Summary
Описанный протокол описывает процедуру получения белкового комплекса HiBiT-рецептор-связывающего домена и его применение для быстрого и чувствительного обнаружения антител к SARS-CoV-2.
Abstract
Появление пандемии COVID-19 увеличило потребность в более совершенных серологических методах выявления для определения эпидемиологического воздействия тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2). Растущее число инфекций SARS-CoV-2 повышает потребность в лучших анализах обнаружения антител. Современные методы обнаружения антител ставят под угрозу чувствительность для скорости или являются чувствительными, но отнимают много времени. Большая часть SARS-CoV-2-нейтрализующих антител нацелена на рецептор-связывающий домен (RBD), один из первичных иммуногенных компартментов SARS-CoV-2. Недавно мы спроектировали и разработали высокочувствительный, биолюминесцентный RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) для обнаружения антител к SARS-CoV-2. В следующем тексте описывается процедура получения комплекса HiBiT-RBD и быстрый анализ для оценки наличия антител, нацеленных на RBD, с использованием этого инструмента. Благодаря долговечности белкового продукта HiBiT-RBD в широком диапазоне температур и более короткой экспериментальной процедуре, которая может быть завершена в течение 1 ч, протокол можно рассматривать как более эффективную альтернативу для обнаружения антител к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки крови пациента.
Introduction
Недавнее появление нового коронавируса SARS-CoV21 вызвало более 2 800 000 смертельных случаев и 128 миллионов инфекций по состоянию на 30 марта 20212 года. Из-за отсутствия надежной и хорошо отлаженной процедуры лечения для клинической терапии SARS-CoV-2 было предпринято много усилий по ограничению дальнейшей передачи вируса и, что более важно, по разработке эффективного и надежного лечения или вакцины3. На сегодняшний день в испытаниях, о которых сообщила Всемирная организация здравоохранения4, насчитывается более 50 вакцин-кандидатов на вакцину от COVID-19. Выявление антител против SARS-CoV-2 имеет первостепенное значение для определения долгосрочной стабильности гуморального ответа при введении вакцины, а также у выздоровевших пациентов с COVID-195. Некоторые исследования показали, что существует вероятность того, что выздоровевшие пациенты с SARS-CoV-2 теряют большую часть RBD-связывающих антител через 1 год5,6,7,8,9. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять устойчивый иммунитет, и более чувствительные платформы обнаружения антител могут помочь в дальнейшей такой работе. Сообщения о устойчивом иммунитете к легким инфекциям SARS-CoV-2, которые предполагают долгосрочные реакции антител, также являются интересной и стоящей областью исследования. Быстрый и точный метод обнаружения необходим для мониторинга антител в сыворотках людей, чтобы предоставить больше информации об иммунитете в популяции.
Как и другие коронавирусы, SARS-CoV-2 использует выступающий шип гликопротеин для связывания с ангиотензинпревращающим ферментом-2 (ACE2), чтобы инициировать каскад событий, которые приводят к слиянию вирусной и клеточной мембран6,7. Несколько исследований недавно доказали, что RBD белка Spike играет решающую роль в получении мощного и специфического ответа антител против SARS-CoV28,9,10,11. В частности, корреляции, наблюдаемые Premkumar et al. между титром RBD-связывающего антитела и эффективностью нейтрализации SARS-CoV-2 плазмы пациентов, согласуются с тем, что RBD является иммуногенным компартментом структуры вируса9. Имея это в виду, многие диагностические тесты, доступные для обнаружения антител к SARS-CoV-2, являются трудоемкими и дорогостоящими, требуют длительной процедуры инкубации и промывки (иммуноферментный анализ [ИФА]) или отсутствия чувствительности и точности (иммуноанализ бокового потока [LFIA])12. Таким образом, количественный и быстрый комплементарный серологический метод обнаружения антител, полученных из COVID-19, с высокой чувствительностью, быстрым ответом и относительно низкой стоимостью, послужил бы необходимости в надежном серологическом тесте для эпидемиологического эпиднадзора SARS-CoV-2.
