Summary
Het geschetste protocol beschrijft de procedure voor de productie van het HiBiT-receptor-bindende domeineiwitcomplex en de toepassing ervan voor snelle en gevoelige detectie van SARS-CoV-2-antilichamen.
Abstract
De opkomst van de COVID-19-pandemie heeft de behoefte aan betere serologische detectiemethoden vergroot om de epidemiologische impact van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) te bepalen. Het toenemende aantal SARS-CoV-2-infecties verhoogt de behoefte aan betere antilichaamdetectietests. De huidige antilichaamdetectiemethoden brengen de gevoeligheid voor snelheid in gevaar of zijn gevoelig maar tijdrovend. Een groot deel van de SARS-CoV-2-neutraliserende antilichamen richt zich op het receptorbindende domein (RBD), een van de primaire immunogene compartimenten van SARS-CoV-2. We hebben onlangs een zeer gevoelige, bioluminescente RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) ontworpen en ontwikkeld om SARS-CoV-2-antilichamen te detecteren. De volgende tekst beschrijft de procedure om het HiBiT-RBD-complex te produceren en een snelle test om de aanwezigheid van RBD-gerichte antilichamen met behulp van deze tool te evalueren. Vanwege de duurzaamheid van het HiBiT-RBD-eiwitproduct over een breed temperatuurbereik en de kortere experimentele procedure die binnen 1 uur kan worden voltooid, kan het protocol worden beschouwd als een efficiënter alternatief om SARS-CoV-2-antilichamen in serummonsters van patiënten te detecteren.
Introduction
De recente opkomst van een nieuw coronavirus, SARS-CoV21, heeft op 30 maart 20212 meer dan 2.800.000 doden en 128 miljoen besmettingen veroorzaakt. Vanwege het ontbreken van een betrouwbare en gevestigde behandelingsprocedure voor sars-cov-2 klinische therapieën, zijn er veel inspanningen geleverd om verdere virale overdracht te beperken en nog belangrijker, om een effectieve en robuuste behandeling of een vaccin te ontwikkelen3. Tot op heden zijn er meer dan 50 COVID-19-vaccinkandidaten in onderzoeken gerapporteerd door de Wereldgezondheidsorganisatie4. Detectie van antilichamen tegen SARS-CoV-2 is van het grootste belang om de stabiliteit op lange termijn van de humorale respons bij toediening van het vaccin en bij herstelde patiënten van COVID-195 te bepalen. Sommige studies hebben aangetoond dat er een mogelijkheid is dat herstelde SARS-CoV-2-patiënten de meeste RBD-bindende antilichamen verliezen na 1 jaar5,6,7,8,9. Verder onderzoek is nodig om blijvende immuniteit beter te begrijpen, en meer gevoelige antilichaamdetectieplatforms kunnen dergelijk werk helpen bevorderen. Meldingen van aanhoudende immuniteit van milde SARS-CoV-2-infecties, die langdurige antilichaamresponsen suggereren, is ook een interessant en de moeite waard studiegebied. Een snelle en nauwkeurige detectiemethode is essentieel voor het monitoren van antilichamen in de sera van individuen om meer informatie te geven over immuniteit in de populatie.
Net als andere coronavirussen gebruikt SARS-CoV-2 uitstekende spike glycoproteïne om te binden aan angiotensine-converterend enzym-2 (ACE2) om een cascade van gebeurtenissen te initiëren die leiden tot de fusie van de virale en celmembranen6,7. Verschillende studies hebben onlangs aangetoond dat de RBD van het Spike-eiwit een cruciale rol speelt bij het opwekken van een krachtige en specifieke antilichaamrespons tegen SARS-CoV28,9,10,11. In het bijzonder zijn correlaties waargenomen door Premkumar et al. tussen de titer van RBD-bindend antilichaam en SARS-CoV-2 neutralisatiepotentie van het plasma van patiënten consistent met RBD als een immunogeen compartiment van de virusstructuur9. Met dat in gedachten zijn veel diagnostische tests die beschikbaar zijn voor SARS-CoV-2-antilichaamdetectie tijd- en kostenintensief, vereisen ze een langdurige procedure van incubatie en wassen (enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA]), of missen ze gevoeligheid en nauwkeurigheid (laterale flow immunoassay [LFIA])12. Daarom zou een kwantitatieve en snelle complementaire serologische methode van covid-19-afgeleide antilichaamdetectie met hoge gevoeligheid, snelle respons en relatief lage kosten voldoen aan de behoefte aan een betrouwbare serologische test voor SARS-CoV-2 epidemiologische surveillance.
