV21, ha causado más de 2.800.000 muertes y 128 millones de infecciones hasta el 30 de marzo de 20212. Debido a la falta de un procedimiento de tratamiento confiable y bien establecido para las terapias clínicas del SARS-CoV-2, se han realizado muchos esfuerzos para restringir la transmisión viral adicional y, lo que es más importante, para desarrollar un tratamiento efectivo y robusto o una vacuna3. Hasta la fecha, hay más de 50 vacunas candidatas contra la COVID-19 en ensayos reportados por la Organización Mundial de la Salud4. La detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 es de suma importancia para determinar la estabilidad a largo plazo de la respuesta humoral tras la administración de la vacuna, así como en pacientes recuperados de COVID-195. Algunos estudios han demostrado que existe la posibilidad de que los pacientes recuperados con SARS-CoV-2 pierdan la mayoría de los anticuerpos de unión a RBD después de 1 año5,6,7,8,9. Se requiere más investigación para comprender mejor la inmunidad duradera, y las plataformas de detección de anticuerpos más sensibles pueden ayudar a avanzar en dicho trabajo. Los informes de inmunidad sostenida de infecciones leves por SARS-CoV-2, que sugieren respuestas de anticuerpos a largo plazo, también son un área de estudio interesante y valiosa. Un método rápido y preciso de detección es esencial para monitorear los anticuerpos en los sueros de los individuos para proporcionar más información sobre la inmunidad en la población.
Al igual que otros coronavirus, el SARS-CoV-2 utiliza glicoproteína de espiga que sobresale para unirse a la enzima convertidora de angiotensina-2 (ACE2) para iniciar una cascada de eventos que conducen a la fusión de las membranas viral y celular6,7. Varios estudios han demostrado recientemente que la RBD de la proteína Spike tiene un papel crucial en la obtención de una respuesta de anticuerpos potente y específica contra el SARS-CoV28,9,10,11. En particular, las correlaciones observadas por Premkumar et al. entre el título del anticuerpo de unión a RBD y la potencia de neutralización del SARS-CoV-2 del plasma de los pacientes son consistentes con rbD siendo un compartimento inmunogénico de la estructura del virus9. Con esto en mente, muchas pruebas de diagnóstico disponibles para la detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 requieren mucho tiempo y costo, requieren un largo procedimiento de incubación y lavado (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas [ELISA]) o carecen de sensibilidad y precisión (inmunoensayo de flujo lateral [LFIA])12. Por lo tanto, un método serológico complementario cuantitativo y rápido de detección de anticuerpos derivados de COVID-19 con alta sensibilidad, respuesta rápida y costo relativamente bajo serviría a la necesidad de una prueba serológica confiable para la vigilancia epidemiológica del SARS-CoV-2.
En conjunto, las limitaciones de los ensayos serológicos actuales impulsaron la investigación del sistema de notificación bioluminiscente como un posible agente de diagnóstico en futuras seroencuestas. La bioluminiscencia es una reacción enzimática/sustrato natural, con emisión de luz. La luciferasa nanolúcida es la más pequeña (19 kDa), pero el sistema más brillante en comparación con la luciferasa Renilla y la luciérnaga (36 kDa y 61 kDa, respectivamente)13,14. Además, Nanoluc tiene la relación señal/ruido más alta y la estabilidad entre los sistemas mencionados anteriormente. La alta intensidad de señal de Nanoluc permite la detección de cantidades incluso muy bajas de fusiones de reporteros15. La Tecnología Binaria Nanoluc (NanoBiT) es una versión dividida del sistema Nanoluc, que se compone de dos segmentos: BiT pequeño (11 aminoácidos; SmBiT) y BiT grande (LgBiT) con interacciones de afinidad relativamente baja (KD = 190 μM) para formar un complejo luminiscente16. NanoBiT se utiliza ampliamente en diversos estudios que implican la identificación de interacciones proteína-proteína15,17,18,19 y vías de señalización celular11,20,21.
