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Immunology and Infection

सार्स-कोव-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन एंटीबॉडी का पता लगाना एक HiBiT-आधारित बायोरिपोर्टर का उपयोग करके

Published: August 12, 2021 doi: 10.3791/62488
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Biotechnology, University of Tehran

Summary

उल्लिखित प्रोटोकॉल HiBiT-रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के उत्पादन की प्रक्रिया और SARS-CoV-2 एंटीबॉडी के तेज और संवेदनशील पता लगाने के लिए इसके आवेदन का वर्णन करता है।

Abstract

कोविड-19 महामारी के उद्भव ने गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनोवायरस 2 (सार्स-कोव -2) के महामारी विज्ञान प्रभाव को निर्धारित करने के लिए बेहतर सीरोलॉजिकल डिटेक्शन विधियों की आवश्यकता को बढ़ा दिया है। सार्स-कोव-2 संक्रमणों की बढ़ती संख्या बेहतर एंटीबॉडी डिटेक्शन एसेस की आवश्यकता को बढ़ाती है। वर्तमान एंटीबॉडी का पता लगाने के तरीके गति के लिए संवेदनशीलता से समझौता करते हैं या संवेदनशील लेकिन समय लेने वाले होते हैं। SARS-CoV-2-neutralizing एंटीबॉडी का एक बड़ा हिस्सा रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (RBD) को लक्षित करता है, जो SARS-CoV-2 के प्राथमिक इम्युनोजेनिक डिब्बों में से एक है। हमने हाल ही में सार्स-कोव-2 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील, बायोल्यूमिनेसेंट-टैग किए गए आरबीडी (नैनोलॉक HiBiT-RBD) को डिजाइन और विकसित किया है। निम्नलिखित पाठ HiBiT-RBD जटिल और इस उपकरण का उपयोग कर RBD-लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से परख का उत्पादन करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला पर HiBiT-RBD प्रोटीन उत्पाद के स्थायित्व और छोटी प्रयोगात्मक प्रक्रिया है कि 1 घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है के कारण, प्रोटोकॉल रोगी सीरम नमूनों में सार्स-CoV-2 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक अधिक कुशल विकल्प के रूप में माना जा सकता है।

Introduction

हाल ही में एक नए कोरोनोवायरस, सार्स-कोव 21 के उद्भव ने 30 मार्च, 20212 तक 2,800,000 से अधिक मौतों और 128 मिलियन संक्रमणों का कारण बना है। सार्स-कोव -2 नैदानिक उपचारों के लिए एक विश्वसनीय और अच्छी तरह से स्थापित उपचार प्रक्रिया की कमी के कारण, आगे वायरल संचरण को प्रतिबंधित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं और अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि एक प्रभावी और मजबूत उपचार या एक वैक्सीन विकसित करने के लिए। आज तक, विश्व स्वास्थ्य संगठन 4 द्वारा रिपोर्ट किए गए परीक्षणों में 50 से अधिक कोविड -19 वैक्सीन उम्मीदवार हैं। सार्स-कोव-2 के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाना वैक्सीन के प्रशासन के साथ-साथ कोविड-195 के ठीक हो चुके रोगियों में ह्यूमरस प्रतिक्रिया की दीर्घकालिक स्थिरता को निर्धारित करने के लिए सर्वोपरि है। कुछ अध्ययनों से पता चला है कि इस बात की संभावना है कि बरामद सार्स-कोव -2 रोगियों ने 1 वर्ष 5,6,7,8,9 के बाद अधिकांश आरबीडी-बाध्यकारी एंटीबॉडी खो दिए हैं। स्थायी प्रतिरक्षा को बेहतर ढंग से समझने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है, और अधिक संवेदनशील एंटीबॉडी डिटेक्शन प्लेटफॉर्म इस तरह के काम को आगे बढ़ाने में मदद कर सकते हैं। हल्के सार्स-कोव -2 संक्रमणों की निरंतर प्रतिरक्षा की रिपोर्ट, जो दीर्घकालिक एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का सुझाव देती है, भी अध्ययन का एक दिलचस्प और सार्थक क्षेत्र है। आबादी में प्रतिरक्षा के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने के लिए व्यक्तियों के सेरा में एंटीबॉडी की निगरानी के लिए पता लगाने का एक तेज़ और सटीक तरीका आवश्यक है।

अन्य कोरोनोवायरस की तरह, सार्स-कोव -2 एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम -2 (एसीई 2) को बांधने के लिए उभरे हुए स्पाइक ग्लाइकोप्रोटीन का उपयोग करता है ताकि वायरल और सेल झिल्ली के संलयन की ओर ले जाने वाली घटनाओं का एक झरना शुरू किया जा सके। कई अध्ययनों ने हाल ही में स्पाइक प्रोटीन के आरबीडी को सार्स-कोव 28,9,10,11 के खिलाफ शक्तिशाली और विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए साबित किया है। विशेष रूप से, आरबीडी-बाइंडिंग एंटीबॉडी के टिटर और रोगियों के प्लाज्मा की सार्स-कोव -2 न्यूट्रलाइजेशन शक्ति के बीच प्रेमकुमार एट अल द्वारा देखे गए सहसंबंध आरबीडी के वायरस संरचना 9 के एक इम्युनोजेनिक डिब्बे होने के अनुरूप हैं। इस बात को ध्यान में रखते हुए, सार्स-कोव -2 एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उपलब्ध कई नैदानिक परीक्षण समय और लागत-गहन हैं, इनक्यूबेशन और धोने की एक लंबी प्रक्रिया की आवश्यकता होती है (एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसोर्बेंट परख [एलिसा]), या संवेदनशीलता और सटीकता की कमी (पार्श्व प्रवाह immunoassay [LFIA])12। इसलिए, उच्च संवेदनशीलता, तेज प्रतिक्रिया और अपेक्षाकृत कम लागत के साथ कोविड-19-व्युत्पन्न एंटीबॉडी का पता लगाने की एक मात्रात्मक और तेजी से पूरक सीरोलॉजिकल विधि सार्स-कोव -2 महामारी विज्ञान निगरानी के लिए एक विश्वसनीय सेरोलॉजिक परीक्षण की आवश्यकता को पूरा करेगी।

सामूहिक रूप से, वर्तमान सीरोलॉजिकल assays की सीमाओं ने भविष्य के सेरोसर्वे में एक संभावित नैदानिक एजेंट के रूप में बायोल्यूमिनेसेंट रिपोर्टिंग सिस्टम की जांच को प्रेरित किया। बायोल्यूमिनेसेंस एक स्वाभाविक रूप से होने वाली एंजाइम / सब्सट्रेट प्रतिक्रिया है, जिसमें प्रकाश उत्सर्जन होता है। नैनोल्यूक लूसिफेरस सबसे छोटा (19 केडीए) है, फिर भी रेनिला और फायरफ्लाई लूसिफेरस (क्रमशः 36 केडीए और 61 केडीए) की तुलना में सबसे उज्ज्वल प्रणाली है। इसके अलावा, नैनोलक में पहले से उल्लिखित प्रणालियों के बीच शोर अनुपात और स्थिरता के लिए उच्चतम संकेत है। नैनोलक की उच्च संकेत तीव्रता रिपोर्टर fusions15 की भी बहुत कम मात्रा का पता लगाने का समर्थन करती है। नैनोल्यूक बाइनरी टेक्नोलॉजी (नैनोबीआईटी) नैनोल्यूक सिस्टम का एक विभाजित संस्करण है, जिसमें दो खंड शामिल हैं: छोटे बीआईटी (11 अमीनो एसिड); SmBiT) और अपेक्षाकृत कम आत्मीयता इंटरैक्शन (KD = 190 μM) के साथ बड़े BiT (LgBiT) एक luminescent complex16 बनाने के लिए। नैनोबीआईटी का उपयोग विभिन्न अध्ययनों में बड़े पैमाने पर किया जाता है जिसमें प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन 15,17,18,19 और सेलुलर सिग्नलिंग पाथवे 11,20,21 की पहचान शामिल है।

