Summary
Mikroinjektionsteknikker er afgørende for at introducere udefrakommende gener i myggenes genomer. Denne protokol forklarer en metode, der anvendes af James laboratorium til microinject DNA konstruktioner i Anopheles gambiae embryoner til at generere forvandlede myg.
Abstract
Embryo mikroinjektion teknikker er afgørende for mange molekylære og genetiske undersøgelser af insektarter. De giver et middel til at indføre udefrakommende DNA-fragmenter, der kodning gener af interesse samt gunstige træk i insektkimlinjen på en stabil og arvelig måde. De resulterende transgene stammer kan studeres for fænotypiske ændringer som følge af ekspressionen af det integrerede DNA til at besvare grundlæggende spørgsmål eller anvendes i praktiske anvendelser. Selvom teknologien er ligetil, kræver det af investigator tålmodighed og praksis for at opnå et niveau af dygtighed, der maksimerer effektiviteten. Vist her er en metode til mikroinjektion af embryoner af den afrikanske malaria myg, Anopheles gambiae. Målet er at levere eksogent DNA ved mikroinjektion til embryoet, så det kan tages op i de udviklende kimlinjeceller (pol). Udtryk fra det injicerede DNA af transposaser, integrases, rekombininaser eller andre nukleaser (for eksempel CRISPR-associerede proteiner, Cas) kan udløse hændelser, der fører til dens kovalente indsættelse i kromosomer. Transgena gambiae genereret fra disse teknologier er blevet brugt til grundlæggende undersøgelser af immunsystemets komponenter, gener involveret i blod-fodring, og elementer i olfaktoriske system. Derudover er disse teknikker blevet brugt til at producere An. gambiae stammer med træk, der kan hjælpe med at kontrollere overførsel af malaria parasitter.
Introduction
Mikroinjektionsteknikker er blevet brugt til eksperimentelt at manipulere organismer siden begyndelsen af 1900-tallet1. Mikroinjektion er blevet brugt til at studere både grundlæggende biologiske funktioner og/eller indføre vigtige ændringer i biologien i en ønsket organisme. Mikroinjektionsteknikken har været af særlig interesse for vektorbiologer og har i vid udstrækning været brugt til at manipulere vektorgenomer2-11. Transgeneseforsøg i leddyrvektorer har ofte til formål at gøre vektorer mindre effektive til at overføre patogener ved enten at vedtage ændringer, der reducerer en vektors kondition eller øger ildfastheden til de patogener, de overfører. Myg overfører en række menneskelige patogener og har en betydelig indvirkning på sygelighed og dødelighed på verdensplan. Anopheles slægten af myg overfører de humane malaria parasitære patogener, Plasmodium spp. Genteknologiske eksperimenter med Anopheles har til formål bedre at forstå biologien og reducere disse mygs vektorkapacitet i bestræbelserne på at udvikle nye malaria elimineringsstrategier.
Myg vektorer, der bidrager med flest malaria infektioner på verdensplan er i Anopheles gambiae arter kompleks. Men, de fleste af vellykkede transgenese eksperimenter er blevet udført på malaria vektor af det indiske subkontinent, Anopheles stephensi. Mens masser af laboratorietilpassede Anopheles gambiae stammer eksisterer, antallet af transgene Anopheles gambiae spp linjer rapporteret i litteraturen ikke sammenligne med Anopheles stephensi. Det menes, at Anopheles gambiae embryo er vanskeligere at injicere og opnå en vellykket transgenese end Anopheles stephensi, selv om årsagerne til disse forskelle er ukendte. Denne protokol beskriver en metode, der har vist sig at være konsekvent vellykket i at opnå transgenese af Anopheles gambiae embryoner via mikroinjektion. Protokollen er baseret på en metode, der tidligere er udviklet af Hervé Bossin og Mark Benedict12 med nogle yderligere detaljer og ændringer tilføjet, der har vist sig at øge effektiviteten af transgenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af myg til mikroinjektion
- Frø et bur13 (~ 5000 cm3) med ~ 100 mand og 200-300 kvindelige 1-2 dages voksen post-eclosion myg og lad dem parre sig i 2 dage.
- Efter parringsperioden giver myg et blodmåltid ved hjælp af enten 2 mL blod med en kunstig fodringsanordning eller levende bedøvede dyr afhængigt af insektpraksis14. Den følgende dag giver myg et andet blodmåltid for at sikre, at alle parrede kvinder har haft mulighed for at fodre, og at delvist fodrede myg er blevet fuldt engorged.
