Summary
Den skisserte protokollen beskriver prosedyren for å produsere HiBiT-reseptorbindingsdomeneproteinkomplekset og dets anvendelse for rask og sensitiv deteksjon av SARS-CoV-2-antistoffer.
Abstract
Fremveksten av COVID-19-pandemien har økt behovet for bedre serologiske deteksjonsmetoder for å bestemme den epidemiologiske effekten av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det økende antallet SARS-CoV-2-infeksjoner øker behovet for bedre antistoffdeteksjonsanalyser. Nåværende antistoffdeteksjonsmetoder kompromitterer følsomhet for hastighet eller er følsomme, men tidkrevende. En stor andel av SARS-CoV-2-nøytraliserende antistoffer retter seg mot reseptorbindingsdomenet (RBD), et av de primære immunogene rommene i SARS-CoV-2. Vi har nylig designet og utviklet en svært følsom, bioluminescent-merket RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) for å oppdage SARS-CoV-2 antistoffer. Følgende tekst beskriver prosedyren for å produsere HiBiT-RBD-komplekset og en rask analyse for å evaluere tilstedeværelsen av RBD-målrettede antistoffer ved hjelp av dette verktøyet. På grunn av holdbarheten til HiBiT-RBD-proteinproduktet over et bredt spekter av temperaturer og den kortere eksperimentelle prosedyren som kan fullføres innen 1 time, kan protokollen betraktes som et mer effektivt alternativ for å oppdage SARS-CoV-2 antistoffer i pasientserumprøver.
Introduction
Den nylige fremveksten av et nytt koronavirus, SARS-CoV21, har forårsaket mer enn 2.800.000 dødsfall og 128 millioner infeksjoner per 30. På grunn av mangelen på en pålitelig og veletablert behandlingsprosedyre for SARS-CoV-2 kliniske terapier, har mange bestrebelser blitt gjort for å begrense ytterligere virusoverføring og enda viktigere, for å utvikle en effektiv og robust behandling eller en vaksine3. Til dags dato er det mer enn 50 COVID-19 vaksinekandidater i studier rapportert av Verdens helseorganisasjon4. Påvisning av antistoffer mot SARS-CoV-2 er av avgjørende betydning for å bestemme den langsiktige stabiliteten av humoral respons ved administrering av vaksinen, så vel som hos gjenopprettede pasienter av COVID-195. Noen studier har vist at det er en mulighet for at gjenvunne sars-cov-2 pasienter mister de fleste av RBD-bindende antistoffer etter 1 år5,6,7,8,9. Videre undersøkelser er nødvendig for å bedre forstå varig immunitet, og mer sensitive antistoffdeteksjonsplattformer kan bidra til å fremme slikt arbeid. Rapporter om vedvarende immunitet av milde SARS-CoV-2-infeksjoner, som antyder langsiktige antistoffresponser, er også et interessant og verdig studieområde. En rask og nøyaktig metode for deteksjon er avgjørende for å overvåke antistoffer i individets sera for å gi mer informasjon om immunitet i befolkningen.
Som andre koronavirus bruker SARS-CoV-2 fremspringende spike glykoprotein for å binde seg til angiotensinkonverterende enzym-2 (ACE2) for å initiere en kaskade av hendelser som fører til sammensmelting av virale og cellemembraner6,7. Flere studier har nylig vist at RBD for Spike-proteinet har en avgjørende rolle i å fremkalle kraftig og spesifikk antistoffrespons mot SARS-CoV28,9,10,11. Spesielt er korrelasjoner observert av Premkumar et al. mellom titeret av RBD-bindende antistoff og SARS-CoV-2 nøytraliseringsstyrke av pasientens plasma i samsvar med at RBD er et immunogent rom i virusstrukturen9. Med det i tankene er mange diagnostiske tester tilgjengelig for SARS-CoV-2 antistoffdeteksjon tids- og kostnadskrevende, krever en langvarig prosedyre for inkubasjon og vasking (enzymbundet immunosorbentanalyse [ELISA]), eller mangler følsomhet og nøyaktighet (lateral flow immunoassay [LFIA])12. Derfor vil en kvantitativ og rask komplementær serologisk metode for COVID-19-avledet antistoffdeteksjon med høy følsomhet, rask respons og relativt lave kostnader tjene behovet for en pålitelig serologisk test for SARS-CoV-2 epidemiologisk overvåking.