В совокупности ограничения текущих серологических анализов побудили к исследованию системы биолюминесцентной отчетности в качестве потенциального диагностического агента в будущих серообследовании. Биолюминесценция представляет собой естественную реакцию фермента / субстрата с излучением света. Нанолюк люцифераза является самой маленькой (19 кДа), но самой яркой системой по сравнению с Люциферазой Рениллы и светлячка (36 кДа и 61 кДа соответственно)13,14. Кроме того, Nanoluc имеет самое высокое отношение сигнал/шум и стабильность среди ранее упомянутых систем. Высокая интенсивность сигнала Nanoluc поддерживает обнаружение даже очень низких количеств репортерных слияний15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) представляет собой разделенную версию системы Nanoluc, которая состоит из двух сегментов: малого BiT (11 аминокислот; SmBiT) и большой BiT (LgBiT) с относительно низкими аффинными взаимодействиями (KD = 190 мкМ) с образованием люминесцентного комплекса16. NanoBiT широко используется в различных исследованиях, включающих идентификацию белково-белковых взаимодействий15,17,18,19 и клеточных сигнальных путей11,20,21.
Недавно вместо SmBiT был введен еще один небольшой пептид с явно более высоким сродством к LgBiT (KD = 0,7 нМ), а именно система HiBiT Nano-Glo. Высокое сродство и сильный сигнал анализа Nano-Glo «add-mix-read» делает HiBiT подходящей, количественной, люминесцентной пептидной меткой. В этом подходе тег HiBiT добавляется к белку-мишени путем разработки конструкции, накладывающей минимальные структурные помехи. Слияние HiBiT-белка будет активно связываться с аналогом LgBiT, производя высокоактивный фермент люциферазы для генерации обнаруживаемой биолюминесценции в присутствии реагентов обнаружения (рисунок 1). Аналогичным образом, мы разработали систему на основе HiBiT Nano-Glo для легкого измерения титра нейтрализующих антител в сыворотках выздоровевших людей SARS-CoV-2 и недавно разработали HIBiT-помеченный SARS-CoV-2 RBD. В этой статье описывается протокол производства биорепортера HiBiT-RBD с использованием стандартных лабораторных процедур и оборудования, и показано, как этот биорепортер может быть использован в быстром и эффективном анализе для обнаружения антител, нацеленных на SARS-CoV-2 RBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный ниже, придерживается всех этических принципов в соответствии с протокольным кодом 20200371-01H.
1. Производство и оценка биорепортера HiBiT-RBD
- Производство достаточного количества биорепортера HiBiT-RBD
- Подготовка к культуре клеток
- Приготовьте полную модифицированную среду Dulbecco Eagle (DMEM), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Затем согрейте среду на водяной бане с температурой 37 °C.
- Включите шкаф биологической безопасности (BSC) и используйте этанол 70% v/v для стерилизации поверхности шкафа.
- Культивируйте клеточную линию.
- Выньте клеточную линию от -80 °C или жидкого азота и разморозьте ее на водяной бане при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующая клеточная линия легко поддерживается в культуре, обладает высокой эффективностью трансфекции и подходит для производства экзогенного белка. Для этого протокола использовались эмбриональные почки человека, клетки HEK293. - Смешайте размороженные клетки с по меньшей мере 10 мл полной среды, пипеткой клеточную суспензию в чашку Петри 10 см и закрутите пластину, чтобы равномерно распределить ячейки в чашке. Поместите чашку в инкубатор клеточных культур при температуре 37 °C, 5% CO2 и влажности 85-95%.
- Наблюдайте за клетками под микроскопом до тех пор, пока уровень слияния не достигнет 80-90%. При высокой стечении удаляют среду, промывают клетки теплым фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и добавляют 1 мл 0,25% трипсин-этилендиаминовой тетрауксусной кислоты для отделения клеток от поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки HEK293 довольно легко отсоединяются. Следовательно, этап промывки должен быть выполнен очень осторожно, чтобы предотвратить случайное отслоение и потерю клеток. - Примерно через 5 минут посмотрите на клетки под микроскопом. Если все клетки плавают, добавьте не менее 4 мл среды и перенесите клеточную суспензию в новую стерильную трубку. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и добавьте 1 × 106 клеток в каждую лунку 6-луночной пластины для трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 24 ч клетки должны быть на 80% или более сливающихся.
