Summary
Den skitserede protokol beskriver proceduren for fremstilling af HiBiT-receptorbindende domæneproteinkompleks og dets anvendelse til hurtig og følsom påvisning af SARS-CoV-2 antistoffer.
Abstract
Fremkomsten af COVID-19-pandemien har øget behovet for bedre serologiske påvisningsmetoder til at bestemme de epidemiologiske virkninger af svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det stigende antal SARS-CoV-2-infektioner øger behovet for bedre antistofdetekteringsanalyser. De nuværende metoder til antistofdetektion kompromitterer følsomheden for hastighed eller er følsomme, men tidskrævende. En stor del af SARS-CoV-2-neutraliserende antistoffer er rettet mod det receptorbindende domæne (RBD), et af de primære immunogene rum i SARS-CoV-2. Vi har for nylig designet og udviklet en meget følsom, bioluminescerende-mærket RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) til at opdage SARS-CoV-2 antistoffer. I følgende tekst beskrives proceduren for fremstilling af HiBiT-RBD-komplekset og en hurtig analyse for at evaluere tilstedeværelsen af RBD-målretningsantistoffer ved hjælp af dette værktøj. På grund af holdbarheden af HiBiT-RBD-proteinproduktet over en lang række temperaturer og den kortere forsøgsprocedure, der kan afsluttes inden for 1 time, kan protokollen betragtes som et mere effektivt alternativ til påvisning af SARS-CoV-2 antistoffer i patient serumprøver.
Introduction
Den nylige fremkomst af et nyt coronavirus, SARS-CoV21, har forårsaget mere end 2.800.000 dødsfald og 128 millioner infektioner pr. 30. marts 20212. På grund af manglen på en pålidelig og veletableret behandlingsprocedure for sars-CoV-2 kliniske behandlinger, mange bestræbelser er blevet gjort for at begrænse yderligere viral transmission og endnu vigtigere, at udvikle en effektiv og robust behandling eller en vaccine3. Til dato er der mere end 50 covid-19-vaccinekandidater i forsøg rapporteret af Verdenssundhedsorganisationen4. Påvisning af antistoffer mod SARS-CoV-2 er af afgørende betydning for at bestemme den langsigtede stabilitet af humoral respons ved administration af vaccinen samt hos genvundne patienter med COVID-195. Nogle undersøgelser har vist, at der er en mulighed for, at genvundne SARS-CoV-2-patienter mister de fleste af de RBD-bindende antistoffer efter 1 år5,6,7,8,9. Yderligere undersøgelser er nødvendige for bedre at forstå varig immunitet, og mere følsomme antistofdetekteringsplatforme kan bidrage til at fremme et sådant arbejde. Rapporter om vedvarende immunitet af milde SARS-CoV-2 infektioner, som tyder på langsigtede antistofresponser, er også et interessant og værdifuldt studieområde. En hurtig og præcis metode til påvisning er afgørende for overvågning af antistoffer i enkeltpersoners sera for at give mere information om immunitet i befolkningen.
Ligesom andre coronavirusser bruger SARS-CoV-2 fremspringende spike glycoprotein til at binde sig til angiotensinkonverterende enzym-2 (ACE2) til at indlede en kaskade af begivenheder, der fører til fusion af virus- og cellemembranerne6,7. Flere undersøgelser har for nylig vist, at RBD af Spike-proteinet har en afgørende rolle i fremkalde kraftig og specifik antistofrespons mod SARS-CoV28,9,10,11. Navnlig er korrelationer observeret af Premkumar et al. mellem titeren af RBD-bindende antistof og SARS-CoV-2-neutraliseringsstyrken af patienternes plasma i overensstemmelse med, at RBD er et immunogent rum i virusstrukturen9. Med dette in mente er mange diagnostiske test, der er tilgængelige for SARS-CoV-2-antistofdetektering, tids- og omkostningskrævende, kræver en langvarig procedure for inkubation og vask (enzymrelateret immunosorbentanalyse [ELISA]) eller mangler følsomhed og nøjagtighed (lateral flow immunoassay [LFIA])12. Derfor vil en kvantitativ og hurtig supplerende serologisk metode til covid-19-afledt antistofdetektering med høj følsomhed, hurtig respons og relativt lave omkostninger tjene behovet for en pålidelig serologisk test for SARS-CoV-2 epidemiologisk overvågning.
