Summary

Farelerde Modelleme İnme: Fototomboz ile Fokal Kortikal Lezyonlar

Published: May 06, 2021
doi:

Summary

Burada açıklanan fototrombotik inme modeli, bir inmenin, ışığa duyarlı bir boyanın kullanılmasından sonra lazer aydınlatma kullanılarak kalıcı mikrovasküler tıkanıklık indüklenerek sağlam kafatasından üretildiği yerdir.

Abstract

İnme, gelişmiş ülkelerde önde gelen bir ölüm nedeni ve edinilmiş yetişkin engelidir. Yeni terapötik stratejiler için kapsamlı araştırmalara rağmen, inme hastaları için sınırlı terapötik seçenekler vardır. Bu nedenle, inme sonrası inflamasyon, anjiogenez, nöronal plastisite ve rejenerasyon gibi patofizyolojik yollar için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. İn vitro modellerin beynin karmaşıklığını yeniden üretememesi göz önüne alındığında, deneysel inme modelleri bu mekanizmalar için yeni ilaç hedeflerinin analizi ve daha sonra değerlendirilmesi için gereklidir. Buna ek olarak, sözde çoğaltma krizinin üstesinden gelmek için tüm prosedürler için ayrıntılı standartlaştırılmış modellere acilen ihtiyaç vardır. ImmunoStroke araştırma konsorsiyumu içinde bir çaba olarak, Rose Bengal’in intraperitoneal enjeksiyonu ve sağlam kafatasının 561 nm lazerle aydınlatılması kullanılarak standartlaştırılmış bir fototrombotik fare modeli tanımlanmıştır. Bu model, invaziv cerrahi olmadan beynin herhangi bir kortikal bölgesine tahsisi ile farelerde inme performansına izin verir; böylece, beynin çeşitli bölgelerinde inme çalışmasını sağlar. Bu videoda histolojik analiz ile birlikte fototropombotik modelde inme indüksiyonunun cerrahi yöntemleri gösterilmiştir.

Introduction

İskemik inme, 2017 yılındadünyaçapında yaklaşık 2,7 milyon ölümün 21. Bilim camiasının muazzam çabalarına rağmen, çok az tedavi mevcuttur. Ayrıca, bu kadar yüksek dışlama kriterleri ile, zaten sınırlı olan bu seçeneklere birçok hasta erişilemez, bu da inme sonrası fonksiyonel iyileşmeyi iyileştirmek için yeni tedavilere acil bir ihtiyaçla sonuçlanır.

İn vitro modellerin beynin karmaşık etkileşimlerini kopyalayamamaları göz önüne alındığında, hayvan modelleri preklinik inme araştırmaları için gereklidir. Fareler inme araştırma alanında en sık kullanılan hayvan modelidir. Bu fare modellerinin çoğunluğu, insan inme lezyonlarının çoğunluğu MCA bölgesinde bulunduğundan orta serebral arter (MCA) içindeki kan akışını engelleyerek enfarktüsleri teşvik etmeyi amaçlamaktadır2. Bu modeller insan inme lezyonlarını daha iyi rekapitüle etse de, enfarktüs hacim değişkenliği yüksek konvülatlı ameliyatları içerir.

Rosenblum ve El-Sabban’ın 1977’de fototropombotik modelin önerisinden bu yana3ve daha sonra bu modelin sıçanlara uygulanması Watson ve ark.4, iskemik inme araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaya başladı5,6. Fototropotik inme modeli, daha önce kan akışına enjekte edilen ışığa duyarlı bir boyanın fotoaktivasyonu sonucu lokal ve tanımlanmış bir kortikal enfarktüse neden olur. Bu, ışığa maruz kalan bölgelerdeki damarların lokal trombozuna neden olur. Kısaca, enjekte edilen ışığa duyarlı boyadan ışığa maruz kalınca, endotel hücre zarının lokalize oksidatif yaralanması indüklenir, trombosit toplama ve trombüs oluşumuna yol haline getirilir, ardından serebral kan akışının lokal bozulması7.

Bu tekniğin temel avantajı, uygulama basitliği ve lezyonun istenen bölgeye yönlendirilmesi olasılığındadır. Diğer deneysel inme modellerinden farklı olarak, lezyon sağlam kafatasının aydınlatılmasıyla indüklendikçe fototropombotik inme modelini gerçekleştirmek için küçük cerrahi uzmanlığa ihtiyaç vardır. Ayrıca, iyi sınırlanmış sınırlar (Şekil 2A ve Şekil 5B) ve lezyonu belirli bir beyin bölgesine teşvik etme esnekliği, iskemik veya bozulmamış kortikal alan içindeki hücresel yanıtların incelenmesini kolaylaştırabilir8. Bu nedenlerden dolayı, bu yaklaşım kortikal plastisitenin hücresel ve moleküler mekanizmalarının incelenmesi için uygundur.

Son birkaç on yılda, araştırma grupları arasında tekrarlanabilirlik eksikliği ile ilgili artan endişe, sözde çoğaltma krizi9. 2015 yılında ilk preklinik randomize kontrollü çok merkezli deneme çalışmasının koordinasyonundan sonra10, preklinik araştırma11 , 12,13geliştirmek için önerilen bir araç , bağımsız laboratuvarlardan preklinik çalışmalar arasında tekrarlanabilirliğin başarısız olmasının bir nedeninin deneysel inme modellerinin ve sonuç parametrelerinin yeterli standardizasyonunun olmaması olduğu doğrulandı14. Buna göre, inme iyileşmesinin mekanistik ilkelerinin altında kalan beyin-bağışıklık etkileşimlerini anlamayı amaçlayan bir işbirliği olan ImmunoStroke konsorsiyumu kurulduğunda (https://immunostroke.de/), her araştırma grubu arasındaki tüm deneysel inme modellerinin standardizasyonu esastı.

Burada açıklanan, yukarıda belirtilen araştırma konsorsiyumunda kullanıldığı gibi fototropombotik modelin indüksiyonu için standartlaştırılmış prosedürdür. Kısaca, bir hayvana anestezi uygulandı, intraperiton olarak bir Gül Bengal enjeksiyonu (10 μL / g) alındı ve bregma’dan 3 mm kalan sağlam kafatası, 20 dakika boyunca 561 nm lazerle hemen aydınlatıldı (Şekil 1). Ayrıca, bu modeldeki inme sonucunu analiz etmek için ilgili bir histolojik ve davranışsal yöntem bildirilmiştir. Tüm yöntemler laboratuvarda geliştirilen ve kullanılan standart çalışma prosedürlerine dayanmaktadır.

Protocol

Bu videoda bildirilen deneyler, deney hayvanlarının kullanımına ilişkin ulusal yönergelere göre yapılmış ve protokoller Alman hükümet komiteleri (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan fareler, 10-12 haftalık erkek C57Bl/6J farelerdi ve Charles River Germany tarafından sevk edildi. Hayvanlar kontrollü sıcaklıklar (22 °C ± 2 °C) altında, 12 saat açık-karanlık döngü süresi ve peletlenmiş yiyecek ve su reklam libitum erişimi …

Representative Results

Burada açıklanan model, Rose Bengal enjeksiyonu ve 20 dakika boyunca bozulmamış kafatası aydınlatması ile, fiberde sabit bir 561 nm dalga boyunda ve 25 mW çıkış gücünde fototropotik bir inme modelidir. Fototropotik cerrahinin tamamı 30 dakika sürmesine rağmen, hayvan düşük anestezi altında tutulur ve beyin hasarı orta derecededir. Kafeslerine transfer edildikten yaklaşık 10 dakika sonra, tüm hayvanlar uyanıktı, kafeste serbestçe hareket ediyordu ve çöp arkadaşlarıyla etkileşime giriyordu.<…

Discussion

Sunulan protokol, sağlam kafatasını 561 nm lazerle aydınlatarak, rose Bengal’in önceki intraperitoneal enjeksiyonu ile fotorombozun deneysel inme modelini açıklar. Yakın zamana kadar, bu modelin kullanımı düşük olmuştur, ancak sürekli olarak artmaktadır.

Bu modelde inme indüksiyonu sırasında mortalite yoktur. Genel mortalite% 5’ten az, ameliyat sırasında anestezik komplikasyonlar veya dışlama kriterlerini yerine geldikten sonra kurban etme nedeniyle ortaya çıkar. Bu mo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Immunostroke Konsorsiyumu’nun (FOR 2879, For immune cells to stroke recovery) tüm işbirliği ortaklarımıza öneriler ve tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından Münih Sistem Nörolojisi Kümesi (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) çerçevesinde ve LI-2534/6-1 hibeleri kapsamında Almanya’nın Mükemmellik Stratejisi kapsamında finanse edildi. LI-2534/7-1 ve LL-112/1-1.

Materials

561 nm wavelenght laser Solna Cobolt HS-03
Acetic Acid Sigma Life Science 695092
Anesthesia system for isoflurane Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100
Bepanthen pomade Bayer 1578681
C57Bl/6J mice Charles River 000664
Collimeter Thorlabs F240APC-A
Cotons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Filter paper Macherey-Nagel 432018
Fine Scissors FST 15000-00
Forceps FST 11616-15
Heating blanket FHC DC Temperature Controller  40-90-8D
Isoflurane Abbot B506
Isopentane Fluka 59070
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle Perimed PeriCam PSI HR
Mayor Scissors FST 1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Protective glasses Laser 2000 NIR-ZS2-38
Rose Bengal Sigma Aldrich 198250-5G
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
Saline solution Braun 131321
Stereomikroskop Zeiss Stemi DV4
Stereotactic frame Stoelting 51500U
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Xylacine Albrecht

References

  1. GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
  2. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
  3. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
  4. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
  5. Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2003).
  6. Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
  7. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
  8. Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
  9. McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
  10. Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
  11. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
  12. Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
  13. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
  14. Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
  15. Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
  16. Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
  17. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
  18. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  19. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
  20. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
  21. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
  22. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
  23. Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
  24. Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
  25. Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
  26. Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
  27. Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
  28. Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
  29. Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
  30. Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
  31. Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).

Play Video

Cite This Article
Llovera, G., Pinkham, K., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis. J. Vis. Exp. (171), e62536, doi:10.3791/62536 (2021).

View Video