Gezamenlijk hebben de beperkingen van de huidige serologische assays geleid tot het onderzoek van het bioluminescente rapportagesysteem als een potentieel diagnostisch middel in toekomstige serosurveys. Bioluminescentie is een natuurlijk voorkomende enzym/substraatreactie, met lichtemissie. Nanoluc luciferase is het kleinste (19 kDa), maar toch het helderste systeem in vergelijking met Renilla en firefly luciferase (respectievelijk 36 kDa en 61 kDa)13,14. Verder heeft Nanoluc de hoogste signaal/ruisverhouding en stabiliteit van de eerder genoemde systemen. De hoge signaalintensiteit van Nanoluc ondersteunt de detectie van zelfs zeer lage hoeveelheden reporterfusies15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) is een gesplitste versie van het Nanoluc-systeem, dat bestaat uit twee segmenten: kleine BiT (11 aminozuren; SmBiT) en grote BiT (LgBiT) met relatief lage affiniteitsinteracties (KD = 190 μM ) om een luminescerend complex te vormen16. NanoBiT wordt op grote schaal gebruikt in verschillende studies met betrekking tot de identificatie van eiwit-eiwitinteracties15,17,18,19 en cellulaire signaalroutes11,20,21.
Onlangs werd een ander klein peptide met een duidelijk hogere affiniteit voor LgBiT (KD = 0,7 nM) geïntroduceerd, namelijk het HiBiT Nano-Glo-systeem, in plaats van SmBiT. De hoge affiniteit en het sterke signaal van de Nano-Glo "add-mix-read" assay maakt HiBiT een geschikte, kwantitatieve, luminescerende peptide tag. In deze benadering wordt de HiBiT-tag toegevoegd aan het doeleiwit door een constructie te ontwikkelen die minimale structurele interferentie oplegt. HiBiT-eiwitfusie zou actief binden aan de LgBiT-tegenhanger, waardoor een zeer actief luciferase-enzym wordt geproduceerd om detecteerbare bioluminescentie te genereren in aanwezigheid van detectiereagentia (figuur 1). Op dezelfde manier ontwikkelden we een HiBiT Nano-Glo-gebaseerd systeem om de neutraliserende antilichaamtiter gemakkelijk te meten in de sera van SARS-CoV-2 herstelde individuen en ontwikkelden we onlangs een HiBiT-tagged SARS-CoV-2 RBD. Dit artikel beschrijft het protocol voor het produceren van de HiBiT-RBD bioreporter met behulp van standaard laboratoriumprocedures en apparatuur, en laat zien hoe deze bioreporter kan worden gebruikt in een snelle en efficiënte test om SARS-CoV-2 RBD-gerichte antilichamen te detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het hieronder beschreven protocol voldoet aan alle ethische richtlijnen volgens protocolcode 20200371-01H.
1. Productie en evaluatie van de HiBiT-RBD bioreporter
- Productie van een voldoende hoeveelheid HiBiT-RBD bioreporter
- Bereid je voor op celkweek
- Bereid het gemodificeerde Eagle medium (DMEM) van Dulbecco met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline /streptomycine volledig voor. Verwarm vervolgens de media in een waterbad van 37 °C.
- Zet de biologische veiligheidskast (BSC) aan en gebruik 70% v/v ethanol voor het steriliseren van het kastoppervlak.
- Kweek de cellijn.
- Haal de cellijn uit -80 °C of vloeibare stikstof en ontdooi deze in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Een geschikte cellijn is gemakkelijk te onderhouden in cultuur, heeft een hoge transfectie-efficiëntie en is geschikt voor exogene eiwitproductie. Menselijke embryonale nier, HEK293 cellen werden gebruikt voor dit protocol. - Meng de ontdooide cellen met ten minste 10 ml volledig medium, pipetteer de celsuspensie in een petrischaaltje van 10 cm en draai de plaat om de cellen gelijkmatig in de schaal te verdelen. Plaats de schaal in een celkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 en 85-95% vochtigheid.
- Observeer de cellen onder de microscoop totdat het samenvloeiingsniveau 80-90% bereikt. Verwijder bij hoge confluentie het medium, was de cellen met warm fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 1 ml 0,25% trypsine-ethyleendiamine tetra-azijnzuur toe om de cellen van het oppervlak los te maken.
OPMERKING: De HEK293-cellen zijn vrij gemakkelijk los te maken. Daarom moet de wasstap heel voorzichtig worden uitgevoerd om onbedoeld losmaken en verlies van cellen te voorkomen. - Bekijk na ongeveer 5 minuten de cellen onder een microscoop. Als alle cellen drijven, voegt u ten minste 4 ml medium toe en brengt u de celsuspensie over in een nieuwe steriele buis. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en voeg 1 × 106 cellen toe aan elke put van een 6-putplaat voor transfectie.
OPMERKING: Na 24 uur moeten de cellen 80% of meer confluent zijn.
- Haal de cellijn uit -80 °C of vloeibare stikstof en ontdooi deze in een waterbad van 37 °C.
- Transfectie van het HiBiT-RBD plasmide
- Gebruik 1 μg van het HiBiT-RBD expressieplasmide met een geschikt transfectiereagens. Incubeer gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur en voeg vervolgens het totale volume toe aan elke put van de plaat, druppelsgewijs.
OPMERKING: Volg het transfectieprotocol van de fabrikant. In dit geval werd een mengsel (een gespecificeerde hoeveelheid) van het transfectiereagens met DMEM toegevoegd aan het verdunde plasmide (1 μg) in DMEM (zie de tabel met materialen). Gebruik een marker die (bijv. groen fluorescerend eiwit [GFP]) plasmide bevat als controle om de transfectie-efficiëntie te controleren. - Vervang de volgende dag het medium met het transfectiemengsel door het volledige medium. Observeer de transfectiecontrole goed 48 uur na transfectie.
OPMERKING: Als de transfectie positief en efficiënt was (meer dan 80% GFP-positief), moeten de cellen klaar zijn voor het oogsten van de HiBiT-RBD bioreporter. Het construct bevat ook His-tag, die kan worden gebruikt om gezuiverd eiwit te verkrijgen in plaats van het totale supernatant. - Verzamel het supernatant in microbuisjes van 1,5 ml. Voeg 500 μL 1x passieve lysisbuffer (PLB) toe aan de cellen; incubeer en schud de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voor cellysis.
OPMERKING: Het supernatant en de lysaatoplossing kunnen gedurende ten minste 6 maanden bij -20 °C worden bewaard met een klein verlies van integriteit. Volgens Azad et al.22 is de verslaggever stabiel bij een breed bereik van pH (4-12) en temperatuur (4-42 °C).
- Gebruik 1 μg van het HiBiT-RBD expressieplasmide met een geschikt transfectiereagens. Incubeer gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur en voeg vervolgens het totale volume toe aan elke put van de plaat, druppelsgewijs.
- Bereid je voor op celkweek
- Evaluatie van het luminescerende signaal van de bioreporter door luciferase assay
- Voorbereiding van de reactiecomponenten
- Gebruik het supernatant als bron van de bioreporter.
OPMERKING: Zowel supernatant als lysaat bevatten de HiBiT-RBD bioreporter en kunnen worden gebruikt voor de test. Het supernatant wordt echter aanbevolen als bron vanwege redenen die in de volgende opmerkingen worden uitgelegd. - Verdun de LgBiT en het substraat voor gebruik tot 1x (stamconcentratie is 100x).
OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de LgBiT.
- Gebruik het supernatant als bron van de bioreporter.
- Luciferase assay
- Breng 50 μL van het supernatant van elke put of buis over naar een 96-well plaat en voeg 50 μL van 1x LgBiT toe aan elke put. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Open de luminometersoftware, voeg 50 μL 1x substraat (furimazine) toe aan elke put, plaats de plaat in de luminometer en voer de software uit.
OPMERKING: Voeg het substraat onmiddellijk toe voordat u de plaat leest om consumptie van het substraat door de actieve enzymen vóór signaalmeting te voorkomen.
- Voorbereiding van de reactiecomponenten
2. Detectie van anti-RBD antilichaam met een snelle en gevoelige test
- HiBiT-RBD antilichaam detectie assay
- Bereid de HiBiT-RBD bioreporter voor zoals beschreven in rubriek 1.1 van het protocol.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het supernatant te gebruiken voor de volgende test, omdat het eenvoudiger te verzamelen is en de volwassen geglycosyleerde versie van het eiwit bevat. Bovendien heeft het lysaat verschillende andere eiwitten die de HiBiT-RBD-antilichaaminteractie kunnen verstoren. - Combineer 50 μL van het HiBiT-RBD-bevattende supernatant met 1 μg van het commerciële SARS-CoV-2-RBD-antilichaam in een microbuisje van 1,5 ml. Voeg 20 μL immunoglobulinebindend eiwit (eiwit G) toe aan de oplossing. Breng het totale volume op 300 μL door PBS toe te voegen.
