Summary
概述的方案描述了生产HiBiT受体结合结构域蛋白复合物的程序及其在快速灵敏地检测SARS-CoV-2抗体中的应用。
Abstract
COVID-19大流行的出现增加了对更好的血清学检测方法的需求，以确定严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的流行病学影响。越来越多的SARS-CoV-2感染增加了对更好的抗体检测检测的需求。目前的抗体检测方法在速度方面会损害灵敏度，或者灵敏度高但耗时。很大比例的SARS-CoV-2中和抗体靶向受体结合域（RBD），这是SARS-CoV-2的主要免疫原性区室之一。我们最近设计并开发了一种高度灵敏的生物发光标记RBD（NanoLuc HiBiT-RBD）来检测SARS-CoV-2抗体。以下文本描述了产生HiBiT-RBD复合物的过程以及使用此工具评估RBD靶向抗体存在的快速测定。由于HiBiT-RBD蛋白产品在很宽的温度范围内具有耐用性，并且实验过程更短，可以在1小时内完成，因此可以考虑将该方案视为检测患者血清样品中SARS-CoV-2抗体的更有效的替代方案。
Introduction
截至20212年3月30日，最近出现的新型冠状病毒SARS-CoV21已造成超过2，800，000人死亡和1.28亿感染。由于缺乏可靠且完善的SARS-CoV-2临床治疗程序，因此已经做出了许多努力来限制进一步的病毒传播，更重要的是，开发一种有效而强大的治疗方法或疫苗3。迄今为止，世界卫生组织报告的试验中已有50多种COVID-19候选疫苗4。检测针对SARS-CoV-2的抗体对于确定接种疫苗后体液反应的长期稳定性以及COVID-195康复患者至关重要。一些研究表明，恢复的SARS-CoV-2患者有可能在1年后失去大部分RBD结合抗体5，6，7，8，9。需要进一步研究以更好地了解持久的免疫力，更灵敏的抗体检测平台可以帮助进一步开展此类工作。轻度SARS-CoV-2感染持续免疫的报告表明长期抗体反应，也是一个有趣且有价值的研究领域。快速准确的检测方法对于监测个体血清中的抗体以提供更多关于人群中免疫力的信息至关重要。
与其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2使用突出的刺突糖蛋白与血管紧张素转换酶-2（ACE2）结合，引发一系列事件，导致病毒和细胞膜融合6，7。最近有几项研究证明，Spike蛋白的RBD在引发针对SARS-CoV28，9，10，11的强大和特异性抗体反应方面起着至关重要的作用。特别是，Premkumar等人观察到的RBD结合抗体滴度与患者血浆的SARS-CoV-2中和效力之间的相关性与RBD是病毒结构的免疫原性区室9一致。考虑到这一点，许多可用于SARS-CoV-2抗体检测的诊断测试都是时间和成本密集型的，需要漫长的孵育和洗涤过程（酶联免疫吸附测定[ELISA]），或缺乏敏感性和准确性（侧流免疫测定[LFIA]）12。因此，一种具有高灵敏度、快速反应和相对低成本的COVID-19衍生抗体检测的定量和快速互补血清学方法，将满足对SARS-CoV-2流行病学监测的可靠血清学检测的需求。
总的来说，当前血清学检测的局限性促使人们研究生物发光报告系统作为未来血清测量中的潜在诊断剂。生物发光是一种天然存在的酶/底物反应，具有光发射。Nanoluc萤光素酶是最小的（19 kDa），但与 Renilla 和萤火虫荧光素酶（分别为36 kDa和61 kDa）相比是最亮的系统13，14。此外，Nanoluc在前面提到的系统中具有最高的信噪比和稳定性。Nanoluc的高信号强度支持检测非常低量的报告聚变15。Nanoluc二进制技术（NanoBiT）是Nanoluc系统的分裂版本，它由两个部分组成：小BiT（11个氨基酸;SmBiT）和具有相对低亲和力相互作用（KD = 190μM）的大型BiT（LgBiT）形成发光配合物16。NanoBiT广泛用于涉及鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用的各种研究15，17，18，19 和细胞信号通路11，20，21。