- Udnyt myg til embryosamlinger 2-4 dage efter det andet blodmåltid.
BEMÆRK: Larval ernæring er vigtig for voksne robusthed og reproduktiv kondition. Se Benedict et al. (2020) for information om, hvordan man opdrætter sunde insekter14. Der er ikke observeret væsentlige forskelle i æglægning, når myg fodres med en kunstig føder eller levende bedøvede dyr. Brug den metode, der rutinemæssigt anvendes til Anopheles gambiae i insektet.
2. Forberedelse af embryoner
- Brug en aspirator til at placere 20-30 hunner i en gennemsigtig 50 mL konisk rør, der er blevet skåret (med et bånd sav) for at være åben i begge ender og er dækket med latex dental film i den ene ende og nylon mesh og filter papir i den anden (Figur 1).
BEMÆRK: Myggene vil deponere deres æg på filterpapiret, og nylonnet vil holde filterpapiret sikkert på plads. Mosquito æg er cylindriske i form, ~ 500 μm i længden, ~ 200 μm i diameter på deres bredeste punkt, og tilspidsning på den forreste og bageste ender (Figur 2). - Placer det myggefyldte rør i et lille (60 mm x 15 mm) petriskål fyldt med dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Røret og fadet placeres i en inkubator ved 28 °C i 45 min (figur 3).
- Fjern røret fra inkubatoren og sæt røret i et tomt bur. Tryk forsigtigt på røret for at tillade myg at flyve ud og fjerne røret fra buret, når alle myg er fløjet ud.
- Når røret er fri for myg, skal du skrue bundringen, fjerne nylonet og bruge sammenkrulninger til forsigtigt at fjerne filterpapiret med æggene fra røret. Sæt filterpapiret i en petriskål af plast (100 mm x 15 mm), der indeholder et lag filterpapir fugtet med ddH2O.
- Overhold æggene. Æg, der er alderen til det punkt, hvor de er lysegrå i farven (Figur 4), er klar til justering.
- Hvis æg stadig er hvide, skal du returnere dem til inkubatoren og kontrollere farven hvert 5. minut. Hvide æg er skrøbelige, bryder let og overlever ikke godt efter injektionsprocessen, hvilket resulterer i lav udklækning.
- Æg, der er mørkegrå eller sorte, er ældet for meget. Brug dem ikke.
3. Justering af embryoner
- Skær et stykke nylonpletting membran (2 cm x 1 cm) med et barberblad, og sørg for, at kanten er pænt trimmet.
BEMÆRK: Hvis kanten ikke er lige, vil æggene ikke forblive fastgjort til membranen ordentligt under injektionsprocessen. - Sæt en membran på en glasrutschebane og dæk membranen med et stykke filterpapir (2 cm x 2 cm), så ~1 mm af membranfilteret er afdækket (Figur 5).
BEMÆRK: Sørg for, at mikroskopslids er rene før brug, og brug rene sammentak til at manipulere membranfilteret. - Våd filterpapiret med deioniseret H2O, da æg vil dø, hvis desiccated i længere tid.
BEMÆRK: Læg ikke for meget vand på papiret, fordi embryonerne bevæger sig under injektionsprocessen, men sørg for, at der er nok til at forhindre embryoet i at tørre (Figur 6A, B). Overskydende vand kan fjernes ved at absorbere det med et stykke filterpapir. - Overfør forsigtigt 30-50 embryoner til kanten af membranen med en pensel (størrelse # 0). Brug børsten til at justere æggene lodret langs membranen ved forsigtigt at rulle dem over på diaset, så den ventrale side (konveks) vender opad.
- Orient alle æggene i samme retning, så når æggene observeres under mikroinjektionsmikroskopet, er den bageste ende (mere spids, figur 6A, B) i en nedadgående position og danner en vinkel på ~ 15 ° med nålen ( Figur6C). Line hele kanten af membranen med æg (30-50) og placere dias under mikroskopet til injektion.
BEMÆRK: Vælg æggene forsigtigt. Kassér dem, der er hvide (for unge eller uudviklede) eller mørkegrå (for gamle og vil bryde nålen) og de unormale (Figur 7). Sørg for, at filterpapiret hele tiden forbliver fugtigt.
4. DNA-forberedelse
- Rense plasmid DNAs til injektion, i det mindste, med en endotoksin-fri DNA plasmid maxiprep kit efter producentens protokoller.
