Beskrevet her er den fotothrombotiske slagtilfælde model, hvor et slagtilfælde er produceret gennem intakt kraniet ved at fremkalde permanent mikrovaskulær okklusion ved hjælp af laser belysning efter administration af en lysfølsom farvestof.
Slagtilfælde er en førende dødsårsag og erhvervet voksne handicap i de udviklede lande. På trods af omfattende undersøgelse for nye terapeutiske strategier, der fortsat begrænsede terapeutiske muligheder for slagtilfælde patienter. Derfor er der behov for mere forskning for patofysiologiske veje såsom betændelse efter slagtilfælde, angiogenese, neuronal plasticitet og regenerering. I betragtning af in vitro-modellernes manglende evne til at reproducere hjernens kompleksitet er eksperimentelle slagtilfældemodeller afgørende for analysen og den efterfølgende evaluering af nye lægemiddelmål for disse mekanismer. Desuden er der et presserende behov for detaljerede standardiserede modeller for alle procedurer for at overvinde den såkaldte replikationskrise. Som en indsats inden for ImmunoStroke forskningskonsortium beskrives en standardiseret fotothrombotisk musemodel ved hjælp af en intraperitoneal injektion af Rose Bengal og belysningen af det intakte kranium med en 561 nm laser. Denne model tillader udførelsen af slagtilfælde hos mus med tildeling til enhver kortikal region i hjernen uden invasiv kirurgi; således gør det muligt at studere slagtilfælde i forskellige områder af hjernen. I denne video demonstreres de kirurgiske metoder til slagtilfældeinduktion i den fotothrombotiske model sammen med histologiske analyser.
Iskæmisk slagtilfælde er fortsat en hovedårsag til død og erhvervet voksen handicap i de udviklede lande i det 21. århundrede tegner sig for ca. 2,7 millioner dødsfald i 2017 på verdensplan1. Selv med den enorme indsats fra det videnskabelige samfund er der kun få behandlinger tilgængelige. Med så høje udelukkelseskriterier er disse allerede begrænsede muligheder desuden ikke tilgængelige for mange patienter, hvilket resulterer i et presserende behov for nye behandlinger for at forbedre funktionel genopretning efter slagtilfælde.
I betragtning af in vitro-modellernes manglende evne til at kopiere hjernens komplekse interaktioner er dyremodeller afgørende for præklinisk slagtilfældeforskning. Mus er den hyppigst anvendte dyremodel inden for slagtilfældeforskning. De fleste af disse musemodeller har til formål at fremkalde infarkt ved at blokere blodgennemstrømningen i den midterste cerebral arterie (MCA), da størstedelen af humane slagtilfældelæsioner er placeret i MCA-territoriet2. Selv om disse modeller bedre opsummere menneskelige slagtilfælde læsioner, de involverer kramper operationer med høj infarkt volumen variation.
Siden Rosenblum og El-Sabban’s forslag om den fotothrombotiske model i 19773, og senere anvendelsen af denne model på rotter Watson et al.4, er det blevet meget udbredt i iskæmisk slagtilfælde forskning5,6. Den fotothrombotiske slagtilfælde model fremkalder en lokal og defineret kortikale infarkt som følge af fotoaktivering af en lysfølsom farvestof tidligere injiceres i blodgennemstrømningen. Dette forårsager lokal trombose af fartøjerne i de områder, der udsættes for lys. Kort, ved udsættelse for lys fra det injicerede lysfølsomme farvestof, fremkaldes lokaliseret oxidativ skade af endotelcellemembranen, hvilket fører til blodpladesammenlægning og trombrandannelse efterfulgt af lokal forstyrrelse af cerebral blodgennemstrømning7.
Den største fordel ved denne teknik ligger i dens enkelhed i udførelsen og muligheden for at lede læsionen til den ønskede region. I modsætning til andre eksperimentelle slagtilfælde modeller, mindre kirurgisk ekspertise er nødvendig for at udføre den fotothrombotic slagtilfælde model som læsionen er induceret gennem belysning af intakt kraniet. Desuden kan de velafgrænsede grænser ( figur 2A og figur 5B) og fleksibiliteten til at fremkalde læsionen til en bestemt hjerneregion lette undersøgelsen af cellulære reaktioner inden for det iskæmiske eller intakte kortikale område8. Af disse grunde er denne tilgang egnet til undersøgelse af cellulære og molekylære mekanismer af kortikal plasticitet.
I løbet af de sidste par årtier er den voksende bekymring over den manglende reproducerbarhed mellem forskergrupper blevet opfundet den såkaldte replikationskrise9. Efter koordineringen af den første prækliniske randomiserede kontrollerede multicenterforsøgsundersøgelse i 201510, et foreslået værktøj til forbedring af præklinisk forskning11,12,13, blev det bekræftet , at en årsag til manglende reproducerbarhed mellem prækliniske undersøgelser fra uafhængige laboratorier var manglen på tilstrækkelig standardisering af eksperimentelle slagtilfældemodeller og resultatparametre14. Derfor, da ImmunoStroke-konsortiet blev etableret (https://immunostroke.de/), var et samarbejde, der har til formål at forstå hjerneimmune interaktioner, der ligger til grund for de mekanistiske principper for slagtilfældegendannelse, standardisering af alle de eksperimentelle slagtilfældemodeller blandt hver forskningsgruppe afgørende.
Beskrevet her er den standardiserede procedure for induktion af den fotothrombotiske model, som anvendes i ovennævnte forskningskonsortium. Kort sagt gennemgik et dyr bedøvelsesmidler, fik en Rose Bengal-injektion (10 μL/g) intraperitonally, og det intakte kranium, 3 mm tilbage fra bregma, blev straks oplyst af en 561 nm laser i 20 min (Figur 1). Derudover rapporteres en relateret histologisk og adfærdsmæssig metode til at analysere slagtilfælderesultatet i denne model. Alle metoder er baseret på standard driftsprocedurer udviklet og anvendt i laboratoriet.
Den præsenterede protokol beskriver den eksperimentelle slagtilfælde model af fotothrombose ved at belyse den intakte kraniet med en 561 nm laser, med en tidligere intraperitoneal injektion af Rose Bengal. Indtil for nylig har brugen af denne model været lav, men er støt stigende.
Dødelighed under slagtilfælde induktion i denne model er fraværende. Den samlede dødelighed på under 5% opstår under drift på grund af anæstesiologiske komplikationer eller ofre efter at have opfyldt udel…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle vores samarbejdspartnere i Immunostroke Consortia (FOR 2879, Fra immunceller til slagtilfælde opsving) for forslag og diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellencestrategi inden for rammerne af München-klyngen for system neurologi (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) og under tilskud LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 og LL-112/1-1.
561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Xylacine | Albrecht |