Samlet set førte begrænsningerne i de nuværende serologiske analyser til en undersøgelse af det bioluminescerende rapporteringssystem som et potentielt diagnostisk middel i fremtidige serosurveyer. Bioluminescens er en naturligt forekommende enzym/substratreaktion med let emission. Nanoluc luciferase er den mindste (19 kDa), men det klareste system sammenlignet med Renilla og firefly luciferase (henholdsvis 36 kDa og 61 kDa)13,14. Desuden har Nanoluc det højeste signal til støjforhold og stabilitet blandt de tidligere nævnte systemer. Nanoluc's høje signalintensitet understøtter påvisning af selv meget lave mængder af reporterfusioner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) er en opdelt version af Nanoluc-systemet, som består af to segmenter: små BiT (11 aminosyrer; SmBiT) og stor bit (LgBiT) med relativt lav-affinitet interaktioner (KD = 190 μM) til at danne en selvlysende kompleks16. NanoBiT anvendes i vid udstrækning i forskellige undersøgelser, der involverer identifikation af protein-protein interaktioner15,17,18,19 og cellulære signaleringsveje11,20,21.
For nylig blev en anden lille peptid med en udpræget højere affinitet til LgBiT (KD = 0,7 nM) indført, nemlig HiBiT Nano-Glo-systemet i stedet for SmBiT. Den høje affinitet og stærke signal af Nano-Glo "add-mix-read" assay gør HiBiT en passende, kvantitativ, selvlysende peptid tag. I denne tilgang er HiBiT-mærket vedhæftet målproteinet ved at udvikle en konstruktion, der pålægger minimal strukturel interferens. HiBiT-protein fusion ville aktivt binde sig til LgBiT modstykke, der producerer en meget aktiv luciferase enzym til at generere påviselig bioluminescens i overværelse af detektion reagenser (Figur 1). På samme måde udviklede vi et HiBiT Nano-Glo-baseret system til let at måle den neutraliserende antistof titer i sera af SARS-CoV-2 genvundne individer og udviklede for nylig en HiBiT-mærket SARS-CoV-2 RBD. Dette papir beskriver protokollen til fremstilling af HiBiT-RBD bioreporter ved hjælp af standard laboratorieprocedurer og udstyr, og viser, hvordan denne bioreporter kan bruges i en hurtig og effektiv analyse til at opdage SARS-CoV-2 RBD-målretning antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Den protokol, der er beskrevet nedenfor, overholder alle etiske retningslinjer i henhold til protokolkode 20200371-01H.
1. Produktion og evaluering af HiBiT-RBD bioreporter
- Producerer en tilstrækkelig mængde HiBiT-RBD bioreporter
- Forbered dig på cellekultur
- Forbered komplet Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM), der indeholder 10% fosterkvægsserum og 1% penicillin/streptomycin. Derefter opvarmes mediet i et 37 °C vandbad.
- Tænd for det biologiske sikkerhedsskab (BSC), og brug 70% v/v ethanol til sterilisering af skabsoverfladen.
- Kultur cellelinjen.
- Tag cellelinjen ud af -80 °C eller flydende nitrogen, og optø den i et 37 °C vandbad.
BEMÆRK: En passende cellelinje er let at vedligeholde i kulturen, har høj transinfektionseffektivitet og er velegnet til eksogen proteinproduktion. Human embryonale nyre, HEK293 celler blev brugt til denne protokol. - Bland de optøede celler med mindst 10 mL komplet medium, pipette celleaffjedringen til en 10 cm Petriskål, og hvirvle pladen for at fordele celler i skålen ensartet. Anbring fadet i en cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 og 85-95 % fugtighed.
- Overhold cellerne under mikroskopet, indtil sammenløbet når 80-90%. Ved høj sammenløb fjernes mediet, cellerne vaskes med varm fosfatbufferet saltvand (PBS) og tilsættes 1 mL på 0,25% trypsin-ethylendiamin tetraacesyre for at løsne cellerne fra overfladen.
BEMÆRK: HEK293-cellerne er forholdsvis let løsrevet. Derfor skal vasketrinnet gøres meget forsigtigt for at forhindre utilsigtet løsrivelse og tab af celler. - Efter ca. 5 min, se på cellerne under et mikroskop. Hvis alle celler flyder, tilsættes mindst 4 mL medium, og overfør celleaffjedringen til et nyt sterilt rør. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og tilsæt 1 × 106 celler i hver brønd af en 6-brønds plade til transfection.
BEMÆRK: Efter 24 timer skal cellerne være på 80% eller mere sammenløb.
- Tag cellelinjen ud af -80 °C eller flydende nitrogen, og optø den i et 37 °C vandbad.
- Transfection af HiBiT-RBD plasmid
- Brug 1 μg af HiBiT-RBD-udtryksplasmiden med et passende transfectionreagens. Inkuber i 10-15 minutter ved stuetemperatur, og tilsæt derefter det samlede volumen til hver brønd af pladen, dråbemæssigt.
BEMÆRK: Følg producentens transfectionprotokol. I dette tilfælde blev der tilsat en blanding (en bestemt mængde) af omformagenset med DMEM til den fortyndede plasmid (1 μg) i DMEM (se materialetabellen). Brug en markør, der indeholder (f.eks. grønt fluorescerende protein [GFP]) plasmid, som en kontrol til at overvåge transfectioneffektiviteten. - På den næste dag skal du udskifte det medium, der indeholder transfectionblandingen, med komplet medium. Overhold transfection control godt 48 timer efter transfektion.
BEMÆRK: Hvis omsmitningen var positiv og effektiv (mere end 80 % GFP-positiv), skal cellerne være klar til høst af HiBiT-RBD-bioreporteren. Konstruktionen indeholder også His-tag, som kan bruges til at opnå renset protein i stedet for den samlede supernatant. - Saml supernatanten i 1,5 mL mikrorør. Der tilsættes 500 μL 1x passiv lysisbuffer (PLB) til cellerne. inkubere og ryste pladen i 15 minutter ved stuetemperatur for celle lysis.
BEMÆRK: Supernatanten og lysatopløsningen kan bevares ved -20 °C med mindre tab af integritet i mindst 6 måneder. Ifølge Azad et al.22, reporter er stabil på en bred vifte af pH (4-12) og temperatur (4-42 °C).
- Brug 1 μg af HiBiT-RBD-udtryksplasmiden med et passende transfectionreagens. Inkuber i 10-15 minutter ved stuetemperatur, og tilsæt derefter det samlede volumen til hver brønd af pladen, dråbemæssigt.
- Forbered dig på cellekultur
- Evaluering af det selvlysende signal fra bioreporteren ved luciferase assay
- Forberedelse af reaktionskomponenterne
- Brug supernatanten som kilde til bioreporteren.
BEMÆRK: Både supernatant og lysat indeholder HiBiT-RBD bioreporteren og kan bruges til analysen. Supernatanten anbefales dog som kilde på grund af årsager forklaret i følgende noter. - Fortynd LgBiT og substrat til 1x før brug (lagerkoncentrationen er 100x).
BEMÆRK: Se materialetabellen for at få flere oplysninger om LgBiT.
- Brug supernatanten som kilde til bioreporteren.
- Luciferase analyse
- Overfør 50 μL af supernatanten fra hver brønd eller rør til en 96-brønds plade, og tilsæt 50 μL 1x LgBiT til hver brønd. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Åbn luminometersoftwaren, tilsæt 50 μL 1x substrat (furimazin) til hver brønd, placer pladen i luminometeret, og kør softwaren.
BEMÆRK: Tilsæt substratet umiddelbart før aflæsning af pladen for at forhindre, at de aktive enzymer forbruger substratet før signalmåling.
- Forberedelse af reaktionskomponenterne
2. Påvisning af anti-RBD antistof med en hurtig og følsom analyse
- HiBiT-RBD antistofdetektering assay
- Forbered HiBiT-RBD bioreporteren som beskrevet i protokollens afsnit 1.1.
BEMÆRK : Det anbefales at bruge supernatanten til følgende analyse, da det er enklere at indsamle og indeholder den modne glycosylerede version af proteinet. Desuden har lysatet flere andre proteiner, der kan forstyrre HiBiT-RBD-antistofinteraktionen. - Kombiner 50 μL af det HiBiT-RBD-holdige supernatant med 1 μg af det kommercielle SARS-CoV-2-RBD-antistof i et 1,5 mL mikrotube. Opløsningen tilsættes 20 μL immunoglobulinbindende protein (protein G). Opbring det samlede volumen til 300 μL ved at tilføje PBS.
