Summary
Mikroenjeksiyon teknikleri, sivrisineklerin genomlarına eksojen genleri sokmak için gereklidir. Bu protokol, James laboratuvarı tarafından DNA yapılarını dönüştürülmüş sivrisinekler üretmek için Anopheles gambiae embriyolarına mikroenjeze etmek için kullanılan bir yöntemi açıklar.
Abstract
Embriyo mikroenjeksiyon teknikleri böcek türlerinin birçok moleküler ve genetik çalışması için gereklidir. İlgi genlerini kodlayan eksojen DNA parçalarının yanı sıra böcek germline olumlu özellikleri istikrarlı ve kalıtsal bir şekilde tanıtmak için bir araç sağlarlar. Ortaya çıkan transgenik suşlar, temel soruları yanıtlamak için entegre DNA'nın ifadesinden kaynaklanan veya pratik uygulamalarda kullanılan fenotipik değişiklikler için incelenebilir. Teknoloji basit olmasına rağmen, verimliliği en üst düzeye çıkaran bir beceri seviyesine ulaşmak için araştırmacı sabrı ve uygulaması gerekir. Burada gösterilen Afrika sıtma sivrisinek embriyolarının mikroenjeksiyonu için bir yöntemdir, Anopheles gambiae. Amaç, gelişmekte olan mikromline (kutup) hücrelerinde alınabilmesi için embriyoya mikroenjeksiyon eksojen DNA ile teslim etmektir. Transposazların, integrazların, rekombinazların veya diğer nükleazların enjekte edilen DNA'sından (örneğin CRISPR ilişkili proteinler, Cas) gelen ifade, kromozomlara kovalent yerleştirilmesine yol açan olayları tetikleyebilir. Bu teknolojilerden üretilen Transgenik An. gambiae, bağışıklık sistemi bileşenlerinin, kan beslemede rol oynayan genlerin ve koku sisteminin elemanlarının temel çalışmaları için kullanılmıştır. Ek olarak, bu teknikler sıtma parazitlerinin bulaşmasını kontrol etmeye yardımcı olabilecek özelliklere sahip An. gambiae suşları üretmek için kullanılmıştır.
Introduction
Mikroenjeksiyon teknikleri 1900'lerin başından beri organizmaları deneysel olarak manipüle etmek için kullanılmaktadır1. Mikroenjeksiyon, hem temel biyolojik fonksiyonları incelemek hem de istenen bir organizmanın biyolojisinde önemli değişiklikler sağlamak için kullanılmıştır. Mikroenjeksiyon tekniği vektör biyologlarının özellikle ilgisini çekmiştir ve vektör genomlarını manipüle etmek için yaygın olarak kullanılmıştır2-11. Eklembacaklı vektörlerdeki transgenez deneyleri genellikle vektörün kondisyonını azaltan veya ilettikleri patojenlere refrakterliği artıran değişiklikleri yürürlüğe koyarak vektörleri patojenlerin iletiminde daha az verimli hale getirmeyi amaçlamaktadır. Sivrisinekler çeşitli insan patojenlerini iletir ve dünya çapında morbidite ve mortalite üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Sivrisineklerin Anopheles cinsi, insan sıtma parazit patojenleri plasmodium spp'yi iletir. Anopheles ile yapılan genetik mühendislik deneyleri, yeni sıtma eliminasyon stratejileri geliştirme çabalarında biyolojiyi daha iyi anlamayı ve bu sivrisineklerin vektörel kapasitesini azaltmayı amaçladılar.
Dünya çapında en fazla sıtma enfeksiyonuna katkıda bulunan sivrisinek vektörleri Anopheles gambiae türleri kompleksindedir. Bununla birlikte, başarılı transgenez deneylerinin çoğu Hint alt kıtasının sıtma vektörü anopheles stephensiüzerinde gerçeklenmiştir. Laboratuvara uyarlanmış birçok Anopheles gambiae suşu mevcut olsa da, literatürde bildirilen transgenik Anopheles gambiae spp. çizgilerinin sayısı Anopheles stephensiile karşılaştırılamaz. Anopheles gambiae embriyosuna enjekte etmenin ve başarılı transgenez elde etmenin Anopheles stephensi'den daha zor olduğu düşünülmektedir Bu farklılıkların nedenleri bilinmemekle birlikte. Bu protokol, Mikroenjeksiyon yoluyla Anopheles gambiae embriyolarının transgenezini elde etmede sürekli olarak başarılı olduğu kanıtlanmış bir yöntemi açıklar. Protokol, daha önce Hervé Bossin ve Mark Benedict12 tarafından geliştirilen ve transgenezin verimliliğini artırdığı tespit edilen bazı ek ayrıntılar ve değişikliklerle birlikte geliştirilen bir yönteme dayanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sivrisineklerin mikroenjeksiyona hazırlanması
- ~100 erkek ve200-300dişi 1-2 günlük yetişkin eklosion sonrası sivrisinekler ile 13 (~5000 cm 3) bir kafes tohumlayın ve 2 gün çiftleşmelerine izin verin.
- Çiftleşme döneminden sonra, sivrisineklere yapay bir besleme cihazı ile 2 mL kan kullanarak bir kan unu sağlayın veya böcek uygulamalarına bağlı olarak uyuşturuldu hayvanlaryaşayın 14. Ertesi gün, tüm çiftleşmiş dişilerin beslenme fırsatına sahip olmasını ve kısmen beslenen sivrisineklerin tamamen kuşatılmış olmasını sağlamak için sivrisineklere ikinci bir kan unu sağlayın.
- İkinci kan yemeğinden 2-4 gün sonra embriyo koleksiyonları için sivrisinekleri kullanın.
NOT: Larva beslenmesi yetişkin sağlamlığı ve üreme zindeliği için önemlidir. Sağlıklı böceklerin nasıl yetiştirilmeleri hakkında bilgi için Benedict ve ark. (2020)14. Sivrisinekler yapay bir besleyiciyle beslendiğinde veya uyuşturulmuş hayvanlar yaşadığında yumurtlamada önemli bir fark gözlenmemiştir. Böcekçide Anopheles gambiae için rutin olarak hangi yöntem kullanılıyorsa onu kullanın.
2. Embriyo hazırlığı
- Her iki ucunda açık olacak şekilde kesilmiş (bant testeresi ile) şeffaf 50 mL konik tüpe 20-30 dişi yerleştirmek için bir aspiratör kullanın ve bir ucunda lateks diş filmi, diğer ucunda naylon ağ ve filtre kağıdı ile kaplanmıştır (Şekil 1).
NOT: Sivrisinekler yumurtalarını filtre kağıdına yatıracak ve naylon ağ filtre kağıdını güvenli bir şekilde yerinde tutacaktır. Sivrisinek yumurtaları silindirik şekilli, ~500 μm uzunluğunda, en geniş noktasında ~200 μm çapında ve ön ve arka uçlarda sivriltmedir (Şekil 2). - Sivrisinek dolu tüpü çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurulmuş küçük (60 mm x 15 mm) bir Petri kabına yerleştirin. Tüpü ve tabağı 45 dakika boyunca 28 °C'de bir inkübatöreyerleştirin (Şekil 3).
- Tüpü inkübatörden çıkarın ve tüpü boş bir kafese yerleştirin. Sivrisineklerin uçmasına izin vermek için tüpe hafifçe dokunun ve tüm sivrisinekler uçtuktan sonra tüpü kafesten çıkarın.
- Tüp sivrisineklerden arındırıldığında, alt halkayı sökün, naylonu çıkarın ve filtre kağıdını yumurtalarla birlikte tüpten dikkatlice çıkarmak için tokmaklar kullanın. Filtre kağıdını, ddH2O ile nemlendirilmiş bir filtre kağıdı tabakası içeren plastik bir Petri kabına (100 mm x 15 mm) yerleştirin.
- Yumurtalara dikkat edin. Açık gri renkte oldukları noktaya kadar yaşlanan yumurtalar (Şekil 4) hizalamaya hazırdır.
- Yumurtalar hala beyazsa, inkübatöre geri verin ve her 5 dakikada bir rengi kontrol edin. Beyaz yumurtalar kırılgandır, kolayca yırtılır ve enjeksiyon işleminden sonra düşük kuluçka ile sonuçlanan iyi hayatta kalamaz.