हाल ही में, LgBiT (KD = 0.7 nM) के लिए एक स्पष्ट रूप से उच्च आत्मीयता के साथ एक और छोटा पेप्टाइड पेश किया गया था, अर्थात् HiBiT नैनो-ग्लो सिस्टम, SmBiT के स्थान पर। नैनो-ग्लो "ऐड-मिक्स-रीड" परख के उच्च आत्मीयता और मजबूत संकेत HiBiT को एक उपयुक्त, मात्रात्मक, ल्यूमिनेसेंट पेप्टाइड टैग बनाता है। इस दृष्टिकोण में, HiBiT टैग को न्यूनतम संरचनात्मक हस्तक्षेप लागू करने वाले निर्माण को विकसित करके लक्ष्य प्रोटीन से जोड़ा जाता है। HiBiT-प्रोटीन संलयन सक्रिय रूप से LgBiT समकक्ष को बांध देगा, जो पता लगाने योग्य बायोल्यूमिनेसेंस उत्पन्न करने के लिए एक अत्यधिक सक्रिय लूसिफेरस एंजाइम का उत्पादन करेगा (चित्रा 1)। इसी तरह, हमने सार्स-कोव-2 बरामद व्यक्तियों के सेरा में बेअसर एंटीबॉडी टिटर को आसानी से मापने के लिए एक HiBiT नैनो-ग्लो-आधारित प्रणाली विकसित की और हाल ही में एक HiBiT-टैग किए गए SARS-CoV-2 RBD विकसित किया। यह पेपर मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं और उपकरणों का उपयोग करके HiBiT-RBD बायोरिपोर्टर के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, और दिखाता है कि इस बायोरिपोर्टर का उपयोग SARS-CoV-2 RBD-targeting एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक तेज़ और कुशल परख में कैसे किया जा सकता है।

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Protocol

नोट:: नीचे वर्णित प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल कोड 20200371-01H के अनुसार सभी नैतिकता दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. HiBiT-RBD bioreporter का उत्पादन और मूल्यांकन