最近，引入了另一种对LgBiT具有明显更高亲和力的小肽（KD = 0.7 nM），即HiBiT Nano-Glo系统，以代替SmBiT。Nano-Glo"添加-混合-读取"测定的高亲和力和强信号使HiBiT成为一种合适的定量发光肽标签。在这种方法中，HiBiT标签通过开发一种施加最小结构干扰的构建体附加到靶蛋白上。HiBiT蛋白融合将主动与LgBiT对应物结合，产生高活性荧光素酶，在检测试剂存在下产生可检测的生物发光（图1）。同样，我们开发了一种基于HiBiT Nano-Glo的系统，可以很容易地测量SARS-CoV-2回收个体血清中的中和抗体滴度，最近还开发了一种HiBiT标记的SARS-CoV-2 RBD。本文描述了使用标准实验室程序和设备生产HiBiT-RBD生物报告仪的方案，并展示了该生物报告书如何用于快速有效的检测中以检测SARS-CoV-2 RBD靶向抗体。
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Protocol
注意：下面描述的协议符合协议代码20200371-01H的所有道德准则。
1. HiBiT-RBD生物报告仪的生产和评估
- 生产足够数量的HiBiT-RBD生物报告机
- 准备细胞培养
- 准备含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的完整Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）。然后，在37°C水浴中加热培养基。
- 打开生物安全柜（BSC），并使用70%v / v乙醇对柜表面进行灭菌。
- 培养细胞系。
- 从-80°C或液氮中取出细胞系，并在37°C水浴中解冻。
注意：合适的细胞系易于在培养物中维护，具有高转染效率，并且适用于外源性蛋白质生产。人类胚胎肾，HEK293细胞用于该协议。 - 将解冻的细胞与至少10mL完整培养基混合，将细胞悬浮液移入10cm培养皿中，并将平板旋转以均匀分布培养皿中的细胞。将培养皿置于37°C，5%CO 2和85-95%湿度的细胞培养箱中。
- 在显微镜下观察细胞，直到汇合水平达到80-90%。在高汇合度下，除去培养基，用温的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，并加入1mL0.25%胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸以将细胞从表面分离。
注意：HEK293电池相当容易分离。因此，洗涤步骤应非常温和地进行，以防止意外脱离和细胞损失。 - 大约5分钟后，在显微镜下观察细胞。如果所有细胞都是漂浮的，则加入至少4mL培养基，并将细胞悬浮液转移到新的无菌管中。使用血细胞计数器计数细胞，并将1×106 个细胞加入6孔板的每个孔中进行转染。
注意：24小时后，细胞应汇合度为80%或更高。
- 从-80°C或液氮中取出细胞系，并在37°C水浴中解冻。
- HiBiT-RBD质粒的转染
- 使用1μgHiBiT-RBD表达质粒和合适的转染试剂。在室温下孵育10-15分钟，然后将总体积加入板的每个孔中，滴开。
注：请遵循制造商的转染方案。在这种情况下，将具有DMEM的转染试剂的混合物（指定量）加入到DMEM中的稀释质粒（1μg）中（见 材料表）。使用含有（例如，绿色荧光蛋白 [GFP]）的标记物作为对照来监测转染效率。 - 第二天，用完整的培养基替换含有转染混合物的培养基。转染后48小时观察转染对照。
注意：如果转染阳性且有效（GFP阳性率超过80%），则细胞应准备好收获HiBiT-RBD生物报告仪。该构建体还含有His-tag，可用于获得纯化的蛋白质代替总上清液。 - 将上清液收集在1.5 mL微管中。向细胞中加入500μL1x被动裂解缓冲液（PLB）;在室温下孵育并摇动板15分钟以进行细胞裂解。
注意：上清液和裂解液可以在-20°C下保存，并且完整性损失很小至少6个月。根据Azad等人22，报告在pH（4-12）和温度（4-42°C）的宽范围内是稳定的。