- Koyu gri veya siyah olan yumurtalar çok fazla yaşlandı. Onları kullanma.
3. Embriyo hizalaması
- Bir parça naylon lekeli membran (2 cm x 1 cm) jiletle kesin, kenarın düzgün bir şekilde kesildiğinden emin olun.
NOT: Kenar düz değilse, enjeksiyon işlemi sırasında yumurtalar zara düzgün bir şekilde yapıştırılmış olarak kalmaz. - Cam bir kaydırağın üzerine bir membran koyun ve membranı bir filtre kağıdı parçasıyla (2 cm x 2 cm) örtün ve membran filtresinin ~1 mm'si açık bırakarak (Şekil 5).
NOT: Mikroskop slaytlarının kullanmadan önce temiz olduğundan emin olun ve membran filtresini işlemek için temiz tokmaklar kullanın. - Filtre kağıdını deiyonize H2O ile ıslatın, çünkü uzun süre kurursa yumurtalar ölür.
NOT: Enjeksiyon işlemi sırasında embriyolar hareket edeceğinden kağıda çok fazla su koymayın, ancak embriyonun kurumasını önlemek için yeterli olduğundan emin olun (Şekil 6A, B). Fazla su bir parça filtre kağıdı ile emilerekçıkarılabilir. - 30-50 embriyoyu bir boya fırçası ile zarın kenarına hafifçe aktarın (boyut #0). Yumurtaları, ventral tarafın (dışbükey) yukarı bakacak şekilde kaydırağın üzerine hafifçe yuvarlayarak zar boyunca dikey olarak hizalamak için fırçayı kullanın.
- Tüm yumurtaları aynı yöne yönlendirin, böylece yumurtalar mikroenjeksiyon mikroskobu altında gözlendiğinde, arka uç (daha sivri, Şekil 6A, B)aşağı konumdadır ve iğne ile ~15 ° 'lik bir açı oluşturur (Şekil 6C). Zarın tüm kenarını yumurtalarla hizala (30-50) ve slaytı enjeksiyon için mikroskobun altına yerleştirin.
NOT: Yumurtaları dikkatlice seçin. Beyaz (çok genç veya gelişmemiş) veya koyu gri (çok yaşlı ve iğneyi kıracak) ve anormal olanları atın (Şekil 7). Filtre kağıdının her zaman nemli kaldığından eminolun.
4. DNA hazırlığı
- Enjeksiyon için plazmid DNA'ları, üreticinin protokollerini takip eden endotoksin içermeyen bir DNA plazmid maxiprep kiti ile en azından saflaştırın.
- DNA'yı PCR sınıfı su ve santrifüjde 17.100 x g'da, 4 °C'de 30 dakika boyunca soğutmalı bir santrifüjde yeniden kullanın. Ardından, süpernatant yeni, temiz 1,5 mL konik bir tüpe aktarın. istenmeyen partikül maddelerin sütundan aktarılmasını önlemek için dikkatlice mikro pipet.
- 3M sodyum asetatın onda biri ve iki kat %100 etanol hacmi kullanarak ikinci bir DNA çökeltme gerçekleştirin.
- DNA'yı 1000 ng/μL'lik son plazmid konsantrasyonu için 300-500 μL PCR sınıfı suda yeniden kullanın.
NOT: DNA -20 °C'de saklanabilir DNA mikroenjeksiyon aliquotları -20 °C'de veya RNA bileşenleri kullanılarak -80 °C'de saklanabilir. Enjeksiyon karışımında 800 ng/μL DNA'yı aşmayın, çünkü viskozite iğnelerin tıkanmasına neden olur.
5. İğne hazırlama
- Programlanabilir bir mikropipette çekme kullanarak 10 cm kuvars kılcal damarları çekerek iğneleri yapın.
- Ucun iyi oluştuğundan emin olmak için iğneyi mikroskop altında inceleyin. Programlanabilir çekmedeki iğne ayarının terminal ucundan ~0,5 mm sivrilmeye başlayan ve ince bir noktada biten bir uç verdiğinden emin olun (bkz. Şekil 6). Kolayca kopan iğneler genellikle çok uzun bir konik vardır.
NOT: Koşullar iğne çekeceğine bağlı olarak farklılık gösterebilir (Yazarlar, kullandıkları programlanabilir çektirme ayarlarını istek üzerine kullanıma sunacaktır. Dergi kısıtlamaları belirli bir markayı alıntılamamızı engeller). İğneler elle çekilebilir, ancak bu çoğu laboratuvarda bulunmayan bir beceri seti gerektirir.
6. Embriyo mikroenjeksiyon
- İğneleri 2 μL DNA karışımı ile doldurmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın. İğneyi iğne tutucuya yerleştirin ve otomatik basınç pompası borularını bağlayın (Şekil 8).
- Önemli: İğneyi slayt düzlemi ile 15° açı olacak şekilde hizalayın (Şekil 8).
- İlk yumurtaya dikkatlice dokunarak iğne ucunu açın ve iğnenin ucunu arka direğe 10 μm ≤ sokarak enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyon, yumurta içindeki sitoplazmın küçük bir hareketine yol açacaktır.
- Enjeksiyona devam etmek için bir sonraki yumurtaya geçmek için mikroskop koaksiyel sahne kontrollerini kullanın.
- İğne ucunun açık kalmasını ve tıkanmamasını sağlamak için, başka bir embriyoya girmeden önce Enjekte et düğmesine basın ve iğnenin açılışında küçük damlacığı görselleştirin.
- İğne tıkanırsa, iğneyi temizlemek ve damlacık görselleştirme testini tekrarlamak için Temizle düğmesine basın. Damlacığın boyutunun küçük kalmasını sağlamak için iğne ucu açıklığı biraz daha büyürse basıncı gerektiği gibi ayarlayın.
- Bir iğne ile ~40-50 yumurta enjekte edin.
NOT: Filtre kağıdının her zaman nemli kaldığından emin olun. Temiz tutmak için iğneye yeterli sırt basıncını koruyun. Tıkanamayan bir iğne yeni bir iğne ile değiştirilmelidir. Aşamanın yatay hareketi için koaksiyel kontrolleri olan mikroskoplar ile embriyo yerleştirilmesi, iğne yerleştirilmesi ve enjeksiyonu kolaylaşır (Şekil 9).
- Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, yumurtaları filtre kağıdı ile kaplı ve 50 mL deiyonize H2O (Şekil 10)ile doldurulmuş bir cam kaba durulayın.
NOT: Embriyolar enjeksiyondan 2 gün sonra yumurtadan çıkmaya başlar ve 3-5 gün kadar sürebilir. Yumurtadan çıkan ilk başlangıç larvaları derhal su ve yiyecek içeren temiz bir kaba hemen (günde 2 kez kontrol edin) aktarılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan mikroenjeksiyon protokolünün uygulanmasının temsili bir örneği Carballar-Lejarazú ve ark5 .'debulunabilir. Buradaki amaç, An. gambiae'ninG3 laboratuvar suşunun mikrop hattına otonom bir gen tahrik sistemi yerleştirmekti. Sistem, ommochrome biyosentezinin son adımı olan 3 hidroksikynureninin ksanthommatin'e dönüşümünü katalizleyen bir heme peroksidaz kodlayan bu türdeki üçüncü kromozom üzerindeki kardinal ortolog lokusu(Agcd)hedeflemek için tasarlanmıştır (Şekil 11). Homozigöz gen sürücü içeren sivrisinekler, larva, pupa ve kırmızı göz fenotipine sahip yeni ortaya çıkan yetişkinler ile fonksiyon kaybı kardinal mutantlardır. Tahrik sistemini içeren bir plazmid, pCO37, Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuclease'i An'ın düzenleyici unsurlarının kontrolü altında ifade eder. gambiae nanos gen ortologu, An. gambiae U6 gen promotörünün kontrolü altında 23 nükleotid kılavuz RNA (gRNA) ve transgenik soyu tanımlamak için siyan floresan proteini ifade eden 3XP3-CFP baskın marker kaseti. Agcd GRNA hedef kesim bölgesini kuşatırken genomik bölgelere homolog olan DNA parçaları, homolojiye yönelik onarım - (HDR) aracılı entegrasyonu mümkün klar.