Recientemente, se introdujo otro pequeño péptido con una afinidad claramente mayor con LgBiT (KD = 0.7 nM), a saber, el sistema HiBiT Nano-Glo, en lugar de SmBiT. La alta afinidad y la fuerte señal del ensayo Nano-Glo "add-mix-read" hacen de HiBiT una etiqueta peptídica luminiscente, cuantitativa y adecuada. En este enfoque, la etiqueta HiBiT se agrega a la proteína objetivo mediante el desarrollo de una construcción que impone una interferencia estructural mínima. La fusión de la proteína HiBiT se uniría activamente a la contraparte lgBiT, produciendo una enzima luciferasa altamente activa para generar bioluminiscencia detectable en presencia de reactivos de detección (Figura 1). Del mismo modo, desarrollamos un sistema basado en HiBiT Nano-Glo para medir fácilmente el título de anticuerpos neutralizantes en los sueros de individuos recuperados de SARS-CoV-2 y recientemente desarrollamos un RBD sarS-CoV-2 marcado con HiBiT. Este artículo describe el protocolo para producir el bioreportaje HiBiT-RBD utilizando procedimientos y equipos de laboratorio estándar, y muestra cómo este bioreportero se puede utilizar en un ensayo rápido y eficiente para detectar anticuerpos dirigidos al SARS-CoV-2 RBD.
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Protocol
NOTA: El protocolo que se describe a continuación se adhiere a todas las pautas de ética de acuerdo con el código de protocolo 20200371-01H.
1. Producción y evaluación del bioreportaje HiBiT-RBD
- Producir una cantidad suficiente de bioreportero HiBiT-RBD
- Prepárese para el cultivo celular
- Prepare el medio Eagle modificado (DMEM) completo de Dulbecco que contenga 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina. Luego, caliente los medios en un baño de agua a 37 ° C.
- Encienda el gabinete de seguridad biológica (BSC) y use etanol v/ v al 70% para esterilizar la superficie del gabinete.
- Cultivo de la línea celular.
- Saque la línea celular de -80 °C o nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua a 37 °C.
NOTA: Una línea celular apropiada es fácil de mantener en cultivo, tiene una alta eficiencia de transfección y es adecuada para la producción de proteínas exógenas. Riñón embrionario humano, células HEK293 se utilizaron para este protocolo. - Mezcle las células descongeladas con al menos 10 ml de medio completo, pipetee la suspensión de la celda a una placa de Petri de 10 cm y gire la placa para distribuir las células en la placa de manera uniforme. Coloque el plato en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C, 5% de CO2 y 85-95% de humedad.
- Observe las células bajo el microscopio hasta que el nivel de confluencia alcance el 80-90%. A alta confluencia, retire el medio, lave las células con solución salina tamponada con fosfato tibio (PBS) y agregue 1 ml de ácido tetraacético tripsina-etilendiamina al 0,25% para separar las células de la superficie.
NOTA: Las células HEK293 se desprenden con bastante facilidad. Por lo tanto, el paso de lavado debe hacerse muy suavemente para evitar el desprendimiento accidental y la pérdida de células. - Después de aproximadamente 5 minutos, observe las células bajo un microscopio. Si todas las células están flotando, agregue al menos 4 ml de medio y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo estéril. Cuente las células usando un hemocitómetro y agregue 1 × 106 células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos para la transfección.
NOTA: Después de 24 h, las células deben estar al 80% o más confluentes.
- Saque la línea celular de -80 °C o nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua a 37 °C.
- Transfección del plásmido HiBiT-RBD
- Utilice 1 μg del plásmido de expresión HiBiT-RBD con un reactivo de transfección adecuado. Incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente, y luego agregar el volumen total a cada pocillo de la placa, en cuanto a gota.