- 使用1μgHiBiT-RBD表达质粒和合适的转染试剂。在室温下孵育10-15分钟，然后将总体积加入板的每个孔中，滴开。
- 准备细胞培养
- 通过荧光素酶测定法评估来自生物报告者的发光信号
- 制备反应组分
- 使用上清液作为生物报告者的来源。
注意：上清液和裂解物都含有HiBiT-RBD生物报告仪，可用于测定。然而，由于以下注释中解释的原因，建议将上清液作为来源。 - 使用前将LgBiT和底物稀释至1倍（原液浓度为100倍）。
注：有关 LgBiT 的详细信息，请参阅 材料表 。
- 使用上清液作为生物报告者的来源。
- 荧光素酶测定
- 将50μL上清液从每个孔或管转移到96孔板中，并向每个孔中加入50μL的1x LgBiT。在室温下孵育5分钟。
- 打开光度计软件，向每个孔中加入50μL1x底物（呋喃嗪），将板放入光度计中，然后运行软件。
注意：在读取板之前立即添加底物，以防止在信号测量前活性酶消耗底物。
- 制备反应组分
2. 通过快速灵敏的检测检测抗RBD抗体
- HiBiT-RBD抗体检测检测
- 按照方案第1.1节所述准备HiBiT-RBD生物报告器。
注意：建议将上清液用于以下测定，因为它更易于收集并且含有成熟的糖基化版本的蛋白质。此外，裂解物还有其他几种蛋白质可能会干扰HiBiT-RBD-抗体相互作用。 - 将50μL含HiBiT-RBD的上清液与1μg商用SARS-CoV-2-RBD抗体在1.5mL微管中混合。向溶液中加入20μL免疫球蛋白结合蛋白（蛋白G）。通过加入PBS将总体积调高至300μL。
注意：混合物的总体积可以减少到150μL，不建议降低总体积，因为这可能导致抗体与生物报告者混合不足。 - 将管子在管式振荡器或旋转器上孵育30分钟。以12，000× g 离心30秒，弃去上清液，用PBS洗涤。重复该过程三次以删除免费的HiBiT-RBD。重悬于50μLPBS中并转移到96孔板中。
- 加入50μL的1x LgBiT并等待5分钟。然后，加入50μL1x NanoLuc底物。立即使用发光计读取发光信号。
- 按照方案第1.1节所述准备HiBiT-RBD生物报告器。
3. 从患者血清样本中高通量检测SARS-CoV-2特异性抗体
- 按照实验方案第1.1节制备大量HiBiT-RBD生物报告仪以进行高通量测定。
- 将20μL磁性蛋白G与50μLHiBiT-RBD上清液在96孔板孔中混合，用于每个样品。向每个孔中加入10μL血清样品，并通过添加PBS将总体积提高到150μL。
注意：如步骤2.1.2所述，以1μg/mL浓度同时使用非特异性IgG（阴性对照）和中和SARS-CoV-2抗体（阳性对照）。此外，还可以评估来自接种疫苗小鼠的血清样本的抗体。在这项测试中，根据批准的程序并在个人知情同意的情况下从渥太华医院总医院获得血清样本。 - 在室温下在摇摇杯上孵育30分钟。将板放在磁性垫圈上以沉淀蛋白质G抗体复合物。
注意：磁性垫圈的特定结构会沉淀每个孔的侧壁上的复合物。 - 将溶液丢弃在每个孔的中间部分，并加入PBS进行洗涤。重复洗涤步骤至少三次，以除去多余的HiBiT-RBD。加入50μL的1x PBS和50μL的1x LgBiT。在室温下孵育至少5分钟。
- 准备光度计软件，然后加入50μL的1x底物。将印版放入机器中，运行软件并记录信号。比较来自血清样品、对照样品和背景（空孔）的信号。
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Representative Results
记录来自含有HiBit-RBD的细胞裂解物和转染细胞上清液的信号（图2）以评估适当的蛋白质来源。HiBiT-RBD和LgBit分别用作对照，当两个部分组合时，数据显示与强信号相比，背景较低。因此，HiBiT-RBD与LgBiT的相互作用对于产生用于底物消化和生物发光活性的活性酶是必要的（图1）。
添加蛋白G将有助于抗体沉淀（图3）。该测定用于将来自商业SARS-CoV-2中和抗体的信号与对照IgG进行比较。特异性抗体信号很强，而对照抗体接近发光背景水平（图4A）。重组减毒溶瘤性水疱性口炎病毒（VSV）在表达外源性RBD的M蛋白（Δ51）位置51 处发生突变，用于为小鼠接种疫苗。从接种疫苗的小鼠收集的血清与注射对照VSV的小鼠相比产生了强大的信号（图4B）。