- Выньте клеточную линию от -80 °C или жидкого азота и разморозьте ее на водяной бане при температуре 37 °C.
- Трансфекция плазмиды HiBiT-RBD
- Используйте 1 мкг экспрессионной плазмиды HiBiT-RBD с подходящим трансфекционным реагентом. Инкубировать в течение 10-15 мин при комнатной температуре, а затем добавлять общий объем к каждой лунке пластины, по каплям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте протоколу трансфекции производителя. В этом случае к разбавленной плазмиде (1 мкг) в ДМЭМ добавляли смесь (указанное количество) трансфекционного реагента с ДМЭМ (см. Таблицу материалов). Используйте маркер, содержащий (например, зеленый флуоресцентный белок [GFP]) плазмиду в качестве контроля для мониторинга эффективности трансфекции. - На следующий день замените среду, содержащую трансфекционную смесь, на полную среду. Соблюдайте контроль трансфекции хорошо через 48 ч после трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если трансфекция была положительной и эффективной (более 80% GFP-положительной), клетки должны быть готовы к сбору биорепортера HiBiT-RBD. Конструкция также содержит His-tag, который можно использовать для получения очищенного белка вместо общего супернатанта. - Соберите супернатант в микротрубки объемом 1,5 мл. Добавьте 500 мкл 1x пассивного лизисного буфера (PLB) в клетки; инкубировать и встряхивать пластину в течение 15 мин при комнатной температуре для лизиса клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант и раствор лизата могут сохраняться при -20 °C с незначительной потерей целостности в течение не менее 6 месяцев. Согласно Azad et al.22, репортер стабилен в широком диапазоне рН (4-12) и температуры (4-42 °C).
- Используйте 1 мкг экспрессионной плазмиды HiBiT-RBD с подходящим трансфекционным реагентом. Инкубировать в течение 10-15 мин при комнатной температуре, а затем добавлять общий объем к каждой лунке пластины, по каплям.
- Подготовка к культуре клеток
- Оценка люминесцентного сигнала от биорепортера с помощью анализа люциферазы
- Подготовка реакционных компонентов
- Используйте супернатант в качестве источника биорепортера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как супернатант, так и лизат содержат биорепортер HiBiT-RBD и могут быть использованы для анализа. Тем не менее, супернатант рекомендуется в качестве источника по причинам, описанным в следующих примечаниях. - Разбавить LgBiT и субстрат до 1х перед использованием (концентрация запаса 100х).
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о LgBiT.
- Используйте супернатант в качестве источника биорепортера.
- Анализ люциферазы
- Перенесите 50 мкл супернатанта из каждой скважины или трубы в 96-луночную пластину и добавьте 50 мкл 1x LgBiT в каждую скважину. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Откройте программное обеспечение люминометра, добавьте 50 мкл 1x подложки (фуримазина) в каждую скважину, поместите пластину в люминометр и запустите программное обеспечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте субстрат непосредственно перед считыванием пластины, чтобы предотвратить потребление субстрата активными ферментами перед измерением сигнала.
- Подготовка реакционных компонентов
2. Обнаружение антител против RBD с помощью быстрого и чувствительного анализа
- Анализ обнаружения антител HiBiT-RBD
- Подготовьте биорепортер HiBiT-RBD, как описано в разделе 1.1 протокола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать супернатант для следующего анализа, так как он проще в сборе и содержит зрелую гликозилированную версию белка. Кроме того, лизат имеет несколько других белков, которые могут вмешиваться во взаимодействие HiBiT-RBD-антител. - Объедините 50 мкл HiBiT-RBD-содержащего супернатанта с 1 мкг коммерческого антитела SARS-CoV-2-RBD в микропробирке объемом 1,5 мл. Добавьте в раствор 20 мкл иммуноглобулин-связывающего белка (белка G). Доведите общий объем до 300 мкл, добавив PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем смеси может быть уменьшен до 150 мкл. Более низкие общие объемы не рекомендуются, так как это может привести к недостаточному смешиванию антител с биорепортером. - Инкубируйте трубку (трубки) на шейкере или ротаторе в течение 30 минут. Центрифуга при 12 000 × г в течение 30 с, выбросьте супернатант и промывайте PBS. Повторите этот процесс три раза, чтобы удалить свободный HiBiT-RBD. Повторное суспендирование в 50 мкл PBS и перенос на 96-луночную пластину.
- Добавьте 50 мкл 1x LgBiT и подождите 5 минут. Затем добавьте 50 мкл 1x подложки NanoLuc. Немедленно считывание люминесцентного сигнала с помощью люминометра.
- Подготовьте биорепортер HiBiT-RBD, как описано в разделе 1.1 протокола.
3. Высокопроизводительное обнаружение специфических антител к SARS-CoV-2 из образцов сыворотки крови пациента
- Подготовьте большие количества биорепортера HiBiT-RBD для высокопроизводительного анализа, следуя разделу 1.1 протокола.
- Объедините 20 мкл магнитного белка G с 50 мкл супернатанта HiBiT-RBD в скважине из 96-луночной пластины для каждого образца. Добавьте 10 мкл образца сыворотки в каждую лунку и доведите общий объем до 150 мкл, добавив PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте как неспецифический IgG (отрицательный контроль), так и нейтрализующее антитело к SARS-CoV-2 (положительный контроль) при концентрации 1 мкг/мл, как описано на этапе 2.1.2. Кроме того, образцы сыворотки от вакцинированных мышей также могут быть оценены на антитела. В этом тесте образцы сыворотки были получены из общего кампуса больницы Оттавы в соответствии с утвержденной процедурой и с информированного согласия отдельных лиц. - Инкубировать в течение 30 мин на шейкере при комнатной температуре. Поместите пластину на магнитную шайбу, чтобы вывести в осадок белковый комплекс G-антител.
ПРИМЕЧАНИЕ: Специфическая структура магнитной шайбы будет осваивать комплекс на боковых стенках каждой скважины. - Выбросьте раствор в средней части каждой лунки, и добавьте PBS для промывки. Повторите этап стирки не менее трех раз, чтобы удалить избыток HiBiT-RBD. Добавьте 50 мкл 1x PBS и 50 мкл 1x LgBiT. Инкубировать не менее 5 мин при комнатной температуре.
- Подготовьте программное обеспечение люминометра, а затем добавьте 50 мкл 1x подложки. Поместите пластину в машину, запустите программное обеспечение и запишите сигналы. Сравните сигналы от образцов сыворотки, контрольных образцов и фоновых (пустых скважин).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сигналы как от HiBit-RBD-содержащего клеточного лизата, так и от супернатанта трансфектированных клеток были записаны (рисунок 2) для оценки соответствующего источника белка. HiBiT-RBD и LgBit использовались отдельно в качестве элементов управления, и данные показали низкий фон по сравнению с сильным сигналом, когда обе части были объединены. Следовательно, взаимодействие HiBiT-RBD с LgBiT необходимо для генерации активного фермента для переваривания субстрата и биолюминесцентной активности (рисунок 1).
Добавление белка G поможет осаждению антител (рисунок 3). Анализ использовался для сравнения сигнала от коммерческого антитела, нейтрализующего SARS-CoV-2, с контрольным IgG. Специфический сигнал антитела был надежным, в то время как контрольное антитело имело близкий к люминесцентному фоновому уровню (рисунок 4А). Рекомбинантный ослабленный онколитический вирус везикулярного стоматита (VSV) с мутацией в позиции 51 белка M (Δ51), экспрессирующего экзогенный RBD, использовался для вакцинации мышей. Сыворотка, собранная у вакцинированных мышей, производила надежный сигнал по сравнению с отсутствием сигнала у мышей, которым вводили контрольный VSV (рисунок 4B).
Рисунок 1: Взаимодействие LgBiT с HiBiT, подключенным к RBD. При взаимодействии небольшой части нанолуциферазы, HiBiT, с большой субъединицей фермента LgBiT активный ферментный комплекс может продуцировать люминесцентный сигнал после потребления субстрата. RBD не вмешивается в этот процесс. Сокращения: RBD = рецептор-связывающий домен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Надежная репортерная активность как лизата, так и супернатанта трансфектированных клеток. Белок присутствует как в надводном веществе, так и в лизате и производит сильный сигнал. Люминесцентные сигналы контрольных групп были близки к фону. Полосы погрешностей представляют стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схема взаимодействия HiBiT-RBD с антителами, связанными с белком G. На схеме изображено осаждение антител белком G и взаимодействие с HiBiT-RBD. Добавление LgBit к смеси будет производить надежный сигнал, когда антитело специфично для RBD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Биорепортер HiBiT-RBD генерирует сильную биолюминесценцию с очищенными нейтрализующими антителами, вакцинированной сывороткой мыши и образцами сыворотки пациента. (A) HiBiT-RBD взаимодействует с RBD-специфическим нейтрализующим антителом и генерирует значительно высокий сигнал по сравнению с незначительным сигналом для неспецифического IgG. (B) Биорепортер может обнаружить антитела к SARS-CoV-2 в вакцинированной сыворотке мыши. Сокращения: RBD = рецептор-связывающий домен; IgG = иммуноглобулин G; Ab = антитело; VSV = вирус везикулярного стоматита; Fluc = светлячок люцифераза. (C) Обнаружение антител к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки пациентов, воспроизведенных из Azad et al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Растущее число людей, инфицированных SARS-CoV-2, и продолжающиеся усилия по глобальной вакцинации требуют чувствительных и быстрых серологических тестов, которые могут быть использованы в крупномасштабных серообследовании. Недавние исследования показывают, что биорепортеры на основе расщепленной нанолюциферазы могут быть использованы для разработки таких анализов. Недавно мы разработали биорепортер HiBiT-RBD для разработки теста, который можно использовать для быстрого и надежного обнаружения специфических антител к SARS-CoV-2 в сыворотке крови пациента (рисунок 4C).
В этом анализе есть несколько важных шагов. Поскольку эффективность системы зависит от экспрессии белка RBD, уровни белка должны быть подтверждены западным блоттингом. Кроме того, необходимо использовать положительный контроль, такой как коммерческое антитело против RBD, и отрицательное контрольное антитело. Добавление белка нанолюциферазы рекомендуется использовать в качестве положительного контроля для обнаружения биолюминесценции. Белковый продукт также содержит His-tag, который можно использовать для очистки большого количества образцов сыворотки.
Есть несколько преимуществ использования этого биорепортера по сравнению с другими конкурирующими методами. Во-первых, опытный пользователь может выполнить полную процедуру анализа менее чем за один час, что значительно быстрее, чем существующие тесты, такие как ИФА. Во-вторых, минимальные требования к подготовке и тестированию делают этот тест очень ценным для крупномасштабного производства при низких затратах. Кроме того, предел обнаружения анализа составляет всего 1 нг нейтрализующего SARS-CoV-2 антитела, как описано Azad et al.22. Недостатком такого подхода является невозможность дифференцировать различные изотипы антител. Двигаясь вперед, чувствительность теста следует сравнивать с другими обычно используемыми серологическими тестами.
Азад и др. 22 использовали образцы сыворотки от пациентов для оценки применимости анализа. Также важно, чтобы система тестировалась на обнаружение антител в образцах крови пациентов. Этот инструмент также может оказать большое влияние на оценку корреляции между тяжестью COVID-19 и наличием специфических антител к SARS-CoV-2. В целом, такие серологические тесты могут оказать существенное влияние на оценку эпидемиологического воздействия SARS-CoV-2 и могут стать удобной заменой трудоемким и менее чувствительным методам обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы ценим и благодарим за техническую помощь Сяохун Хэ, Рикардо Мариуса, Джулии Петрик, Брэдли Остина и Кристиано Танезе Де Соуза. Мы также благодарим Мину Гахремани за графический дизайн. Мы также хотели бы поблагодарить всех людей, которые приняли участие и сдали свои образцы крови для этого исследования. DWC частично поддерживается факультетом uOttawa и кафедрой медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