Samlet førte begrensningene til nåværende serologiske analyser til undersøkelsen av det bioluminescerende rapporteringssystemet som et potensielt diagnostisk middel i fremtidige serosurveys. Bioluminescens er en naturlig forekommende enzym/substratreaksjon, med lysutslipp. Nanoluc luciferase er den minste (19 kDa), men det lyseste systemet sammenlignet med Renilla og firefly luciferase (henholdsvis 36 kDa og 61 kDa)13,14. Videre har Nanoluc det høyeste signal-til-støy-forholdet og stabiliteten blant de tidligere nevnte systemene. Nanolucs høye signalintensitet støtter påvisning av selv svært lave mengder reporterfusjoner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) er en delt versjon av Nanoluc-systemet, som består av to segmenter: liten BiT (11 aminosyrer; SmBiT) og store BiT (LgBiT) med relativt lav affinitetsinteraksjoner (KD = 190 μM ) for å danne et lysende kompleks16. NanoBiT brukes mye i ulike studier som involverer identifisering av proteinproteininteraksjoner15,17,18,19 og cellulære signalveier11,20,21.
Nylig ble et annet lite peptid med en tydelig høyere affinitet til LgBiT (KD = 0,7 nM ) introdusert, nemlig HiBiT Nano-Glo-systemet, i stedet for SmBiT. Den høye affiniteten og det sterke signalet fra Nano-Glo-analysen "add-mix-read" gjør HiBiT til en passende, kvantitativ, lysende peptidkode. I denne tilnærmingen legges HiBiT-taggen til målproteinet ved å utvikle en konstruksjon som pålegger minimal strukturell interferens. HiBiT-proteinfusjon ville aktivt binde seg til LgBiT-motparten, og produsere et svært aktivt luciferaseenzym for å generere påviselig bioluminescens i nærvær av deteksjonsreagenser (figur 1). På samme måte utviklet vi et HiBiT Nano-Glo-basert system for å enkelt måle det nøytraliserende antistofftitren i sera av SARS-CoV-2 gjenopprettede individer og utviklet nylig en HiBiT-merket SARS-CoV-2 RBD. Dette dokumentet beskriver protokollen for produksjon av HiBiT-RBD bioreporter ved hjelp av standard laboratorieprosedyrer og utstyr, og viser hvordan denne bioreporteren kan brukes i en rask og effektiv analyse for å oppdage SARS-CoV-2 RBD-målrettede antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen beskrevet nedenfor overholder alle etiske retningslinjer i henhold til protokollkode 20200371-01H.
1. Produksjon og evaluering av HiBiT-RBD bioreporter
- Produserer en tilstrekkelig mengde HiBiT-RBD bioreporter
- Forbered deg på cellekultur
- Forbered komplett Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) som inneholder 10% foster bovin serum og 1% penicillin / streptomycin. Varm deretter mediet i et 37 °C vannbad.
- Slå på det biologiske sikkerhetsskapet (BSC), og bruk 70 % v/v etanol til sterilisering av kabinettoverflaten.
- Kultur cellelinjen.
- Ta ut cellelinjen fra -80 °C eller flytende nitrogen, og tin den i et vannbad på 37 °C.
MERK: En passende cellelinje er lett å vedlikeholde i kulturen, har høy transfeksjonseffektivitet og er egnet for eksogen proteinproduksjon. Human embryonal nyre, HEK293 celler ble brukt til denne protokollen. - Bland de tinte cellene med minst 10 ml komplett medium, pipette celleopphenget til en 10 cm Petri-tallerken, og virvle platen for å distribuere celler i parabolen jevnt. Plasser retten i en cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 og 85–95 % fuktighet.
- Vær oppmerksom på cellene under mikroskopet til konfluensanivået når 80-90%. Ved høy samløp, fjern mediet, vask cellene med varm fosfatbufret saltvann (PBS), og tilsett 1 ml 0,25% trypsin-etylendiamin tetraacetic acid for å løsne cellene fra overflaten.
MERK: HEK293-cellene er ganske enkelt løsrevet. Derfor bør vasketrinnet gjøres veldig forsiktig for å forhindre utilsiktet løsrivelse og tap av celler. - Etter ca. 5 min, se på cellene under et mikroskop. Hvis alle cellene flyter, legg til minst 4 ml medium, og overfør celleopphenget til et nytt sterilt rør. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer, og tilsett 1 × 106 celler i hver brønn av en 6-brønns plate for transfeksjon.
MERK: Etter 24 timer skal cellene være på 80 % eller mer konfluensa.
- Ta ut cellelinjen fra -80 °C eller flytende nitrogen, og tin den i et vannbad på 37 °C.
- Transfeksjon av HiBiT-RBD plasmid
- Bruk 1 μg av HiBiT-RBD-uttrykket plasmid med et egnet transfeksjonsreagens. Inkuber i 10-15 min ved romtemperatur, og legg deretter det totale volumet til hver brønn på platen, drop-wise.
MERK: Følg produsentens transfeksjonsprotokoll. I dette tilfellet ble en blanding (en bestemt mengde) av transfeksjonsreagenset med DMEM tilsatt til den fortynnede plasmiden (1 μg) i DMEM (se materialtabellen). Bruk en markør som inneholder (f.eks. grønt fluorescerende protein [GFP]) plasmid som en kontroll for å overvåke transfeksjonseffektiviteten. - På neste dag erstatter du mediet som inneholder transfeksjonsblandingen med komplett medium. Vær oppmerksom på transfeksjonskontrollbrønnen 48 timer etter transfeksjon.
MERK: Hvis transfeksjonen var positiv og effektiv (mer enn 80% GFP-positiv), bør cellene være klare til høsting av HiBiT-RBD bioreporter. Konstruksjonen inneholder også His-tag, som kan brukes til å skaffe renset protein i stedet for den totale supernatanten. - Samle supernatanten i 1,5 ml mikrorør. Tilsett 500 μL 1x passiv lysisbuffer (PLB) i cellene; inkuber og rist platen i 15 min ved romtemperatur for cellelys.
MERK: Supernatanten og lysatoppløsningen kan bevares ved -20 °C med mindre tap av integritet i minst 6 måneder. Ifølge Azad et al.22 er reporteren stabil ved et bredt spekter av pH (4-12) og temperatur (4-42 °C).
- Bruk 1 μg av HiBiT-RBD-uttrykket plasmid med et egnet transfeksjonsreagens. Inkuber i 10-15 min ved romtemperatur, og legg deretter det totale volumet til hver brønn på platen, drop-wise.
- Forbered deg på cellekultur
- Evaluering av lystetthetssignalet fra bioreporteren ved luciferaseanalyse
- Klargjøre reaksjonskomponentene
- Bruk supernatanten som kilde til bioreporteren.
MERK: Både supernatant og lysat inneholder HiBiT-RBD bioreporter og kan brukes til analysen. Supernatanten anbefales imidlertid som kilde på grunn av årsaker som er forklart i følgende notater. - Fortynn LgBiT og substratet til 1x før bruk (lagerkonsentrasjonen er 100x).
MERK: Se materialtabellen for detaljer om LgBiT.
- Bruk supernatanten som kilde til bioreporteren.
- Luciferase-analyse
- Overfør 50 μL av supernatanten fra hver brønn eller rør til en 96-brønns plate, og tilsett 50 μL 1x LgBiT til hver brønn. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Åpne luminometerprogramvaren, tilsett 50 μL 1x substrat (furimazin) til hver brønn, plasser platen i luminometeret og kjør programvaren.
MERK: Tilsett substratet umiddelbart før du leser platen for å forhindre forbruk av substratet av de aktive enzymene før signalmåling.
- Klargjøre reaksjonskomponentene
2. Oppdage anti-RBD antistoff med en rask og sensitiv analyse
- HiBiT-RBD antistoff deteksjon analyse
- Klargjør HiBiT-RBD bioreporter som beskrevet i avsnitt 1.1 i protokollen.
MERK: Det anbefales å bruke supernatanten for følgende analyse, da det er enklere å samle og inneholder den modne glykosylerte versjonen av proteinet. Videre har lysatet flere andre proteiner som kan forstyrre HiBiT-RBD-antistoffinteraksjonen. - Kombiner 50 μL av HiBiT-RBD-inneholdende supernatant med 1 μg av det kommersielle SARS-CoV-2-RBD-antistoffet i et 1,5 ml mikrorør. Tilsett 20 μL immunglobulinbindende protein (protein G) til løsningen. Få opp det totale volumet til 300 μL ved å legge til PBS.