OPMERKING: Het totale volume van het mengsel kan worden verlaagd tot 150 μL. Lagere totale volumes worden niet aanbevolen omdat dit kan leiden tot onvoldoende vermenging van antilichamen met de bioreporter. - Incubeer de buis(en) op een buisschudder of rotator gedurende 30 minuten. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 30 s, gooi het supernatant weg en was met PBS. Herhaal het proces drie keer om de gratis HiBiT-RBD te verwijderen. Resuspend in 50 μL PBS en breng over op een 96-well plaat.
- Voeg 50 μL 1x LgBiT toe en wacht 5 min. Voeg vervolgens 50 μL 1x NanoLuc-substraat toe. Lees onmiddellijk het luminescerende signaal af met een luminometer.
- Bereid de HiBiT-RBD bioreporter voor zoals beschreven in rubriek 1.1 van het protocol.
3. High-throughput detectie van de SARS-CoV-2-specifieke antilichamen uit serummonsters van patiënten
- Bereid grotere hoeveelheden van de HiBiT-RBD bioreporter voor op een high-throughput assay door paragraaf 1.1 van het protocol te volgen.
- Combineer 20 μL magnetisch eiwit G met 50 μL van het HiBiT-RBD supernatant in een put van 96-well plaat voor elk monster. Voeg 10 μL van het serummonster toe aan elke put en breng het totale volume op 150 μL door PBS toe te voegen.
OPMERKING: Gebruik zowel niet-specifieke IgG (negatieve controle) als neutraliserend SARS-CoV-2-antilichaam (positieve controle) bij een concentratie van 1 μg/ml zoals beschreven in stap 2.1.2. Bovendien kunnen serummonsters van gevaccineerde muizen ook worden beoordeeld op antilichamen. In deze test werden serummonsters verkregen van Ottawa Hospital General Campus volgens een goedgekeurde procedure en met geïnformeerde toestemming van individuen. - Incubeer gedurende 30 minuten op een shaker bij kamertemperatuur. Plaats de plaat op een magnetische ring om het eiwit G-antilichaamcomplex neer te slaan.
OPMERKING: De specifieke structuur van de magnetische wasmachine zal het complex op de zijwanden van elke put neerslaan. - Gooi de oplossing in het middelste gedeelte van elke put weg en voeg PBS toe om te wassen. Herhaal de wasstap minstens drie keer om overtollige HiBiT-RBD te verwijderen. Voeg 50 μL 1x PBS en 50 μL 1x LgBiT toe. Incubeer gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid de luminometersoftware voor en voeg vervolgens 50 μL 1x substraat toe. Plaats de plaat in het apparaat, voer de software uit en neem de signalen op. Vergelijk de signalen van serummonsters, controlemonsters en achtergrond (lege putjes).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De signalen van zowel het HiBit-RBD-bevattende cellysaat als het supernatant van de getransfecteerde cellen werden geregistreerd (figuur 2) om de juiste eiwitbron te evalueren. HiBiT-RBD en LgBit werden afzonderlijk gebruikt als controles en de gegevens vertoonden een lage achtergrond in vergelijking met een sterk signaal wanneer beide delen werden gecombineerd. Daarom is HiBiT-RBD-interactie met LgBiT noodzakelijk om een actief enzym te genereren voor substraatvertering en bioluminescentieactiviteit (figuur 1).
De toevoeging van eiwit G zal helpen bij de precipitatie van antilichamen (figuur 3). De test werd gebruikt om het signaal van een commercieel SARS-CoV-2-neutraliserend antilichaam te vergelijken met een controle-IgG. Het specifieke antilichaamsignaal was robuust, terwijl het controleantilichaam dicht bij het luminescerende achtergrondniveau lag (figuur 4A). Recombinant verzwakt oncolytisch vesiculair stomatitisvirus (VSV) met een mutatie op positie 51 van het M-eiwit (Δ51) dat exogene RBD tot expressie brengt, werd gebruikt om muizen te vaccineren. Het serum verzameld van gevaccineerde muizen produceerde een robuust signaal in vergelijking met geen signaal bij muizen geïnjecteerd met controle VSV (figuur 4B).