BEMÆRK: Den samlede mængde af blandingen kan reduceres til 150 μL. Lavere samlede mængder anbefales ikke, da det kan resultere i utilstrækkelig blanding af antistoffer med bioreporteren. - Inkuber røret (erne) på en rør shaker eller rotator i 30 min. Centrifuge ved 12.000 × g i 30 s, kassér supernatanten og vask med PBS. Gentag processen tre gange for at fjerne gratis HiBiT-RBD. Resuspend i 50 μL PBS og overføres til en 96-brønd plade.
- Tilsæt 50 μL af 1x LgBiT og vent i 5 min. Derefter tilsættes 50 μL af 1x NanoLuc substrat. Læs straks det selvlysende signal med et luminometer.
- Forbered HiBiT-RBD bioreporteren som beskrevet i protokollens afsnit 1.1.
3. Højgennemsigtstvisning af SARS-CoV-2-specifikke antistoffer fra patient serumprøver
- Der forberedes større mængder af HiBiT-RBD bioreporteren til en analyse med høj gennemløb ved at følge protokollens punkt 1.1.
- Kombiner 20 μL magnetisk protein G med 50 μL af HiBiT-RBD supernatanten i en brønd på 96-brønds plade for hver prøve. Der tilsættes 10 μL af serumprøven til hver brønd, og det samlede volumen lægges til 150 μL ved at tilsætte PBS.
BEMÆRK: Brug både uspecifik IgG (negativ kontrol) og neutraliserende SARS-CoV-2 antistof (positiv kontrol) ved 1 μg/mL-koncentration som beskrevet i trin 2.1.2. Desuden kan serumprøver fra vaccinerede mus også vurderes for antistoffer. I denne test blev serumprøver opnået fra Ottawa Hospital General Campus under en godkendt procedure og med informeret samtykke fra enkeltpersoner. - Inkuber i 30 minutter på en shaker ved stuetemperatur. Placer pladen på en magnetisk skive for at udfælde proteinet G-antistofkomplekset.
BEMÆRK: Den magnetiske skives specifikke struktur vil udfælde komplekset på sidevæggene i hver brønd. - Kassér opløsningen i den midterste del af hver brønd, og tilsæt PBS til vask. Gentag vasketrinnet mindst tre gange for at fjerne overskydende HiBiT-RBD. Tilsæt 50 μL af 1x PBS og 50 μL af 1x LgBiT. Inkuber i mindst 5 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered luminometersoftwaren, og tilsæt derefter 50 μL 1x substrat. Placer pladen i maskinen, kør softwaren, og optag signalerne. Sammenlign signalerne fra serumprøver, kontrolprøver og baggrund (tomme brønde).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Signalerne fra både hibit-RBD-holdige cellelyt og supernatant af de transfected celler blev registreret (figur 2) for at evaluere den relevante proteinkilde. HiBiT-RBD og LgBit blev brugt separat som kontroller, og dataene viste lav baggrund sammenlignet med et stærkt signal, når begge dele blev kombineret. Derfor er HiBiT-RBD interaktion med LgBiT nødvendig for at generere aktivt enzym til fordøjelse af substratet og bioluminescensaktivitet (Figur 1).
Tilsætning af protein G vil hjælpe antistof nedbør (Figur 3). Analysen blev brugt til at sammenligne signalet fra et kommercielt SARS-CoV-2-neutraliserende antistof med en kontrol-IgG. Det specifikke antistofsignal var robust, mens kontrolantistoffet var tæt på det selvlysende baggrundsniveau (Figur 4A). Rekombinant svækket onkolytisk vesikulær stomatitisvirus (VSV) med en mutation ved position 51 af M-proteinet (Δ51), der udtrykker udefrakommende RBD blev brugt til at vaccinere mus. Det serum, der blev indsamlet fra vaccinerede mus, gav et robust signal sammenlignet med intet signal hos mus injiceret med kontrol VSV (figur 4B).