Yedi yüz seksen vahşi tip An. gambiae embriyosuna SpCas9 proteini ile birlikte pCO37 plazmidi enjekte edildi. Yüz kırk altı enjekte embriyo (%18,7; G0) yetişkin aşamasına kadar hayatta kaldı ve daha sonra karşı cinsin vahşi tip üyelerine kadar aşıldı. Yeni nesil (G1)soyunun floresan mikroskop taraması, CFP belirteç geni için pozitif olan 3.428'den üçünü (%0.09) tanımladı, bunlardan sadece ikisi, bir erkek ve bir kadın hayatta kaldı. Moleküler yaklaşımlar (gen amplifikasyonu, DNA dizilimi) ~10 kb DNA'nın doğru yerleştirilmesini doğruladı ve ortaya çıkan suş AgNosCd-1 olarak belirlendi. Kapsamlı takip analizleri, AgNosCd-1'in sürüşte yüksek verimli olduğunu, birkaç dirençli alel yarattığını ve gen tahrik sisteminin entegrasyonu ve ifadesi sonucunda büyük bir genetik yükü (fitness maliyeti) olmadığınıgöstermiştir 5. pCO37 plazmid, sıtma parazitinin bulaşmasını önlemek için An. gambiae'nin popülasyon modifikasyon suşlarını geliştirmek için omurga görevi görür.
Şekil 1: Yumurta toplama cihazı. Yumurta toplama cihazı filtre kağıdı, naylon ağ, diş filmi ve retrofitlenmiş 50 mL konik tüpten oluşur. Cihaz, sivrisineklerin aspiratör tarafından diş filmlerindeki yarık yoluyla konteynere güvenli bir şekilde yatırılmasını sağlar. Filtre kağıdı ve naylon ağ, yumurtlama için nemli, ancak su basmamış bir yüzey sağlayan suyun emilmesine izin verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Anopheles gambiae embriyoları. A) Olgunlaşmanın değişen aşamalarında bir grup embriyo. B)Oklar, dönüşüm için hedeflenen hedefler olan germline hücrelerini içeren embriyo içindeki konumu olan arka kutbu gösterir. Ölçek çubuğu ~1 mm'yi temsil eder.
Şekil 3: Yumurta toplama. Sivrisinekler yumurta toplama cihazının içine yerleştirildikten sonra, ddH2O ile nemlendirilmiş bir filtre kağıdı tabakası içeren bir Petri kabına taşınır. Yumurta toplama cihazı ve Petri kabı daha sonra koyulaşmış bir inkübatöre yerleştirilir ve sivrisineklerin toplam 45 dakika boyunca oviposit yapmasına izin verilir.
Şekil 4: Embriyo gelişimi. Embriyolar sadece kısa bir süre boyunca enjeksiyon için uygundur. Gelişimde erken enjekte edilen yumurtalar çok hassastır ve zarar görür ve yumurtadan çıkmaz. Gelişimlerinde daha sonra enjekte edilen yumurtalar sertleşir ve iğneyi kırarak yumurtaya çok fazla genetik materyal enjekte edilmesine neden olabilir. Ek olarak, geliştirme aşamasındaki enjeksiyonların, kutup hücreleri hızla daha fazla replikasyon ve farklılaşma geçirdiğinden mikrop hattında kalıcı değişikliklere neden olma olasılığı daha düşüktür. Resimler 45 dakikalık yumurtlama süresinden sonra her 10 dakikada bir çekildi. Yıldız işaretleri (*) enjeksiyon için uygun yumurtaları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Membran slayt montajı. Yumurtalar, enjeksiyon işlemi sırasında yumurtaların hareket etmemesi için bir destek yapısı sağlayan naylon membran boyunca hizalanır. Filtre kağıdı, yumurtaların enjeksiyon boyunca nemli kalmasını sağlamak için su rezervuarı görevi görür. Filtre kağıdını ve naylon zarı cam kaydırağın kenarına yakın bir yere yerleştirin ve hem yumurtalara hem de onları batıran suya yer açın. Membran ve filtre kağıdı slaytın kenarından çok uzaksa, embriyolar ve iğne arasında doğru açıyı elde etmek zor olacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Mikroenjeksiyon için embriyo oryantasyonu. A) Embriyolar önden daha düşük arka kutuplarla hizalanır ve zardan aşağı doğru akır. B)Embriyolar suya batırılır; yumurtanın üzerindeki su hattının genişliğini ortalama bir embriyonun yaklaşık sekiz ila dörtte biri genişliğinde olacak şekilde ayarlayın. C) Embriyolarla iğne açısının yakın çekim görüntüsü. Ölçek çubuğu ~1 mm'yi temsil eder.