MERK: Det totale volumet av blandingen kan reduseres til 150 μL. Lavere totale volumer anbefales ikke, da det kan føre til utilstrekkelig blanding av antistoffer med bioreporteren. - Inkuber røret(e) på en rør shaker eller rotator i 30 min. Sentrifuge ved 12.000 × g i 30 s, kast supernatanten og vask med PBS. Gjenta prosessen tre ganger for å fjerne gratis HiBiT-RBD. Resuspend i 50 μL PBS og overfør til en 96-brønns plate.
- Tilsett 50 μL 1x LgBiT og vent i 5 min. Tilsett deretter 50 μL 1x NanoLuc-substrat. Les umiddelbart lystetthetssignalet med et luminometer.
- Klargjør HiBiT-RBD bioreporter som beskrevet i avsnitt 1.1 i protokollen.
3. Høygjennomstrømningsdeteksjon av SARS-CoV-2-spesifikke antistoffer fra pasientserumprøver
- Forbered større mengder HiBiT-RBD bioreporter for en høy gjennomstrømningsanalyse ved å følge avsnitt 1.1 i protokollen.
- Kombiner 20 μL magnetisk protein G med 50 μL HiBiT-RBD supernatant i en brønn på 96-brønnsplate for hver prøve. Tilsett 10 μL av serumprøven til hver brønn og få opp det totale volumet til 150 μL ved å legge til PBS.
MERK: Bruk både ikke-spesifikk IgG (negativ kontroll) og nøytralisereNDE SARS-CoV-2 antistoff (positiv kontroll) ved 1 μg/ml konsentrasjon som beskrevet i trinn 2.1.2. Videre kan serumprøver fra vaksinerte mus også vurderes for antistoffer. I denne testen ble serumprøver hentet fra Ottawa Hospital General Campus under en godkjent prosedyre og med informert samtykke fra enkeltpersoner. - Inkuber i 30 min på en shaker ved romtemperatur. Plasser platen på en magnetisk vaskemaskin for å utfelle proteinet G-antistoffkomplekset.
MERK: Den spesifikke strukturen til den magnetiske skiven vil utfelle komplekset på sideveggene til hver brønn. - Kast løsningen i den midterste delen av hver brønn, og legg til PBS for vasking. Gjenta vasketrinnet minst tre ganger for å fjerne overflødig HiBiT-RBD. Tilsett 50 μL 1x PBS og 50 μL 1x LgBiT. Inkuber i minst 5 min ved romtemperatur.
- Forbered luminometerprogramvaren, og tilsett deretter 50 μL 1x substrat. Plasser platen i maskinen, kjør programvaren og registrer signalene. Sammenlign signalene fra serumprøver, kontrollprøver og bakgrunn (tomme brønner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Signalene fra både HiBit-RBD-inneholdende cellelys og supernatant av de transfiserte cellene ble registrert (figur 2) for å evaluere riktig proteinkilde. HiBiT-RBD og LgBit ble brukt separat som kontroller, og dataene viste lav bakgrunn sammenlignet med et sterkt signal da begge delene ble kombinert. Derfor er HiBiT-RBD-interaksjon med LgBiT nødvendig for å generere aktivt enzym for substrat fordøyelse og bioluminescensaktivitet (figur 1).
Tilsetningen av protein G vil hjelpe antistoffutfelling (figur 3). Analysen ble brukt til å sammenligne signalet fra et kommersielt SARS-CoV-2-nøytraliserende antistoff med en kontroll-IgG. Det spesifikke antistoffsignalet var robust, mens kontrollantistoffet hadde nær det lysende bakgrunnsnivået (figur 4A). Rekombinant svekket onkolytisk vesikulær stomatittvirus (VSV) med en mutasjon i posisjon 51 av M-proteinet (Δ51) som uttrykte eksogen RBD ble brukt til å vaksinere mus. Serumet som ble samlet inn fra vaksinerte mus, ga et robust signal sammenlignet med ingen signaler hos mus injisert med kontroll VSV (figur 4B).