Figur 1: LgBiT interaktion med HiBiT forbundet til RBD. Ved interaktion mellem den lille del af nanoluciferase, HiBiT, med enzymets store underenhed, LgBiT, kan det aktive enzymkompleks producere et selvlysende signal efter substratforbrug. RBD'en forstyrrer ikke denne proces. Forkortelser: RBD = receptorbindende domæne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Robust reporteraktivitet fra både lysat og supernatant af transfected celler. Proteinet er til stede i både supernatant og lysat og giver et stærkt signal. Kontrolgruppernes selvlysende signaler var tæt på baggrunden. Fejllinjer repræsenterer SD (StandardAfvigelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skematisk for HiBiT-RBD-interaktionen med antistoffer bundet til protein G. Skemaet skildrer antistofudfældning ved protein G og interaktion med HiBiT-RBD. Tilsætning af LgBit til blandingen vil producere et robust signal, når antistoffet er specifikt for RBD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: HiBiT-RBD bioreporter genererer stærk bioluminescens med renset neutraliserende antistoffer, vaccineret museserum og patient serumprøver. (A) HiBiT-RBD interagerer med RBD-specifikt neutraliserende antistof og genererer betydeligt højt signal sammenlignet med det ubetydelige signal for uspecifik IgG. (B) Bioreporteren kan påvise SARS-CoV-2 antistoffer i vaccineret museserum. Forkortelser: RBD = receptorbindende domæne; IgG = immunoglobulin G; Ab = antistof; VSV = vesikulær stomatitisvirus; Fluc = firefly luciferase. (C) Påvisning af SARS-CoV-2 antistofferne i patientserumprøver, gengivet fra Azad et al.22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det stigende antal personer, der er smittet med SARS-CoV-2, og den igangværende indsats for global vaccination kræver følsomme og hurtige serologiske tests, der kan bruges i store serosurveyer. Nyere forskning viser, at split nanoluciferase-baserede bioreportere kan bruges til at udvikle sådanne analyser. Vi har for nylig udviklet HiBiT-RBD bioreporter til at designe en test, der kan bruges til at opdage SARS-CoV-2-specifikke antistoffer i patientens serum på en hurtig og pålidelig måde (Figur 4C).
Der er et par kritiske skridt i denne analyse. Da systemets effektivitet afhænger af RBD-proteinudtryk, skal proteinniveauerne valideres ved vestlig blotting. Desuden er det nødvendigt at anvende en positiv kontrol, såsom et kommercielt antistof mod RBD, og et negativt kontrolantistof. Tilsætning af et Nanoluciferaseprotein anbefales at blive anvendt som en positiv kontrol til bioluminescensdetektering. Proteinproduktet indeholder også et His-tag, som kan bruges til rensning til et stort antal serumprøver.
Der er flere fordele ved at bruge denne bioreporter sammenlignet med andre konkurrerende metoder. For det første kan en erfaren bruger udføre den komplette analyseprocedure på mindre end en time, hvilket er betydeligt hurtigere end eksisterende tests som ELISA. For det andet gør minimumskravene til forberedelse og test denne test meget værdifuld for storstilet produktion til en lav pris. Desuden er detektionsgrænsen for analysen så lav som 1 ng af det SARS-CoV-2-neutraliserende antistof som beskrevet af Azad et al.22. En ulempe ved denne tilgang er den manglende evne til at skelne mellem forskellige antistofisotyper. Fremadrettet skal testens følsomhed sammenlignes med andre rutinemæssigt anvendte serologiske test.
Azad et al. 22 havde anvendt serumprøver fra patienter til at vurdere analysens anvendelighed. Det er også vigtigt, at systemet testes for antistofdetektering i blodprøver fra patienter. Dette værktøj kan også være meget virkningsfuldt i vurderingen af sammenhængen mellem sværhedsgraden af COVID-19 og tilstedeværelsen af SARS-CoV-2-specifikke antistoffer. Samlet set kan sådanne serologiske test have en betydelig indvirkning på vurderingen af sars-CoV-2's epidemiologiske virkning og kan være en bekvem erstatning for tidskrævende og mindre følsomme detektionsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi sætter pris på og takker den tekniske bistand fra Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin og Christiano Tanese De Souza. Vi takker også Mina Ghahremani for grafisk design. Vi vil også gerne takke alle de personer, der deltog og donerede deres blodprøver til denne undersøgelse. DWC støttes delvist af uOttawa Fakultet og Institut for Medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
