تقنيات الميكروجينكشن ضرورية لإدخال الجينات الخارجية في جينوم البعوض. يشرح هذا البروتوكول طريقة استخدمها مختبر جيمس لاستئصال الحمض النووي الدقيق في أجنة أنوفيليس غامبيا لتوليد البعوض المتحول.
تقنيات الميكروينجيكشن الأجنة ضرورية للعديد من الدراسات الجزيئية والجينية لأنواع الحشرات. أنها توفر وسيلة لإدخال شظايا الحمض النووي الخارجي ترميز الجينات ذات الاهتمام، فضلا عن الصفات المواتية في الجرثومة الحشرات بطريقة مستقرة وناقلة. ويمكن دراسة السلالات المعدلة وراثيا الناتجة عن التغيرات phenotypic الناتجة عن التعبير عن الحمض النووي المتكامل للإجابة على الأسئلة الأساسية أو استخدامها في التطبيقات العملية. على الرغم من أن التكنولوجيا واضحة ، فإنه يتطلب من المحقق الصبر والممارسة لتحقيق مستوى من المهارة التي تزيد من الكفاءة. يظهر هنا هو وسيلة لmicroinjection من أجنة البعوض الملاريا الأفريقية، Anopheles غامبيا. والهدف من ذلك هو تقديم الحمض النووي الخارجي عن طريق الميكروجين إلى الجنين بحيث يمكن تناوله في الخلايا الجرثومية النامية (القطب). التعبير من الحمض النووي المحقون للمتحولات أو العبارات الصحيحة أو إعادة التركيب أو النوى الأخرى (على سبيل المثال البروتينات المرتبطة ب CRISPR ، Cas) يمكن أن يؤدي إلى أحداث تؤدي إلى إدخاله التساهمي في الكروموسومات. وقد استخدمت الغامبية المعدلة وراثيا الناتجة عن هذه التكنولوجيات للدراسات الأساسية لمكونات الجهاز المناعي، والجينات المشاركة في تغذية الدم، وعناصر من نظام الشم. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت هذه التقنيات لإنتاج سلالات من الغامبيين ذات سمات قد تساعد على مكافحة انتقال طفيليات الملاريا.
وقد استخدمت تقنيات الميكروبيكشن للتلاعب تجريبيا الكائنات الحية منذ أوائل 1900s1. وقد استخدم الميكروبيكشن لدراسة كل من الوظائف البيولوجية الأساسية و / أو إدخال تغييرات هامة في بيولوجيا الكائن الحي المطلوب. وقد تقنية microinjection ذات أهمية خاصة لعلماء الأحياء ناقلات واستخدمت على نطاق واسع للتلاعب ناقلات الجينوم2-11. غالبا ما تهدف تجارب التكوين عبر المفصليات إلى جعل النواقل أقل كفاءة في نقل مسببات الأمراض إما عن طريق سن تغييرات تقلل من لياقة الناقل أو تزيد من الانكسار إلى مسببات الأمراض التي تنقلها. ينقل البعوض مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض البشرية ويكون له تأثير كبير على المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. جنس Anopheles من البعوض ينقل مسببات الأمراض الطفيلية الملاريا البشرية ، Plasmodium spp. وقد استهدفت تجارب الهندسة الوراثية مع Anopheles فهم أفضل لعلم الأحياء والحد من القدرة النواقل لهذه البعوض في الجهود الرامية إلى وضع استراتيجيات جديدة للقضاء على الملاريا.
وناقلات البعوض التي تسهم في أكبر عدد من الإصابات بالملاريا في جميع أنحاء العالم تقع في مجمع الأنواع الغامبية في أنوفيليس. ومع ذلك، فقد أجريت معظم التجارب الناجحة transgenesis على ناقلات الملاريا في شبه القارة الهندية، أنوفيليس ستيفنسي. في حين أن الكثير من السلالات الغامبية Anopheles تكييفها مختبرية موجودة, عدد من المعدلة وراثيا Anopheles غامبيا spp. خطوط ذكرت في الأدب لا يقارن إلى أن من أنوفيليس ستيفنسي. ويعتقد أن الجنين غامبي Anopheles هو أكثر صعوبة لحقن وتحقيق transgenesis ناجحة من أنوفيليس ستيفنسي, على الرغم من أن أسباب هذه الاختلافات غير معروفة. يصف هذا البروتوكول طريقة ثبت نجاحها باستمرار في تحقيق توليد الأجنة الغامبية الأنوفيليس عن طريق التلقيح الدقيق. ويستند البروتوكول على طريقة تم تطويرها سابقا من قبل هيرفي بوسين ومارك بنديكت12 مع بعض التفاصيل الإضافية والتعديلات المضافة التي تم العثور عليها لزيادة كفاءة transgenesis.
ومع زيادة توافر تكنولوجيات الهندسة الوراثية الدقيقة والمرنة مثل CRISPR/Cas9، يمكن تطوير الكائنات المعدلة وراثيا بطريقة أكثر مباشرة واستقرارا مما كان ممكنا من قبل. وقد سمحت هذه الأدوات للباحثين بإنشاء سلالات معدلة وراثيا من ناقلات البعوض التي هي قريبة جدا من تحقيق الخصائص المرجوة إما الانكسا?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لدروزيلا ستيلينغر، كيونا باركر، باريش باول ومادلين نوتولي تربية البعوض. وقدمت مبادرة إيرفين للملاريا التابعة لجامعة كاليفورنيا التمويل. AAJ هو أستاذ دونالد برين في جامعة كاليفورنيا، إيرفين.
10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
Forceps | No. 5 size | ||
Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
KCl | 50 mM | ||
Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
Micropipette | Rainin | 20 µL | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
Nylon mesh | |||
Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
Sodium acetate | 3M | ||
Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |