Summary
O protocolo delineado descreve o procedimento para a produção do complexo de proteína de domínio de ligação receptora HiBiT e sua aplicação para detecção rápida e sensível de anticorpos SARS-CoV-2.
Abstract
O surgimento da pandemia COVID-19 aumentou a necessidade de melhores métodos de detecção sorológica para determinar o impacto epidemiológico da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2). O número crescente de infecções por SARS-CoV-2 aumenta a necessidade de melhores ensaios de detecção de anticorpos. Os métodos atuais de detecção de anticorpos comprometem a sensibilidade para a velocidade ou são sensíveis, mas demorados. Uma grande proporção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 tem como alvo o domínio de ligação receptora (RBD), um dos compartimentos imunogênicos primários do SARS-CoV-2. Recentemente projetamos e desenvolvemos um RBD altamente sensível, bioluminescente marcado (NanoLuc HiBiT-RBD) para detectar anticorpos SARS-CoV-2. O texto a seguir descreve o procedimento para produzir o complexo HiBiT-RBD e um ensaio rápido para avaliar a presença de anticorpos direcionados a RBD usando esta ferramenta. Devido à durabilidade do produto de proteína HiBiT-RBD em uma ampla gama de temperaturas e ao procedimento experimental mais curto que pode ser concluído dentro de 1 h, o protocolo pode ser considerado como uma alternativa mais eficiente para detectar anticorpos SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente.
Introduction
O recente surgimento de um novo coronavírus, SARS-CoV21, causou mais de 2.800.000 mortes e 128 milhões de infecções a partir de 30 de março de 20212. Devido à falta de um procedimento de tratamento confiável e bem estabelecido para as terapias clínicas SARS-CoV-2, muitos esforços têm sido feitos para restringir a transmissão viral e, mais importante, desenvolver um tratamento eficaz e robusto ou uma vacina3. Até o momento, há mais de 50 candidatos à vacina COVID-19 em ensaios relatados pela Organização Mundial da Saúde4. A detecção de anticorpos contra o SARS-CoV-2 é de suma importância para determinar a estabilidade a longo prazo da resposta humoral após a administração da vacina, bem como em pacientes recuperados de COVID-195. Alguns estudos demonstraram que existe a possibilidade de que pacientes recuperados de SARS-CoV-2 percam a maioria dos anticorpos de ligação de RBD após 1 ano5,6,7,8,9. Uma investigação mais aprofundada é necessária para entender melhor a imunidade duradoura, e plataformas de detecção de anticorpos mais sensíveis podem ajudar a continuar esse trabalho. Relatos de imunidade sustentada de infecções leves de SARS-CoV-2, que sugerem respostas de anticorpos a longo prazo, também é uma área de estudo interessante e valiosa. Um método rápido e preciso de detecção é essencial para o monitoramento de anticorpos na sera dos indivíduos para fornecer mais informações sobre imunidade na população.
Como outros coronavírus, o SARS-CoV-2 usa glicoproteína de espigão saliente para se ligar à enzima conversor de angiotensina-2 (ACE2) para iniciar uma cascata de eventos que levam à fusão das membranas virais e celulares6,7. Vários estudos provaram recentemente que o RBD da proteína Spike tem um papel crucial na obtenção de resposta de anticorpos poderosos e específicos contra SARS-CoV28,9,10,11. Em particular, as correlações observadas por Premkumar et al. entre o titer de anticorpos de ligação RBD e a potência de neutralização SARS-CoV-2 do plasma dos pacientes são consistentes com a RBD ser um compartimento imunogênico da estrutura do vírus9. Com isso em mente, muitos testes diagnósticos disponíveis para detecção de anticorpos SARS-CoV-2 são tempo e custo-intensivo, requerem um longo procedimento de incubação e lavagem (ensaio imunosorbente ligado à enzima [ELISA]), ou falta de sensibilidade e precisão (imunoensaio de fluxo lateral [LFIA])12. Portanto, um método sorológico quantitativo e rápido complementar da detecção de anticorpos derivados do COVID-19 com alta sensibilidade, resposta rápida e custo relativamente baixo serviria à necessidade de um teste sorológico confiável para a vigilância epidemiológica SARS-CoV-2.
Coletivamente, as limitações dos ensaios sorológicos atuais levaram à investigação do sistema de relatórios bioluminescentes como um potencial agente diagnóstico em futuras pesquisas. Bioluminescência é uma reação enzimática/substrato de ocorrência natural, com emissão de luz. A luciferase nanoluc é a menor (19 kDa), mas o sistema mais brilhante comparado à Renilla e à luciferase de vagalume (36 kDa e 61 kDa, respectivamente)13,14. Além disso, a Nanoluc tem a maior relação de sinal para ruído e estabilidade entre os sistemas mencionados anteriormente. A alta intensidade de sinal de Nanoluc suporta a detecção de quantidades ainda muito baixas de fusões de repórteres15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) é uma versão dividida do sistema Nanoluc, que é composto por dois segmentos: pequeno BiT (11 aminoácidos; SmBiT) e biT grande (LgBiT) com interações relativamente baixas de afinidade (KD = 190 μM ) para formar um complexo luminescente16. O NanoBiT é amplamente utilizado em diversos estudos envolvendo a identificação de interações proteína-proteína15,17,18,19 e vias de sinalização celular11,20,21.
Recentemente, outro pequeno peptídeo com uma afinidade distintamente maior com o LGBiT (KD = 0,7 nM ) foi introduzido, ou seja, o sistema HiBiT Nano-Glo, no lugar do SmBiT. A alta afinidade e o forte sinal do ensaio "add-mix-read" de Nano-Glo fazem do HiBiT uma etiqueta de peptídeo adequada, quantitativa e luminescente. Nesta abordagem, a tag HiBiT é anexada à proteína alvo, desenvolvendo uma construção que impõe interferência estrutural mínima. A fusão hiBiT-proteína se ligaria ativamente à contraparte lgBiT, produzindo uma enzima luciferase altamente ativa para gerar bioluminescência detectável na presença de reagentes de detecção (Figura 1). Da mesma forma, desenvolvemos um sistema baseado em HiBiT Nano-Glo para medir prontamente o titer de anticorpos neutralizante na sera de indivíduos recuperados SARS-CoV-2 e recentemente desenvolvemos um SARS-CoV-2 RBD com marca HiBiT. Este artigo descreve o protocolo para a produção do bioreporter HiBiT-RBD usando procedimentos e equipamentos de laboratório padrão, e mostra como este biorelato pode ser usado em um ensaio rápido e eficiente para detectar anticorpos alvo SARS-CoV-2 RBD.
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Protocol
NOTA: O protocolo descrito abaixo adere a todas as diretrizes éticas de acordo com o código de protocolo 20200371-01H.
1. Produção e avaliação do biorelatador HiBiT-RBD
- Produzindo uma quantidade suficiente de bioreporter HiBiT-RBD
- Prepare-se para a cultura celular
- Prepare o meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal e 1% penicilina/estreptomicina. Em seguida, aqueça a mídia em um banho de água de 37 °C.
- Ligue o gabinete de segurança biológica (BSC) e use 70% de v/v de etanol para esterilizar a superfície do gabinete.
- Cultura a linha celular.
- Retire a linha celular de -80 °C ou nitrogênio líquido, e descongele-a em um banho de água de 37 °C.
NOTA: Uma linha celular adequada é fácil de manter na cultura, tem alta eficiência de transfecção e é adequada para a produção de proteínas exógenas. Rim embrionário humano, células HEK293 foram usadas para este protocolo. - Misture as células descongeladas com pelo menos 10 mL de meio completo, pipete a suspensão celular a uma placa de Petri de 10 cm e gire a placa para distribuir células na placa uniformemente. Coloque o prato em uma incubadora de cultura celular a 37 °C, 5% de CO2 e 85-95% de umidade.
- Observe as células sob o microscópio até que o nível de confluência atinja 80-90%. Em alta confluência, remova o meio, lave as células com soro fisiológico tamponado de fosfato quente (PBS) e adicione 1 mL de 0,25% de ácido tetraacético trypsin-etilenodiamina para separar as células da superfície.
NOTA: As células HEK293 são facilmente separadas. Assim, a etapa de lavagem deve ser feita com muita gentileza para evitar o descolamento acidental e a perda de células. - Depois de aproximadamente 5 minutos, olhe para as células sob um microscópio. Se todas as células estiverem flutuando, adicione pelo menos 4 mL de meio e transfira a suspensão celular para um novo tubo estéril. Conte as células usando um hemótmetro, e adicione 1 × 106 células em cada poço de uma placa de 6 poços para transfecção.
NOTA: Após 24h, as células devem estar em 80% ou mais confluentes.
- Retire a linha celular de -80 °C ou nitrogênio líquido, e descongele-a em um banho de água de 37 °C.
- Transfecção do plasmídeo HiBiT-RBD
- Use 1 μg da expressão HiBiT-RBD plasmid com um reagente de transfecção adequado. Incubar por 10-15 min em temperatura ambiente, e, em seguida, adicionar o volume total a cada poço da placa, em termos de gota.
NOTA: Siga o protocolo de transfecção do fabricante. Neste caso, uma mistura (uma quantidade especificada) do reagente de transfecção com DMEM foi adicionada ao plasmídeo diluído (1 μg) em DMEM (ver a Tabela de Materiais). Use um marcador contendo (por exemplo, proteína fluorescente verde [GFP]) plasmid como um controle para monitorar a eficiência da transfecção. - No dia seguinte, substitua o meio contendo a mistura de transfecção por meio completo. Observe o controle de transfecção bem 48 h após a transfecção.
NOTA: Se a transfecção foi positiva e eficiente (mais de 80% GFP-positivo), as células devem estar prontas para a colheita do bioreporter HiBiT-RBD. A construção também contém Sua tag, que pode ser usada para obter proteína purificada no lugar do supernanato total. - Colete o supernatante em microtubos de 1,5 mL. Adicionar 500 μL de 1x tampão de lise passiva (PLB) às células; incubar e agitar a placa por 15 minutos em temperatura ambiente para a lise celular.
NOTA: A solução de sobrenascimento e a solução de lise pode ser preservada a -20 °C com menor perda de integridade por pelo menos 6 meses. De acordo com Azad et al.22, o repórter está estável em uma ampla gama de pH (4-12) e temperatura (4-42 °C).
- Use 1 μg da expressão HiBiT-RBD plasmid com um reagente de transfecção adequado. Incubar por 10-15 min em temperatura ambiente, e, em seguida, adicionar o volume total a cada poço da placa, em termos de gota.
- Prepare-se para a cultura celular
- Avaliação do sinal luminescente do biorelatório por ensaio de luciferase
- Preparando os componentes de reação
- Use o supernatante como fonte do biorelador.
NOTA: Tanto o supernatante quanto o lysate contêm o biorelato HiBiT-RBD e podem ser usados para o ensaio. No entanto, o supernante é recomendado como fonte devido a razões explicadas nas seguintes notas. - Diluir o LGBiT e substrato para 1x antes do uso (a concentração de estoque é de 100x).
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o LGBiT.
- Use o supernatante como fonte do biorelador.
- Ensaio de luciferase
- Transfira 50 μL do supernasciente de cada poço ou tubo para uma placa de 96 poços, e adicione 50 μL de 1x LgBiT a cada poço. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Abra o software do luminômetro, adicione 50 μL de substrato de 1x (furimazine) a cada poço, coloque a placa no luminômetro e execute o software.
NOTA: Adicione o substrato imediatamente antes de ler a placa para evitar o consumo do substrato pelas enzimas ativas antes da medição do sinal.
- Preparando os componentes de reação
2. Detectando anticorpo anti-RBD com um ensaio rápido e sensível
- Ensaio de detecção de anticorpos HiBiT-RBD
- Prepare o biorelatador HiBiT-RBD conforme descrito na seção 1.1 do protocolo.
NOTA : Recomenda-se usar o supernascido para o seguinte ensaio, pois é mais simples de coletar e contém a versão glicosylated madura da proteína. Além disso, o lise tem várias outras proteínas que poderiam interferir na interação hibit-RBD-anticorpos. - Combine 50 μL do supernatante contendo HiBiT-RBD com 1 μg do anticorpo sars-cov-2-RBD comercial em um microtubo de 1,5 mL. Adicione 20 μL de proteína de ligação de imunoglobulina (proteína G) à solução. Ele traga o volume total para 300 μL adicionando PBS.
NOTA: O volume total da mistura pode ser reduzido para 150 μL. Volumes totais mais baixos não são recomendados, pois podem resultar em mistura inadequada de anticorpos com o biorelato. - Incubar o tubo em um agitador ou rotador por 30 minutos. Centrifugar a 12.000 × g para 30 s, descartar o supernaspe e lavar com PBS. Repita o processo três vezes para remover o HiBiT-RBD gratuito. Resuspend em 50 μL de PBS e transferir para uma placa de 96 poços.
- Adicione 50 μL de 1x LGBiT e espere por 5 min. Em seguida, adicione 50 μL de substrato nanoluc 1x. Leia imediatamente o sinal luminescente com um luminômetro.
- Prepare o biorelatador HiBiT-RBD conforme descrito na seção 1.1 do protocolo.
3. Detecção de alto rendimento dos anticorpos sars-cov-2 específicos de amostras de soro do paciente
- Prepare quantidades maiores do bioreporter HiBiT-RBD para um ensaio de alto rendimento seguindo a seção 1.1 do protocolo.
- Combine 20 μL de proteína magnética G com 50 μL do supernanato HiBiT-RBD em um poço de placa de 96 poços para cada amostra. Adicione 10 μL da amostra de soro a cada poço e elevo o volume total para 150 μL adicionando PBS.
NOTA: Utilize tanto o IgG não específico (controle negativo) quanto o anticorpo SARS-CoV-2 neutralizante (controle positivo) a 1 μg/mL de concentração conforme descrito na etapa 2.1.2. Além disso, amostras de soro de camundongos vacinados também podem ser avaliadas para anticorpos. Neste teste, amostras de soro foram obtidas no Campus Geral do Hospital de Ottawa sob um procedimento aprovado e com consentimento informado dos indivíduos. - Incubar por 30 min em um shaker à temperatura ambiente. Coloque a placa em uma arruela magnética para precipitar o complexo de proteínas G-anticorpos.
NOTA: A estrutura específica da arruela magnética precipitará o complexo nas paredes laterais de cada poço. - Descarte a solução na seção do meio de cada poço e adicione PBS para lavagem. Repita a etapa de lavagem pelo menos três vezes para remover o excesso de HiBiT-RBD. Adicione 50 μL de 1x PBS e 50 μL de 1x LgBiT. Incubar por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente.
- Prepare o software do luminômetro e adicione 50 μL de substrato de 1x. Coloque a placa na máquina, execute o software e grave os sinais. Compare os sinais de amostras de soro, amostras de controle e fundo (poços vazios).
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Representative Results
Foram registrados os sinais tanto do liseto celular contendo HiBit-RBD quanto do sobrenante das células transfeinadas (Figura 2) para avaliar a fonte proteica apropriada. HiBiT-RBD e LgBit foram usados separadamente como controles, e os dados mostraram baixo fundo em comparação com um sinal forte quando ambas as partes foram combinadas. Assim, a interação HiBiT-RBD com o LGBiT é necessária para gerar enzima ativa para digestão substrato e atividade de bioluminescência (Figura 1).
A adição de proteína G ajudará a precipitação de anticorpos (Figura 3). O ensaio foi usado para comparar o sinal de um anticorpo comercial SARS-CoV-2-neutralizante com um IgG de controle. O sinal de anticorpo específico era robusto, enquanto o anticorpo de controle tinha perto do nível de fundo luminescente (Figura 4A). O vírus da estomatite vesicular oncolítico recombinante atenuado (VSV) com uma mutação na posição 51 da proteína M (Δ51) expressando RBD exógeno foi usado para vacinar camundongos. O soro coletado de camundongos vacinados produziu um sinal robusto em comparação com nenhum sinal em camundongos injetados com controle VSV (Figura 4B).
Figura 1: Interação lgBiT com HiBiT conectado ao RBD. Após a interação da pequena porção da nanoluciferase, HiBiT, com a grande subunidade da enzima, LgBiT, o complexo enzimáfico ativo pode produzir um sinal luminescente após o consumo de substrato. O RBD não interfere nesse processo. Abreviaturas: RBD = domínio de ligação receptora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Atividade robusta de repórter de lysate e sobrenatante de células transfeinadas. A proteína está presente tanto em sobrenasce quanto em lise e produz um forte sinal. Os sinais luminescentes dos grupos de controle estavam próximos ao fundo. As barras de erro representam o Desvio Padrão (SD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema da interação HiBiT-RBD com anticorpos ligados à proteína G. O esquema retrata a precipitação de anticorpos pela proteína G e interação com HiBiT-RBD. A adição do LgBit à mistura produzirá um sinal robusto quando o anticorpo for específico para RBD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O bioreporter HiBiT-RBD gera forte bioluminescência com anticorpos purificados neutralizantes, soro de camundongos vacinado e amostras de soro do paciente. (A) O HiBiT-RBD interage com o anticorpo neutralizante específico do RBD e gera um sinal significativamente alto em comparação com o sinal insignificante para IgG não específico. (B) O biorelatório pode detectar anticorpos SARS-CoV-2 no soro de camundongos vacinados. Abreviaturas: RBD = domínio de ligação receptora; IgG = imunoglobulina G; Ab = anticorpo; VSV = vírus da estomatite vesicular; Fluc = luciferase de vagalume. (C) Detecção dos anticorpos SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente, reproduzidos a partir de Azad et al.22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O número crescente de pessoas infectadas com o SARS-CoV-2 e o esforço contínuo para a vacinação global exigem testes sorológicos sensíveis e rápidos que podem ser usados em serosurveys em larga escala. Pesquisas recentes mostram que bionotáciferas com base em nanoluciferase divididos podem ser usados para desenvolver tais ensaios. Recentemente desenvolvemos o bioreporter HiBiT-RBD para projetar um teste que pode ser usado para detectar anticorpos específicos SARS-CoV-2 no soro do paciente de forma rápida e confiável (Figura 4C).
Há alguns passos críticos neste ensaio. Como a eficiência do sistema depende da expressão da proteína RBD, os níveis de proteína devem ser validados pela mancha ocidental. Além disso, é necessário usar um controle positivo, como um anticorpo comercial contra RBD, e um anticorpo de controle negativo. Recomenda-se que a adição de uma proteína nanoluciferase seja usada como controle positivo para detecção de bioluminescência. O produto proteico também contém uma etiqueta His,que pode ser usada para purificação para um grande número de amostras de soro.
Existem várias vantagens em usar este bioreporter em comparação com outros métodos concorrentes. Primeiro, um usuário experiente pode realizar o procedimento completo de ensaio em menos de uma hora, o que é consideravelmente mais rápido do que testes existentes, como o ELISA. Em segundo lugar, os requisitos mínimos de preparação e teste tornam este teste altamente valioso para a produção em larga escala a um custo baixo. Além disso, o limite de detecção do ensaio é tão baixo quanto 1ng do anticorpo neutralizante SARS-CoV-2 como descrito por Azad et al.22. Uma desvantagem dessa abordagem é a incapacidade de diferenciar entre diferentes isótipos de anticorpos. Seguindo em frente, a sensibilidade do teste deve ser comparada a outros testes sorológicos usados rotineiramente.
Azad et al. 22 utilizaram amostras de soro de pacientes para avaliar a aplicabilidade do ensaio. Também é essencial que o sistema seja testado para detecção de anticorpos em amostras de sangue de pacientes. Esta ferramenta também pode ser muito impactante na avaliação da correlação entre a gravidade do COVID-19 e a presença de anticorpos específicos SARS-CoV-2. No geral, tais testes sorológicos poderiam ter um impacto substancial na estimativa do impacto epidemiológico do SARS-CoV-2 e podem ser um substituto conveniente para métodos de detecção demorados e menos sensíveis.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos e agradecemos a assistência técnica de Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin e Christiano Tanese De Souza. Agradecemos também a Mina Ghahremani pelo Design Gráfico. Também gostaríamos de agradecer a todos os indivíduos que participaram e doaram suas amostras de sangue para este estudo. A DWC é apoiada em parte pela Faculdade uOttawa e pelo Departamento de Medicina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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