Şekil 7: Anormal embriyolar. Renklendirme veya dokuda anormal görünen embriyolar yumurtadan çıkmaz; onları enjekte etmeyin. Sarı renkli embriyolar düzgün bir şekilde melanize olmaz. Normal görünen yumurta kabukları (manikür) olmayan pürüzsüz embriyolarda da azalma gözlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Mikroenjections sırasında iğne pozisyonu. A)Enjeksiyon aşamasının geniş açılı görünümü. B,C) İğneyi hizalanmış embriyoların enjeksiyon iğnesi ile 15° açı oluşturacak şekilde konumlandırın. Embriyoları içeren iğne ve slayt arasında uygun oltalamayı sağlamak için iğneyi mikroskop aşamasından önemli ölçüde daha yüksek tutan mikroenjeksiyon aletinin kolunu yükseltmeyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Eş eksenel kontroller ve iğne tutucu. A)Eş eksenel kontroller (ok), her enjeksiyon için iğnenin hassas bir şekilde yerleştirilmesini sağlamak için iğnenin 3 boyutlu hareketine izin verir. Slaytları değiştirirken iğneyi dikey olarak yükseltmek için eş eksenel kontroller kullanmak önemlidir, böylece iğne sahneye yerleştirilirken yeni slaytla çarpışmaz. Yanal eş eksenel kontroller, iğnenin arka direğe doğru nüfuz etmesine izin verir. B) Enjeksiyon için açı gösteren iğne tutucu görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Yumurta kuluçka odası. A,B) Enjekte edilen embriyoları, çift damıtılmış su ile çeyrek derinliğe kadar doldurulmuş ve filtre kağıdı ile kaplanmış silindirik bir kaba dikkatlice yıkayın. C,D) Kabın hareketi, yumurtaların doğal olarak filtre kağıdına yapışmasını neden olur. Kabı kuluçkaya bırakmadan önce, filtre kağıdının yukarısına yapışmış yumurtaların yavaşça su seviyesine kadar yıkanmasını sağlayın. Mavi oval, göreceli boyutu göstermek için bir dizi bir dizi bir dizi yatırılmış yumurtayı işaretler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11. Anopheles gambiae cardinal (Agcd)gen ortez, pCO37 gen tahrik yapısı ve ortaya çıkan fenotipler. Üst) Agcd geni: bordo bloklar, eksonlar (E1-4); boş bloklar, 3'- ve 5 çevrilmemiş bölgeler (UTR); kalın siyah çizgi, intronlar ve intergenik DNA. Orta) pCO37 plazmid: Agcd geninden homoloji kolları: bordo bloklar, mavi bloklar, baskın marker gen bileşenleri (3XP3 ve CFP); tan blokları, tahrik bileşenleri(nanos promotör ve SpCas9 protein kodlama dizileri); yeşil bloklar, kılavuz RNA bileşenleri (U6 promotör ve gRNA dizisi). pCO37'nin genleri ve özellikleri ölçeklemez. SpCaS9/gRNA aracılı kesim bölgesinde (yeşil ok ucu) başlatılan homolojiye yönelik onarımdan (HDR) kaynaklanan rekombinasyon (bordo oklar) gen tahriki yapısına entegrasyonla sonuçlanır. Alt) ortaya çıkan gen tahrik entegrasyonunun görünür fenotipleri: (solda) CFP+ (beyaz /mavi ok) ve larvalarda homozigous Agcd-mutant (kırmızı ok) fenotipleri ve pupalarda Agcd-mutant (kırmızı ok) fenotipleri. (sağda) Homozigous Agcd mutant fenotip yetişkinlerde "kırmızı göz". Carballar-Lejarazú ve ark.'dan uyarlanmıştır. (2020) ve izinle kullanılır5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9 gibi hassas ve esnek genetik mühendislik teknolojilerinin kullanılabilirliğinin artmasıyla transgenik organizmalar daha önce mümkün olandan daha basit ve istikrarlı bir şekilde geliştirilebilir. Bu araçlar, araştırmacıların patojenlere (popülasyon modifikasyonu) veya kalıtsal steriliteye (popülasyon bastırma) refrakterliğin istenen özelliklerini elde etmeye çok yakın olan sivrisinek vektörlerinin transgenik suşlarını oluşturmalarına izin verdi. Bununla birlikte, mümkün olan en güvenli ve istikrarlı genetiği değiştirilmiş sivrisinekleri geliştirmek için, saha çalışmaları için en uygun çizgilerin seçilmesi için ek transgenik çizgilerin oluşturulması ve değerlendirilmesi gerekir. Açıklanan protokol, Anopheles gambiae transgeniklerinin üretilmesinin verimliliğini artırabilir, böylece nüfus modifikasyonu ve bastırma stratejileri için ek adaylar geliştirilebilir.