  1. HiBiT-RBD bioreporter की पर्याप्त मात्रा का उत्पादन
    1. सेल संस्कृति के लिए तैयार करें
      1. पूर्ण Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) तैयार करें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल है। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मीडिया को गर्म करें।
      2. जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) को चालू करें, और कैबिनेट की सतह को निष्फल करने के लिए 70% वी / वी इथेनॉल का उपयोग करें।
    2. सेल लाइन संस्कृति.
      1. -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन से सेल लाइन को बाहर निकालें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं।
        नोट: एक उपयुक्त सेल लाइन संस्कृति में बनाए रखने के लिए आसान है, उच्च अभिकर्मक दक्षता है, और बहिर्जात प्रोटीन उत्पादन के लिए उपयुक्त है। इस प्रोटोकॉल के लिए मानव भ्रूण गुर्दे, HEK293 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था।
      2. कम से कम 10 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम के साथ पिघली हुई कोशिकाओं को मिलाएं, सेल निलंबन को 10 सेमी पेट्री डिश में पिपेट करें, और पकवान में कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को घुमाएं। डिश को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 85-95% आर्द्रता पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
      3. माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें जब तक कि confluency स्तर 80-90% तक नहीं पहुंच जाता। उच्च confluency पर, माध्यम को हटा दें, गर्म फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) के साथ कोशिकाओं को धोलें, और सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमिन टेट्राएसिटिक एसिड का 1 मिलीलीटर जोड़ें।
        नोट:: HEK293 कक्षों काफी आसानी से अलग कर रहे हैं। इसलिए, आकस्मिक टुकड़ी और कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए धोने के चरण को बहुत धीरे से किया जाना चाहिए।
      4. लगभग 5 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं को देखें। यदि सभी कोशिकाएं तैर रही हैं, तो मध्यम के कम से कम 4 एमएल जोड़ें, और सेल निलंबन को एक नई बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और अभिकर्मक के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 × 106 कोशिकाओं को जोड़ें।
        नोट: 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 80% या अधिक confluent पर होना चाहिए।
    3. HiBiT-RBD प्लास्मिड का अभिकर्मक
      1. एक उपयुक्त अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ HiBiT-RBD अभिव्यक्ति प्लास्मिड के 1 μg का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर प्लेट के प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा जोड़ें, ड्रॉप-वार।
        नोट:: निर्माता के अभिकर्मक प्रोटोकॉल का पालन करें। इस मामले में, DMEM के साथ अभिकर्मक अभिकर्मक का एक मिश्रण (एक निर्दिष्ट राशि) DMEM में पतला प्लास्मिड (1 μg) में जोड़ा गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। अभिकर्मक दक्षता की निगरानी करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में प्लास्मिड युक्त मार्कर का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन [जीएफपी]) प्लास्मिड।
      2. अगले दिन, पूर्ण माध्यम के साथ अभिकर्मक मिश्रण युक्त माध्यम को बदलें। अभिकर्मक नियंत्रण को अच्छी तरह से 48 घंटे के बाद अभिकर्मक नियंत्रण का निरीक्षण करें।
        नोट: यदि अभिकर्मक सकारात्मक और कुशल (80% से अधिक GFP-positive) था, तो कोशिकाओं को HiBiT-RBD बायोरिपोर्टर की कटाई के लिए तैयार होना चाहिए। निर्माण में हिज़-टैग भी शामिल है, जिसका उपयोग कुल supernatant के स्थान पर शुद्ध प्रोटीन प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।
      3. 1.5 mL microtubes में supernatant ले लीजिए. कोशिकाओं के लिए 1x निष्क्रिय lysis बफर (PLB) के 500 μL जोड़ें; इनक्यूबेट और सेल lysis के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्लेट हिला.
        नोट: supernatant और lysate समाधान कम से कम 6 महीने के लिए अखंडता के मामूली नुकसान के साथ -20 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जा सकता है। आजाद एट अल.22 के अनुसार, रिपोर्टर पीएच (4-12) और तापमान (4-42 डिग्री सेल्सियस) की एक विस्तृत श्रृंखला पर स्थिर है।
  2. ल्यूसिफेरस परख द्वारा bioreporter से luminescent संकेत का मूल्यांकन
    1. प्रतिक्रिया घटकों को तैयार करना
      1. bioreporter के स्रोत के रूप में supernatant का उपयोग करें।
        नोट: दोनों supernatant और lysate HiBiT-RBD bioreporter शामिल हैं और परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, supernatant निम्नलिखित नोट्स में बताए गए कारणों के कारण स्रोत के रूप में अनुशंसित है।
      2. उपयोग से पहले LgBiT और सब्सट्रेट को 1x तक पतला करें (स्टॉक एकाग्रता 100x है)।
        नोट:: LgBiT के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    2. लूसिफेरस परख
      1. प्रत्येक कुएं या ट्यूब से supernatant के 50 μL को 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें, और प्रत्येक अच्छी तरह से 1x LgBiT के 50 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      2. ल्यूमिनोमीटर सॉफ़्टवेयर खोलें, प्रत्येक अच्छी तरह से 1x सब्सट्रेट (furimazine) के 50 μL जोड़ें, प्लेट को ल्यूमिनोमीटर में रखें, और सॉफ़्टवेयर चलाएं।
        नोट: संकेत माप से पहले सक्रिय एंजाइमों द्वारा सब्सट्रेट की खपत को रोकने के लिए प्लेट को पढ़ने से तुरंत पहले सब्सट्रेट जोड़ें।

2. एक तेजी से और संवेदनशील परख के साथ विरोधी RBD एंटीबॉडी का पता लगाना

  1. HiBiT-RBD एंटीबॉडी का पता लगाने परख
    1. HiBiT-RBD bioreporter तैयार करें जैसा कि प्रोटोकॉल के अनुभाग 1.1 में वर्णित है।
      नोट: यह निम्नलिखित परख के लिए supernatant का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है के रूप में यह इकट्ठा करने के लिए सरल है और प्रोटीन के परिपक्व ग्लाइकोसिलेटेड संस्करण शामिल है. इसके अलावा, लिसेट में कई अन्य प्रोटीन होते हैं जो HiBiT-RBD-एंटीबॉडी इंटरैक्शन में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
    2. HiBiT-RBD-युक्त supernatant के 50 μL को वाणिज्यिक SARS-CoV-2-RBD एंटीबॉडी के 1 μg के साथ 1.5 mL माइक्रोट्यूब में संयोजित करें। समाधान में इम्युनोग्लोबुलिन-बाइंडिंग प्रोटीन (प्रोटीन जी) के 20 μL जोड़ें। PBS जोड़कर कुल मात्रा को 300 μL तक लाएं।
      नोट: मिश्रण की कुल मात्रा को 150 μL तक कम किया जा सकता है। कम कुल वॉल्यूम की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि इसके परिणामस्वरूप बायोरिपोर्टर के साथ एंटीबॉडी का अपर्याप्त मिश्रण हो सकता है।
    3. ट्यूब (ओं) को 30 मिनट के लिए ट्यूब शेकर या रोटेटर पर इनक्यूबेट करें। 30 s के लिए 12,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant को त्याग दें, और PBS के साथ धोएं। मुफ्त HiBiT-RBD को हटाने के लिए प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। पीबीएस के 50 μL में पुन: निलंबित और एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरण।
    4. 1x LgBiT के 50 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। फिर, 1x NanoLuc सब्सट्रेट के 50 μL जोड़ें। तुरंत एक luminometer के साथ luminescent संकेत पढ़ें।