- Brug DNA'et i PCR-kvalitet vand og centrifuge ved 17.100 x g i en nedkølet centrifuge i 30 min ved 4 °C. Overfør derefter supernatanten til et nyt, rent 1,5 mL konisk rør. Forsigtigt mikro-pipette for at undgå at overføre uønskede partikler fra kolonnen.
- Udfør en anden udfældning af DNA ved hjælp af en tiendedel volumen af 3M natriumacetat og et dobbelt volumen på 100% ethanol.
- Brug DNA'et i 300-500 μL pcr-vand til en endelig plasmidkoncentration på 1000 ng/μL. Bland plasmidcocktailen i injektionsbufferen til en endelig plasmidkoncentration på 300-400 ng/μL og lav 10-20 μL aliquots.
BEMÆRK: DNA kan lagres ved -20 °C. DNA-mikroinjektions aliquots kan opbevares ved -20 °C eller ved -80 °C, hvis RNA-komponenter anvendes. Må ikke overstige 800 ng/μL DNA i injektionsblandingen, da viskositet vil få nålene til at tilstoppe.
5. Nåleforberedelse
- Gør nålene ved at trække 10 cm kvarts kapillærer ved hjælp af en programmerbar mikropipette puller.
- Undersøg nålen under mikroskop for at sikre, at spidsen er dannet godt. Sørg for, at nåleindstillingen på den programmerbare puller giver et tip, der begynder at tilspidse ~ 0,5 mm fra terminalenden og ender i et fint punkt (se figur 6). Nåle, der bryder let, har normalt for lang tilspidsning.
BEMÆRK: Forholdene kan variere afhængigt af nåletrækkeren (Forfatterne vil efter anmodning stille indstillingerne for den programmerbare trækker til rådighed. Journalbegrænsninger forhindrer os i at citere et bestemt brand). Nåle kan trækkes i hånden, men det kræver et færdighedssæt, der ikke er tilgængeligt i de fleste laboratorier.
6. Mikroinjektion af embryoner
- Brug en mikrolæsserspids til at fylde nålene med 2 μL DNA-blanding. Sæt nålen i nåleholderen, og tilslut den automatiske trykpumpeslange (Figur 8).
- Vigtigt: Juster nålen, så den danner en vinkel på 15° med diasets plan (Figur 8).
- Åbn nålespidsen ved forsigtigt at røre ved det første æg og indsprøjt den ved at indsætte spidsen af nålen ≤ 10 μm i den bageste pol. En vellykket injektion vil føre til en lille bevægelse af cytoplasmaet i ægget.
- Brug mikroskop koaksial fase kontrol til at flytte til det næste æg til at fortsætte injektion.
- For at sikre, at nålespidsen forbliver åben og ikke er tilstoppet, skal du trykke på knappen Indsprøjt, før du går ind i et andet embryon, og visualisere den lille dråbe ved kanylens åbning.
- Hvis nålen bliver tilstoppet, skal du trykke på knappen Ryd for at rydde nålen og gentage dråbevisualiseringstesten. Juster trykket efter behov, hvis nålespidsåbningen bliver lidt større for at sikre, at dråbens størrelse forbliver lille.
- Indsprøjt ~ 40-50 æg med en nål.
BEMÆRK: Sørg for, at filterpapiret altid forbliver fugtigt. Hold tilstrækkeligt modtryk på nålen til at holde den ryddet. En nål, der ikke kan fjernes, skal udskiftes med en ny nål. Embryoplacering, indføring af nåle og injektion gøres lettere med mikroskoper, der har koaksialkontrol for vandret bevægelse af stadiet (Figur 9).
- Når injektionerne er afsluttet, skylles æggene af i en glasbeholder foret med filterpapir og fyldes med 50 mL deioniseret H2O (figur 10).
BEMÆRK: Embryoner vil begynde udklækning 2 dage efter injektionen og kan tage så lang tid som 3-5 dage. Klækkede første instar larver skal overføres straks (check 2 gange dagligt) til en ren beholder med vand og mad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et repræsentativt eksempel på anvendelsen af den beskrevne mikroinjektionsprotokol findes i Carballar-Lejarazú et al5. Hensigten her var at indsætte et autonomt gendrevsystem i kimlinjen af en laboratoriestamme, G3, af An. gambiae. Systemet var designet til at målrette kardinal ortholog græshoppe (Agcd) på det tredje kromosom i denne art, som koder en heme peroxidase, der katalyserer omdannelsen af 3-hydroxykynurenin til xanthommatin, det sidste trin i ommochrom biosyntese (Figur 11). Homozygoe gendrevholdige myg er funktionssvigt kardinalmutanter med larver, pupper og nyligt fremkomne voksne, der har en rødøjet fænotype. En plasmid, pCO37, der indeholder drevsystemet udtrykker Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) endonuclease under kontrol af de lovgivningsmæssige elementer i An. gambiae nanos gen ortholog, en 23-nukleotid guide RNA (gRNA) under kontrol af en An. gambiae U6 genpromotor og en 3XP3-CFP dominerende markør kassette udtrykker cyan fluorescerende protein til identifikation af transgene afkom. Agcd DNA-fragmenter homologe til genomiske regioner flankerer gRNA mål cut site gøre mulig homology-rettet reparation- (HDR) medieret integration.