NOTA: Siga el protocolo de transfección del fabricante. En este caso, se agregó una mezcla (una cantidad especificada) del reactivo de transfección con DMEM al plásmido diluido (1 μg) en DMEM (consulte la Tabla de Materiales). Use un marcador que contenga (por ejemplo, proteína fluorescente verde [GFP]) plásmido como control para controlar la eficiencia de la transfección. - Al día siguiente, reemplace el medio que contiene la mezcla de transfección con un medio completo. Observe bien el control de la transfección 48 h después de la transfección.
NOTA: Si la transfección fue positiva y eficiente (más del 80% GFP-positivo), las células deben estar listas para cosechar el bioreportaje HiBiT-RBD. La construcción también contiene His-tag, que se puede utilizar para obtener proteína purificada en lugar del sobrenadante total. - Recoge el sobrenadante en microtubos de 1,5 ml. Agregue 500 μL de 1x tampón de lisis pasiva (PLB) a las células; incubar y agitar la placa durante 15 min a temperatura ambiente para la lisis celular.
NOTA: El sobrenadante y la solución de lisado se pueden conservar a -20 °C con una pérdida menor de integridad durante al menos 6 meses. Según Azad et al.22, el reportero es estable a un amplio rango de pH (4-12) y temperatura (4-42 °C).
- Utilice 1 μg del plásmido de expresión HiBiT-RBD con un reactivo de transfección adecuado. Incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente, y luego agregar el volumen total a cada pocillo de la placa, en cuanto a gota.
- Prepárese para el cultivo celular
- Evaluación de la señal luminiscente del bioreportero mediante ensayo de luciferasa
- Preparación de los componentes de reacción
- Utilice el sobrenadante como fuente del bioreportero.
NOTA: Tanto el sobrenadante como el lisado contienen el bioreportaje HiBiT-RBD y se pueden usar para el ensayo. Sin embargo, el sobrenadante se recomienda como la fuente debido a las razones explicadas en las siguientes notas. - Diluya el LgBiT y el sustrato a 1x antes de su uso (la concentración de stock es de 100x).
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el LgBiT.
- Utilice el sobrenadante como fuente del bioreportero.
- Ensayo de luciferasa
- Transfiera 50 μL del sobrenadante de cada pozo o tubo a una placa de 96 pocillos, y agregue 50 μL de 1x LgBiT a cada pozo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Abra el software del luminómetro, agregue 50 μL de sustrato 1x (furimazina) a cada pozo, coloque la placa en el luminómetro y ejecute el software.
NOTA: Agregue el sustrato inmediatamente antes de leer la placa para evitar el consumo del sustrato por parte de las enzimas activas antes de la medición de la señal.
- Preparación de los componentes de reacción
2. Detección de anticuerpos anti-RBD con un ensayo rápido y sensible
- Ensayo de detección de anticuerpos HiBiT-RBD
- Prepare el bioinformador HiBiT-RBD como se describe en la sección 1.1 del protocolo.
NOTA: Se recomienda utilizar el sobrenadante para el siguiente ensayo, ya que es más sencillo de recolectar y contiene la versión glicosilada madura de la proteína. Además, el lisado tiene varias otras proteínas que podrían interferir con la interacción HiBiT-RBD-anticuerpo. - Combine 50 μL del sobrenadante que contiene HiBiT-RBD con 1 μg del anticuerpo comercial SARS-CoV-2-RBD en un microtubo de 1,5 ml. Añadir 20 μL de proteína de unión a inmunoglobulina (proteína G) a la solución. Aumente el volumen total a 300 μL agregando PBS.
NOTA: El volumen total de la mezcla se puede reducir a 150 μL. No se recomiendan volúmenes totales más bajos, ya que podría resultar en una mezcla inadecuada de anticuerpos con el bioreportero. - Incubar el tubo (s) en un agitador de tubo o rotador durante 30 min. Centrifugar a 12.000 × g durante 30 s, desechar el sobrenadante y lavar con PBS. Repita el proceso tres veces para eliminar HiBiT-RBD gratis. Resuspend en 50 μL de PBS y transfiéralo a una placa de 96 pocillos.