3. रोगी सीरम नमूनों से सार्स-कोव-2-विशिष्ट एंटीबॉडी का उच्च थ्रूपुट पता लगाना

  1. प्रोटोकॉल के अनुभाग 1.1 का पालन करके एक उच्च थ्रूपुट परख के लिए HiBiT-RBD bioreporter की बड़ी मात्रा तैयार करें।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में HiBiT-RBD supernatant के 50 μL के साथ चुंबकीय प्रोटीन जी के 20 μL को संयोजित करें। प्रत्येक अच्छी तरह से सीरम नमूने के 10 μL जोड़ें और PBS जोड़कर कुल मात्रा को 150 μL तक लाएं।
    नोट: दोनों nonspecific IgG (नकारात्मक नियंत्रण) और SARS-CoV-2 एंटीबॉडी (सकारात्मक नियंत्रण) को बेअसर करने का उपयोग 1 μg / mL एकाग्रता पर के रूप में चरण 2.1.2 में वर्णित है। इसके अलावा, टीकाकरण किए गए चूहों से सीरम नमूनों का भी एंटीबॉडी के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। इस परीक्षण में, सीरम के नमूने ओटावा अस्पताल जनरल कैंपस से एक अनुमोदित प्रक्रिया के तहत और व्यक्तियों से सूचित सहमति के साथ प्राप्त किए गए थे।
  3. कमरे के तापमान पर एक शेकर पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रोटीन जी-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स को अवक्षेपित करने के लिए प्लेट को चुंबकीय वॉशर पर रखें।
    नोट: चुंबकीय वाशर की विशिष्ट संरचना प्रत्येक कुएं की तरफ की दीवारों पर परिसर को अवक्षेपित करेगी।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से के मध्य खंड में समाधान को छोड़ दें, और धोने के लिए पीबीएस जोड़ें। अतिरिक्त HiBiT-RBD को हटाने के लिए कम से कम तीन बार धोने के चरण को दोहराएं। 1x PBS के 50 μL और 1x LgBiT के 50 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर कम से कम 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. ल्यूमिनोमीटर सॉफ़्टवेयर तैयार करें, और फिर 1x सब्सट्रेट के 50 μL जोड़ें। प्लेट को मशीन में रखें, सॉफ़्टवेयर चलाएं, और संकेतों को रिकॉर्ड करें। सीरम नमूनों, नियंत्रण नमूनों और पृष्ठभूमि (खाली कुओं) से संकेतों की तुलना करें।

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Representative Results

उचित प्रोटीन स्रोत का मूल्यांकन करने के लिए HiBit-RBD-युक्त सेल लिसेट और ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के supernatant दोनों से संकेतों को दर्ज किया गया था (चित्रा 2)। HiBiT-RBD और LgBit को अलग-अलग नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था, और डेटा ने एक मजबूत संकेत की तुलना में कम पृष्ठभूमि दिखाई जब दोनों भागों को संयुक्त किया गया था। इसलिए, एलजीबीआईटी के साथ HiBiT-RBD इंटरैक्शन सब्सट्रेट पाचन और बायोल्यूमिनेसेंस गतिविधि (चित्रा 1) के लिए सक्रिय एंजाइम उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है।