Figuur 1: LgBiT interactie met HiBiT verbonden met RBD. Na interactie van het kleine deel van het nanoluciferase, HiBiT, met de grote subeenheid van het enzym, LgBiT, kan het actieve enzymcomplex een luminescerend signaal produceren na substraatconsumptie. De RBD bemoeit zich niet met dit proces. Afkortingen: RBD = receptor-bindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Robuuste reporteractiviteit van zowel lysaat als supernatant van getransfecteerde cellen. Het eiwit is aanwezig in zowel supernatant als lysaat en produceert een sterk signaal. De lichtgevende signalen van controlegroepen bevonden zich dicht bij de achtergrond. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schema van de HiBiT-RBD interactie met antilichamen gebonden aan eiwit G. Het schema toont de antilichaamprecipitatie door eiwit G en de interactie met HiBiT-RBD. De toevoeging van de LgBit aan het mengsel zal een robuust signaal produceren wanneer het antilichaam specifiek is voor RBD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: HiBiT-RBD bioreporter genereert sterke bioluminescentie met gezuiverde neutraliserende antilichamen, gevaccineerd muizenserum en serummonsters van patiënten. (A) HiBiT-RBD interageert met RBD-specifiek neutraliserend antilichaam en genereert een significant hoog signaal in vergelijking met het verwaarloosbare signaal voor niet-specifieke IgG. (B) De bioreporter kan SARS-CoV-2-antilichamen detecteren in gevaccineerd muizenserum. Afkortingen: RBD = receptor-binding domain; IgG = immunoglobuline G; Ab = antilichaam; VSV = vesiculaire stomatitis virus; Fluc = vuurvlieg luciferase. (C) Detectie van de SARS-CoV-2-antilichamen in serummonsters van patiënten, gereproduceerd uit Azad et al.22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het toenemende aantal mensen dat besmet is met de SARS-CoV-2 en de voortdurende inspanning voor wereldwijde vaccinatie vereist gevoelige en snelle serologische tests die kunnen worden gebruikt in grootschalige serosurveys. Recent onderzoek toont aan dat gesplitste op nanoluciferase gebaseerde bioreporters kunnen worden gebruikt om dergelijke testen te ontwikkelen. We hebben onlangs de HiBiT-RBD bioreporter ontwikkeld om een test te ontwerpen die kan worden gebruikt om SARS-CoV-2-specifieke antilichamen in het serum van de patiënt op een snelle en betrouwbare manier te detecteren (figuur 4C).
Er zijn een paar kritische stappen in deze test. Omdat de efficiëntie van het systeem afhankelijk is van RBD-eiwitexpressie, moeten de eiwitniveaus worden gevalideerd door western blotting. Bovendien is het noodzakelijk om een positieve controle te gebruiken, zoals een commercieel antilichaam tegen RBD, en een negatief controle-antilichaam. Toevoeging van een Nanoluciferase-eiwit wordt aanbevolen om te worden gebruikt als een positieve controle voor bioluminescentiedetectie. Het eiwitproduct bevat ook een His-tag, die kan worden gebruikt voor zuivering voor een groot aantal serummonsters.
Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik van deze bioreporter in vergelijking met andere concurrerende methoden. Ten eerste kan een ervaren gebruiker de volledige testprocedure in minder dan een uur uitvoeren, wat aanzienlijk sneller is dan bestaande tests zoals ELISA. Ten tweede maken de minimale voorbereidings- en testvereisten deze test zeer waardevol voor grootschalige productie tegen lage kosten. Bovendien is de detectiegrens van de test zo laag als 1 ng van het SARS-CoV-2-neutraliserende antilichaam zoals beschreven door Azad et al.22. Een nadeel van deze aanpak is het onvermogen om onderscheid te maken tussen verschillende antilichaamisotypen. In de toekomst moet de gevoeligheid van de test worden vergeleken met andere routinematig gebruikte serologische tests.
Azad et al. 22 hadden serummonsters van patiënten gebruikt om de toepasbaarheid van de test te evalueren. Het is ook essentieel dat het systeem wordt getest op antilichaamdetectie in bloedmonsters van patiënten. Deze tool kan ook zeer impactvol zijn bij de beoordeling van de correlatie tussen de ernst van COVID-19 en de aanwezigheid van SARS-CoV-2-specifieke antilichamen. Over het algemeen kunnen dergelijke serologische tests een aanzienlijke impact hebben op het schatten van de epidemiologische impact van sars-cov-2 en kunnen ze een handig substituut zijn voor tijdrovende en minder gevoelige detectiemethoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We waarderen en bedanken de technische assistentie van Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin en Christiano Tanese De Souza. We bedanken ook Mina Ghahremani voor grafisch ontwerp. We willen ook alle personen bedanken die hebben deelgenomen en hun bloedmonsters hebben gedoneerd voor deze studie. DWC wordt gedeeltelijk ondersteund door uOttawa Faculteit en Afdeling Geneeskunde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