图 1：LgBiT 与连接到 RBD 的 HiBiT 交互。 在纳米荧光素酶HiBiT的一小部分与酶的大亚基LgBiT相互作用时，活性酶复合物在底物消耗后可以产生发光信号。RBD 不会干扰此过程。缩写：RBD =受体结合结构域。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：来自转染细胞裂解物和上清液的强力报告活性。 该蛋白质存在于上清液和裂解物中，并产生强烈的信号。对照组的发光信号靠近背景。误差线表示标准偏差 （SD）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：HiBiT-RBD与与蛋白G结合的抗体相互作用的示意图。 该示意图描述了蛋白G的抗体沉淀以及与HiBiT-RBD的相互作用。当抗体对RBD具有特异性时，将LgBit添加到混合物中将产生强大的信号。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：HiBiT-RBD 生物报告程序通过纯化的中和抗体、接种疫苗的小鼠血清和患者血清样品产生强生物发光。 （A） HiBiT-RBD与RBD特异性中和抗体相互作用，与非特异性IgG的信号相比，产生显着的高信号。（B）生物报告人可以检测接种疫苗的小鼠血清中的SARS-CoV-2抗体。缩写： RBD = 受体结合结构域;IgG = 免疫球蛋白 G;抗体=抗体;VSV =水疱性口炎病毒;Fluc = 萤火虫荧光素酶。（C）检测患者血清样本中的SARS-CoV-2抗体，转载自Azad等人22。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
感染SARS-CoV-2的人数不断增加，全球疫苗接种工作不断进行，因此需要进行灵敏和快速的血清学检测，这些检测可用于大规模血清调查。最近的研究表明，基于分裂纳米荧光素酶的生物报告人可用于开发此类测定。我们最近开发了HiBiT-RBD生物报告程序，以设计一种可用于以快速可靠的方式检测患者血清中SARS-CoV-2特异性抗体的测试（图4C）。
该测定中有几个关键步骤。由于系统的效率取决于RBD蛋白表达，因此应通过蛋白质印迹来验证蛋白质水平。此外，有必要使用阳性对照，例如针对RBD的商业抗体和阴性对照抗体。建议添加纳米荧光酶蛋白作为生物发光检测的阳性对照。蛋白质产品还含有His-tag，可用于大量血清样品的纯化。
与其他竞争方法相比，使用这种生物报告者有几个优点。首先，有经验的用户可以在不到一个小时的时间内完成整个测定程序，这比现有的测试（如ELISA）快得多。其次，最低的准备和测试要求使该测试对于低成本的大规模生产具有很高的价值。此外，该测定的检测限低至Azad等人描述的SARS-CoV-2中和抗体的1 ng。这种方法的缺点是无法区分不同的抗体同种型。展望未来，应将该试验的敏感性与其他常规使用的血清学检测进行比较。
阿扎德等人22 人使用患者的血清样本来评估测定的适用性。同样重要的是，该系统必须经过患者血液样本中的抗体检测测试。该工具在评估COVID-19严重程度与SARS-CoV-2特异性抗体存在之间的相关性方面也可能非常有效。总体而言，这种血清学检测可能对估计SARS-CoV-2的流行病学影响产生重大影响，并且可以方便地替代耗时且灵敏度较低的检测方法。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢何晓红、里卡多·马吕斯、朱莉娅·佩特里克、布拉德利·奥斯汀和克里斯蒂安诺·塔内塞·德索萨的技术援助。我们也感谢Mina Ghahremani的平面设计。我们还要感谢所有参与并为这项研究捐献血液样本的个人。DWC部分由uOttawa Faculty和 Department of Medicine 提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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