प्रोटीन जी के अलावा एंटीबॉडी वर्षा में मदद मिलेगी (चित्रा 3)। परख का उपयोग एक नियंत्रण आईजीजी के साथ एक वाणिज्यिक सार्स-कोव-2-न्यूट्रलाइज़िंग एंटीबॉडी से सिग्नल की तुलना करने के लिए किया गया था। विशिष्ट एंटीबॉडी सिग्नल मजबूत था, जबकि नियंत्रण एंटीबॉडी ल्यूमिनेसेंट पृष्ठभूमि स्तर (चित्रा 4 ए) के करीब था। पुनः संयोजक क्षीण oncolytic vesicular stomatitis वायरस (VSV) एम प्रोटीन की स्थिति 51 पर एक उत्परिवर्तन के साथ (51) बहिर्जात आरबीडी व्यक्त चूहों को टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। टीकाकरण किए गए चूहों से एकत्र किए गए सीरम ने नियंत्रण वीएसवी (चित्रा 4 बी) के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों में कोई संकेत नहीं होने की तुलना में एक मजबूत संकेत का उत्पादन किया।

Figure 1
चित्रा 1: HiBiT के साथ LgBiT इंटरैक्शन RBD से जुड़ा हुआ है। नैनोलुसिफेरस के छोटे हिस्से की बातचीत पर, HiBiT, एंजाइम के बड़े सबयूनिट के साथ, LgBiT, सक्रिय एंजाइम कॉम्प्लेक्स सब्सट्रेट खपत के बाद एक ल्यूमिनेसेंट सिग्नल का उत्पादन कर सकता है। आरबीडी इस प्रक्रिया में हस्तक्षेप नहीं करता है। संक्षिप्त रूप: RBD = रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं के लिसेट और supernatant दोनों से मजबूत रिपोर्टर गतिविधि। प्रोटीन supernatant और lysate दोनों में मौजूद है और एक मजबूत संकेत पैदा करता है। नियंत्रण समूहों के luminescent संकेत पृष्ठभूमि के करीब थे। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटीन जी से बंधे एंटीबॉडी के साथ HiBiT-RBD इंटरैक्शन की योजनाबद्ध। योजनाबद्ध प्रोटीन जी द्वारा एंटीबॉडी वर्षा और HiBiT-RBD के साथ बातचीत को दर्शाता है। मिश्रण के लिए LgBit के अलावा एक मजबूत संकेत का उत्पादन होगा जब एंटीबॉडी RBD के लिए विशिष्ट है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: HiBiT-RBD बायोरिपोर्टर शुद्ध बेअसर एंटीबॉडी, टीकाकरण माउस सीरम, और रोगी सीरम नमूनों के साथ मजबूत bioluminescence उत्पन्न करता है। (ए) HiBiT-RBD RBD-विशिष्ट न्यूट्रलाइज़िंग एंटीबॉडी के साथ बातचीत करता है और गैर-विशिष्ट आईजीजी के लिए नगण्य सिग्नल की तुलना में काफी उच्च सिग्नल उत्पन्न करता है। (बी) बायोरिपोर्टर टीकाकरण माउस सीरम में सार्स-कोव-2 एंटीबॉडी का पता लगा सकता है। संक्षिप्त रूप: आरबीडी = रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन; IgG = इम्युनोग्लोबुलिन जी; Ab = एंटीबॉडी; VSV = vesicular stomatitis वायरस; Fluc = firefly luciferase (ग) आजाद एट अल-22 से पुनरुत्पादित रोगी सीरम नमूनों में सार्स-कोव-2 एंटीबॉडी का पता लगाना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सार्स-कोव-2 से संक्रमित लोगों की बढ़ती संख्या और वैश्विक टीकाकरण के लिए चल रहे प्रयास के लिए संवेदनशील और तेजी से सीरोलॉजिक परीक्षणों की आवश्यकता होती है जिनका उपयोग बड़े पैमाने पर सीरोसर्वे में किया जा सकता है। हाल के शोध से पता चलता है कि इस तरह के assays विकसित करने के लिए विभाजित नैनोलुसिफेरस-आधारित बायोरिपोर्टर्स का उपयोग किया जा सकता है। हमने हाल ही में एक परीक्षण डिजाइन करने के लिए HiBiT-RBD बायोरिपोर्टर विकसित किया है जिसका उपयोग रोगी सीरम में SARS-CoV-2-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया जा सकता है एक तेज़ और विश्वसनीय फैशन (चित्रा 4 C)।

वहाँ इस परख में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं. क्योंकि सिस्टम की दक्षता आरबीडी प्रोटीन अभिव्यक्ति पर निर्भर करती है, प्रोटीन के स्तर को पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा मान्य किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करना आवश्यक है, जैसे कि आरबीडी के खिलाफ एक वाणिज्यिक एंटीबॉडी, और एक नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी। एक नैनोलुसिफेरस प्रोटीन के अलावा bioluminescence का पता लगाने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की सिफारिश की है. प्रोटीन उत्पाद में एक हिज़-टैग भी होता है, जिसका उपयोग बड़ी संख्या में सीरम नमूनों के लिए शुद्धिकरण के लिए किया जा सकता है।

अन्य प्रतिस्पर्धी तरीकों की तुलना में इस बायोरिपोर्टर का उपयोग करने के कई फायदे हैं। सबसे पहले, एक अनुभवी उपयोगकर्ता एक घंटे से भी कम समय में पूर्ण परख प्रक्रिया कर सकता है, जो एलिसा जैसे मौजूदा परीक्षणों की तुलना में काफी तेज है। दूसरा, न्यूनतम तैयारी और परीक्षण आवश्यकताएं इस परीक्षण को कम लागत पर बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अत्यधिक मूल्यवान बनाती हैं। इसके अलावा, परख का पता लगाने की सीमा के रूप में के रूप में कम के रूप में सार्स-CoV-2-बेअसर एंटीबॉडी के 1 एनजी के रूप में आजाद एट al.22 द्वारा वर्णित के रूप में कम है. इस दृष्टिकोण का एक दोष विभिन्न एंटीबॉडी आइसोटाइप के बीच अंतर करने में असमर्थता है। आगे बढ़ते हुए, परीक्षण की संवेदनशीलता की तुलना अन्य नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले सेरोलॉजिक परीक्षणों से की जानी चाहिए।

आजाद एट अल। 22 परख की प्रयोज्यता का मूल्यांकन करने के लिए रोगियों से सीरम नमूनों का इस्तेमाल किया था. यह भी आवश्यक है कि रोगियों से रक्त के नमूनों में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सिस्टम का परीक्षण किया जाए। यह उपकरण कोविड-19 की गंभीरता और सार्स-कोव-2-विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति के बीच संबंध के आकलन में भी बहुत प्रभावी हो सकता है। कुल मिलाकर, इस तरह के सेरोलॉजिक परीक्षणों का सार्स-कोव -2 के महामारी विज्ञान प्रभाव का अनुमान लगाने में पर्याप्त प्रभाव पड़ सकता है और समय लेने वाले और कम संवेदनशील पहचान विधियों के लिए एक सुविधाजनक विकल्प हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम Xiaohong He, रिकार्डो Marius, जूलिया Petryk, ब्रैडली ऑस्टिन, और Christiano Tanese डी सूजा की तकनीकी सहायता की सराहना करते हैं और धन्यवाद देते हैं। हम ग्राफिक डिजाइन के लिए मीना घहरेमानी को भी धन्यवाद देते हैं। हम उन सभी व्यक्तियों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने इस अध्ययन के लिए भाग लिया और अपने रक्त के नमूने दान किए। DWC यू ओटावा संकाय और चिकित्सा विभाग द्वारा भाग में समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x Passive Lysis Buffer Promega E194A 30 mL
Bio-Plex Handheld Magnetic Washer Bio-Rad 171020100
DMEM Sigma D6429-500ml
Dual-Glo luciferase Assay System Promega E2940 100 mL kit
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F1051
HiBiT-RBD Plasmid gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA 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LgBiT Promega N3030
penicillin Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pierce Protein G Magnetic Beads Thermo Fisher Scientific 88848
PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent Signagen SL100688.5
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Synergy Mx Microplate Reader BioTek 96-well plate reader luminometer
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 2520056 0.25%

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References

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सार्स-कोव-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन एंटीबॉडी का पता लगाना एक HiBiT-आधारित बायोरिपोर्टर का उपयोग करके
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Rezaei, R., Surendran, A.,… More

Rezaei, R., Surendran, A., Singaravelu, R., Jamieson, T. R., Taklifi, P., Poutou, J., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter. J. Vis. Exp. (174), e62488, doi:10.3791/62488 (2021).

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