- Agregue 50 μL de 1x LgBiT y espere 5 min. Luego, agregue 50 μL de sustrato NanoLuc 1x. Lea inmediatamente la señal luminiscente con un luminómetro.
- Prepare el bioinformador HiBiT-RBD como se describe en la sección 1.1 del protocolo.
3. Detección de alto rendimiento de los anticuerpos específicos del SARS-CoV-2 a partir de muestras de suero de pacientes
- Prepare grandes cantidades del bioinformador HiBiT-RBD para un ensayo de alto rendimiento siguiendo la sección 1.1 del protocolo.
- Combine 20 μL de proteína magnética G con 50 μL del sobrenadante HiBiT-RBD en un pocillo de placa de 96 pocillos para cada muestra. Agregue 10 μL de la muestra de suero a cada pocillo y eleve el volumen total a 150 μL agregando PBS.
NOTA: Utilice tanto IgG inespecífico (control negativo) como anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2 (control positivo) a una concentración de 1 μg/ml como se describe en el paso 2.1.2. Además, las muestras de suero de ratones vacunados también se pueden evaluar para detectar anticuerpos. En esta prueba, se obtuvieron muestras de suero del Ottawa Hospital General Campus bajo un procedimiento aprobado y con el consentimiento informado de las personas. - Incubar durante 30 min en un agitador a temperatura ambiente. Coloque la placa en una lavadora magnética para precipitar el complejo proteína G-anticuerpo.
NOTA: La estructura específica de la lavadora magnética precipitará el complejo en las paredes laterales de cada pozo. - Deseche la solución en la sección central de cada pozo y agregue PBS para lavar. Repita el paso de lavado al menos tres veces para eliminar el exceso de HiBiT-RBD. Añadir 50 μL de 1x PBS y 50 μL de 1x LgBiT. Incubar durante al menos 5 min a temperatura ambiente.
- Prepare el software del luminómetro y luego agregue 50 μL de sustrato 1x. Coloque la placa en la máquina, ejecute el software y registre las señales. Compare las señales de muestras de suero, muestras de control y fondo (pozos vacíos).
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Representative Results
Se registraron las señales tanto del lisado celular que contiene HiBit-RBD como del sobrenadante de las células transfectadas (Figura 2) para evaluar la fuente de proteína apropiada. HiBiT-RBD y LgBit se utilizaron por separado como controles, y los datos mostraron un fondo bajo en comparación con una señal fuerte cuando se combinaron ambas partes. Por lo tanto, la interacción HiBiT-RBD con LgBiT es necesaria para generar enzima activa para la digestión del sustrato y la actividad de bioluminiscencia (Figura 1).
La adición de proteína G ayudará a la precipitación de anticuerpos (Figura 3). El ensayo se utilizó para comparar la señal de un anticuerpo neutralizante comercial del SARS-CoV-2 con una IgG de control. La señal de anticuerpo específica fue robusta, mientras que el anticuerpo de control tenía cerca del nivel de fondo luminiscente (Figura 4A). Para vacunar ratones se utilizó el virus de la estomatitis vesicular (VSV) atenuado recombinante con una mutación en la posición 51 de la proteína M (Δ51) que expresa RBD exógena. El suero recolectado de ratones vacunados produjo una señal robusta en comparación con ninguna señal en ratones inyectados con VSV de control (Figura 4B).
Figura 1: Interacción lgBiT con HiBiT conectado a RBD. Tras la interacción de la pequeña porción de la nanolucidaferasa, HiBiT, con la gran subunidad de la enzima, LgBiT, el complejo enzimático activo puede producir una señal luminiscente después del consumo de sustrato. El RBD no interfiere con este proceso. Abreviaturas: RBD = dominio de unión al receptor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Actividad reportera robusta tanto del lisado como del sobrenadante de células transfectadas. La proteína está presente tanto en el sobrenadante como en el lisado y produce una señal fuerte. Las señales luminiscentes de los grupos de control estaban cerca del fondo. Las barras de error representan la desviación estándar (DE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de la interacción HiBiT-RBD con anticuerpos unidos a la proteína G. El esquema representa la precipitación de anticuerpos por la proteína G y la interacción con HiBiT-RBD. La adición del LgBit a la mezcla producirá una señal robusta cuando el anticuerpo sea específico para RBD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El bioreportaje HiBiT-RBD genera una fuerte bioluminiscencia con anticuerpos neutralizantes purificados, suero de ratón vacunado y muestras de suero de pacientes. (A) HiBiT-RBD interactúa con el anticuerpo neutralizante específico de RBD y genera una señal significativamente alta en comparación con la señal insignificante para IgG inespecífica. (B) El bioreportero puede detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en suero de ratón vacunado. Abreviaturas: RBD = dominio de unión al receptor; IgG = inmunoglobulina G; Ab = anticuerpo; VSV = virus de la estomatitis vesicular; Fluc = luciérnaga luciferasa. (C) Detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en muestras de suero de pacientes, reproducidos a partir de Azad et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El creciente número de personas infectadas con el SARS-CoV-2 y el esfuerzo continuo para la vacunación mundial requieren pruebas serológicas sensibles y rápidas que puedan usarse en seroencuestas a gran escala. Investigaciones recientes muestran que los bioreporteros basados en nanoluciferasa dividida se pueden utilizar para desarrollar tales ensayos. Recientemente desarrollamos el bioreportaje HiBiT-RBD para diseñar una prueba que se puede utilizar para detectar anticuerpos específicos del SARS-CoV-2 en el suero del paciente de una manera rápida y confiable (Figura 4C).
Hay algunos pasos críticos en este ensayo. Debido a que la eficiencia del sistema depende de la expresión de la proteína RBD, los niveles de proteína deben ser validados por western blotting. Además, es necesario utilizar un control positivo, como un anticuerpo comercial contra RBD, y un anticuerpo de control negativo. Se recomienda la adición de una proteína Nanoluciferasa para ser utilizada como un control positivo para la detección de bioluminiscencia. El producto proteico también contiene una etiqueta His, que se puede utilizar para la purificación de un gran número de muestras de suero.
Hay varias ventajas en el uso de este bioreportero en comparación con otros métodos de la competencia. Primero, un usuario experimentado puede realizar el procedimiento de ensayo completo en menos de una hora, que es considerablemente más rápido que las pruebas existentes como ELISA. En segundo lugar, los requisitos mínimos de preparación y prueba hacen que esta prueba sea muy valiosa para la producción a gran escala a un bajo costo. Además, el límite de detección del ensayo es tan bajo como 1 ng del anticuerpo neutralizante del SARS-CoV-2 descrito por Azad et al.22. Un inconveniente de este enfoque es la incapacidad de diferenciar entre diferentes isotipos de anticuerpos. En el futuro, la sensibilidad de la prueba debe compararse con otras pruebas serológicas utilizadas rutinariamente.
Azad et al. 22 habían utilizado muestras de suero de pacientes para evaluar la aplicabilidad del ensayo. También es esencial que el sistema se pruebe para la detección de anticuerpos en muestras de sangre de pacientes. Esta herramienta también podría ser muy impactante en la evaluación de la correlación entre la gravedad de COVID-19 y la presencia de anticuerpos específicos para sars-CoV-2. En general, tales pruebas serológicas podrían tener un impacto sustancial en la estimación del impacto epidemiológico del SARS-CoV-2 y pueden ser un sustituto conveniente de los métodos de detección que consumen mucho tiempo y son menos sensibles.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos y agradecemos la asistencia técnica de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin y Christiano Tanese De Souza. También agradecemos a Mina Ghahremani por el diseño gráfico. También nos gustaría agradecer a todas las personas que participaron y donaron sus muestras de sangre para este estudio. DWC es apoyado en parte por la Facultad y el Departamento de Medicina de uOttawa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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