Açıklanan mikroenjeksiyon prosedürü, sivrisineklerin veya diğer eklembacaklıların mikroenjeksiyonlarını rutin olarak gerçekleştiren bir laboratuvarda mevcut olan ekipman ve malzemeleri kullanır. Protokol boyunca detaylara dikkat etmek önemlidir. Yumurtaları kaliteye göre seçmek veya ikinci DNA çökeltme gibi adımları atlamak gibi adımlardan acele etmek sonuçları bozar ve kuluçkanın azalmasına ve dönüşüm verimliliğinin azalmasına neden olur. Ek olarak, sivrisinek hayvancılığında dikkatli olunmazsa prosedürle ilgili birçok zorluk ortaya çıkabilir. Kalabalık koşullarda veya besin eksikliği ile yetiştirilen sivrisinekler daha düşük kalitede daha az yumurta bırakacaktır14Mikroenjeksiyon iş akışında darboğazlar yaratır ve istenen sayıda enjekte edilen embriyoya ulaşmak için gereken süreyi artıracaktır.
Anopheles stephensi12mikroenjeksiyon için açıklanan yöntemlerin aksine , bu yöntem embriyoların yağ batırılmasını gerektirmez ve yağ bazlı yöntemin gerektirdiği ek adımlar olmadan daha kısa sürede daha fazla embriyo enjekte edilebilir. Bu yönteme yağ bazlı yönteme kıyasla bir sınırlama, mikroenjeksiyon işlemi boyunca daha zayıf görselleştirmedir. Enjeksiyon malzemesinin veya embriyo sitoplazmasının iğneye geri akmamasını sağlamak için, enjeksiyon işlemi boyunca her zaman iğnenin sırt basıncına dikkat edilmelidir.
Afrika sıtma vektörü, diğer Anopheles spp.'ye kıyasla genetik olarak manipüle etmek tarihsel olarak zor olmuştur. Sıtma eliminasyon çabalarına yardımcı olmak için yeni araçlara ihtiyaç vardır ve sivrisinek popülasyonlarını değiştirmek veya bastırmak için tasarlanmış transgenik sivrisinekler eliminasyon elde edilmesinde önemli bir rol oynayabilir. Alan bazlı sıtma eliminasyon çalışmaları için en iyi transgenik adayları seçmek için, optimum etkinlik ve güvenlik için karşılaştırılabilmeleri ve seçilebilmeleri için bir dizi çizgi değerlendirilmelidir15. Gelişmiş refrakterlik veya baskılama ile transgenik çizgiler oluşturmak için gerekli genetik ve moleküler yapı taşları karakterize edilir ve kullanılabilir. Bu protokol, bu refrakter veya baskılayıcı çizgilerin oluşturulma hızını artırmada yardımcı olacaktır, böylece doğrulama çabaları yakın gelecekte saha denemeleri için bir aday seçmeye başlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Sivrisinek hayvancılığı için Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell ve Madeline Nottoli'ye minnettarız. Fon, Kaliforniya Üniversitesi, Irvine Sıtma Girişimi tarafından sağlandı. AAJ, Irvine Kaliforniya Üniversitesi'nde Donald Bren Profesörüdür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