Figur 1: LgBiT-interaksjon med HiBiT koblet til RBD. Ved interaksjon av den lille delen av nanoluciferase, HiBiT, med den store underenheten av enzymet, LgBiT, kan det aktive enzymkomplekset produsere et lysende signal etter substratforbruk. RBD forstyrrer ikke denne prosessen. Forkortelser: RBD = reseptorbindingsdomene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Robust reporteraktivitet fra både lysat og supernatant av transfekterte celler. Proteinet er til stede i både supernatant og lysat og gir et sterkt signal. Kontrollgruppenes lysende signaler var nær bakgrunnen. Feilfelt representerer Standardavvik (SD). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk for HiBiT-RBD-interaksjonen med antistoffer bundet til protein G. Skjematisk skildrer antistoffutfellingen ved protein G og interaksjon med HiBiT-RBD. Tilsetningen av LgBit til blandingen vil gi et robust signal når antistoffet er spesifikt for RBD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: HiBiT-RBD bioreporter genererer sterk bioluminescens med rensede nøytraliserende antistoffer, vaksinert museserum og pasientserumprøver. (A) HiBiT-RBD samhandler med RBD-spesifikt nøytraliserende antistoff og genererer betydelig høyt signal sammenlignet med det ubetydelige signalet for ikke-spesifikk IgG. (B) Bioreporteren kan oppdage SARS-CoV-2 antistoffer i vaksinert museserum. Forkortelser: RBD = reseptorbindingsdomene; IgG = immunglobulin G; Ab = antistoff; VSV = vesikulær stomatittvirus; Fluc = firefly luciferase. (C) Påvisning av SARS-CoV-2 antistoffer i pasientserumprøver, gjengitt fra Azad et al.22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det økende antallet personer som er smittet med SARS-CoV-2 og den pågående innsatsen for global vaksinasjon, krever sensitive og raske serologiske tester som kan brukes i store serosurveys. Nyere forskning viser at splittede nanoluciferasebaserte bioreportere kan brukes til å utvikle slike analyser. Vi utviklet nylig HiBiT-RBD bioreporter for å designe en test som kan brukes til å oppdage SARS-CoV-2-spesifikke antistoffer i pasientserum på en rask og pålitelig måte (figur 4C).
Det er noen kritiske trinn i denne analysen. Fordi systemets effektivitet avhenger av RBD-proteinuttrykk, bør proteinnivåene valideres av vestlig blotting. Videre er det nødvendig å bruke en positiv kontroll, for eksempel et kommersielt antistoff mot RBD, og et negativt kontrollantistoff. Tilsetning av et Nanoluciferase protein anbefales å brukes som en positiv kontroll for bioluminescensdeteksjon. Proteinproduktet inneholder også en His-tag, som kan brukes til rensing for et stort antall serumprøver.
Det er flere fordeler med å bruke denne bioreporteren sammenlignet med andre konkurrerende metoder. For det første kan en erfaren bruker utføre hele analyseprosedyren på mindre enn en time, noe som er betydelig raskere enn eksisterende tester som ELISA. For det andre gjør minimumskravene til forberedelse og testing denne testen svært verdifull for storskala produksjon til en lav pris. Dessuten er deteksjonsgrensen for analysen så lav som 1 ng av SARS-CoV-2-nøytraliserende antistoff som beskrevet av Azad et al.22. En ulempe ved denne tilnærmingen er manglende evne til å skille mellom forskjellige antistoffisotyper. Fremover bør følsomheten til testen sammenlignes med andre rutinemessig brukte serologiske tester.
Azad et al. 22 hadde brukt serumprøver fra pasienter for å evaluere analysens anvendbarhet. Det er også viktig at systemet testes for antistoffdeteksjon i blodprøver fra pasienter. Dette verktøyet kan også ha stor innvirkning i vurderingen av sammenhengen mellom alvorlighetsgraden av COVID-19 og tilstedeværelsen av SARS-CoV-2-spesifikke antistoffer. Totalt sett kan slike serologiske tester ha en betydelig innvirkning på å estimere den epidemiologiske effekten av SARS-CoV-2 og kan være en praktisk erstatning for tidkrevende og mindre sensitive deteksjonsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi setter pris på og takker den tekniske hjelpen til Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin og Christiano Tanese De Souza. Vi takker også Mina Ghahremani for grafisk design. Vi vil også takke alle personene som deltok og donerte blodprøvene sine for denne studien. DWC støttes delvis av uOttawa Fakultet og Institutt for medisin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- World Health Organization. COVID-19 vaccines. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021).
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega. , Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021).
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