Syv hundrede firs vilde-type An. gambiae embryoner blev injiceret med pCO37 plasmid sammen med SpCas9 protein. 1064-injicerede embryoner (18,7%; G0) overlevede til den voksne scene og blev efterfølgende overhalet til vilde medlemmer af det modsatte køn. Fluorescerende mikroskop screening af den næste generation (G1)afkom identificeret tre af 3.428 (0,09%), der var positive for den fælles fiskeripolitik markør gen, hvoraf kun to, en mand og kvinde, overlevede. Molekylære tilgange (genforstærkning, DNA-sekventering) verificerede den nøjagtige indsættelse af ~ 10 kb DNA, og den resulterende stamme blev udpeget AgNosCd-1. Omfattende opfølgende analyser viste, at AgNosCd-1 var meget effektiv på drev, skabte få resistente alleler og ikke havde nogen større genetisk belastning (fitness omkostninger) som følge af integration og ekspression af gendrevssystemet5. PCO37 plasmid tjener som rygrad for at udvikle befolkningsmodifikation stammer af An. gambiae at forhindre malaria parasit transmission.
Figur 1: Ægopsamlingsanordning. Ægopsamlingsenheden består af filterpapir, nylonnet, tandfilm og et eftermonteret 50 mL konisk rør. Enheden gør det muligt for myg at blive deponeret af aspirator sikkert i beholderen via slidsen i tandfilm. Filterpapiret og nylonnet tillader vand at blive absorberet, hvilket giver en fugtig, men ikke oversvømmet overflade til oviposition. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Anopheles gambiae embryoner. A) Et parti embryoner på forskellige stadier af modning. B) Pilene angiver den bageste pol, placeringen i embryoet, der indeholder kimlinjeceller, som er de tilsigtede mål for transformation. Skalalinjen repræsenterer ~1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ægopsamling. Når myggene er placeret inde i ægopsamlingsenheden, flyttes den til en petriskål, der indeholder et lag filterpapir fugtet med ddH2O. Juster vandmængden, så vandstanden stiger til ~ 1/4 højden af hætten. Ægopsamlingsenheden og Petriskålen placeres derefter i en mørklagt inkubator og myg, der får lov til at oviposit i alt 45 minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Udvikling af embryoner. Embryonerne er kun egnede til injektion i løbet af en kort tidsvindue. Æg, der injiceres for tidligt under udvikling, er for sarte og vil lide skade og ikke klække. Æg, der injiceres senere i deres udvikling bliver hærdet og kan bryde nålen forårsager for meget genetisk materiale, der skal injiceres i ægget. Derudover, injektioner senere i udvikling er mindre tilbøjelige til at forårsage permanente ændringer i kimlinjen som polceller hurtigt gennemgå yderligere replikation og differentiering. Billeder blev taget hvert 10. minut efter ovipositionstid på 45 minutter. Stjernerne (*) angiver æg, der er egnede til injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Membran slide montering. Æggene er justeret langs nylonmembranen, hvilket giver en støttestruktur, så æggene ikke bevæger sig under injektionsprocessen. Filterpapiret fungerer som et reservoir for vand for at sikre, at æggene forbliver fugtige under hele injektionen. Placer filterpapir og nylonmembran tæt på kanten af glasrutschebanen, så der er plads til både æg og det vand, der nedsænker dem. Hvis membranen og filterpapiret er for langt fra kanten af diaset, vil det være vanskeligt at opnå den korrekte vinkel mellem embryoner og nål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Embryoorientering for mikroinjektion. A) Embryoner er justeret med de bageste poler lavere end den forreste, der løber ned ad membranen. B) Embryonerne er nedsænket i vand; justere bredden af vandlinjen over ægget til at være ca en ottendedel til en fjerdedel bredden af en gennemsnitlig embryo. C) Nærbillede af nålevinkel med embryoner. Skalalinjen repræsenterer ~1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Unormale embryoner. Embryoner, der ser unormale ud i farve eller tekstur, vil ikke klække; ikke injicere dem. Embryoner, der er gule i farve, vil ikke korrekt melanisere. Reduceret udklækning er også blevet observeret i glatte embryoner, der ikke har normalt vises æggeskaller (neglebånd). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Nåleposition under mikroinjektionerne. A) Vidvinkelbillede af injektionsfasen. B,C) Anbring nålen, så de justerede embryoner danner en vinkel på 15° med injektionsnålen. Løft ikke armen på mikroinjektionsinstrumentet, der holder nålen betydeligt højere end mikroskopstadiet for at sikre korrekt lystfiskeri mellem nålen og diaset, der indeholder embryonerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Koaksial kontrol og nåleholder. A) De koaksiale kontroller (pil) giver mulighed for 3-dimensionel bevægelse af nålen for at sikre præcis placering af nålen for hver injektion. Det er vigtigt at bruge co-aksial kontrol til at hæve nålen lodret, når du skifter dias, så nålen ikke kolliderer med den nye dias, når den sættes på plads på scenen. Laterale koaksiale kontroller giver mulighed for nøjagtig indtrængning af nålen i den bageste stang. B) Billede af nåleholder, der viser indsprøjtningsvinklen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Kammer til rugeæg. A,B) Vask forsigtigt injicerede embryoner i en cylindrisk beholder fyldt til kvart dybde med dobbeltdestilleret vand og foret med filterpapir. C,D) Beholderens bevægelse får æggene til naturligt at klæbe til filterpapiret. Før du forlader beholderen til udklækning, skal du sørge for, at æg, der har klæbet højere op i filterpapiret, vaskes forsigtigt ned til vandstanden igen. Den blå oval markerer en række deponerede æg for at vise relativ størrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11. Anopheles gambiae kardinal (Agcd) gen ortholog, pCO37 gendrev konstruktion og deraf følgende fænotyper. Øverst) Agcd gen: rødbrune blokke, exons (E1-4); tomme blokke, 3' - og 5-uoversatte regioner (UTR); tyk sort linje, introner og intergent DNA. Mellem) pCO37 plasmid: homologiarme fra Agcd-genet: rødbrune blokke, blå blokke, dominerende markørgenkomponenter (3XP3 og FFP); tan blokke, drev komponenter (nanoer promotor og SpCas9 protein-kodning sekvenser); grønne blokke, guide RNA komponenter (U6 promotor og gRNA sekvens). Gener og funktioner i pCO37 er ikke at skalere. Rekombination (rødbrune pile) som følge af homology rettet reparation (HDR) indledt på SpCaS9/gRNA-medieret cut site (grøn pilespids) resulterer i integration af gendrev konstruere. Nederst) deraf følgende synlige fænotyper af gendrev integration: (venstre) CFP+ (hvid / blå pil) og homozygot Agcd-mutant (rød pil) fænotyper i larver og Agcd-mutant (rød pil) fænotyper i pupper. (højre) Homozygot Agcd mutant fænotype "røde øjne" hos voksne. Tilpasset fra Carballar-Lejarazú et al. (2020) og bruges med tilladelse5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den øgede tilgængelighed af præcise og fleksible genteknologiske teknologier som CRISPR/Cas9 kan transgene organismer udvikles på en mere ligetil og stabil måde end tidligere muligt. Disse værktøjer har gjort det muligt for forskere at skabe transgene stammer af myg vektorer, der er meget tæt på at opnå de ønskede egenskaber af enten ildfasthed til patogener (befolkningsmodifikation) eller arvelig sterilitet (befolkning undertrykkelse). For at udvikle de mest sikre og stabile genetisk modificerede myg, der er mulige, skal der imidlertid oprettes og evalueres yderligere transgene linjer, så der vælges optimale linjer til feltundersøgelser. Den beskrevne protokol kan øge effektiviteten af at generere Anopheles gambiae transgenics, således at yderligere kandidater kan udvikles til befolkningstilifikation og undertrykkelse strategier.
Den beskrevne mikroinjektionsprocedure anvender udstyr og materialer, der sandsynligvis er tilgængelige i et laboratorium, der rutinemæssigt udfører mikroinjektioner af myg eller andre leddyrvektorer. Det er vigtigt at holde fokus på detaljer i hele protokollen. Farende gennem trin såsom at vælge æg efter kvalitet eller springe trin såsom den anden DNA nedbør vil forringe resultaterne og forårsage reduceret udklækning og reduceret transformation effektivitet. Derudover kan der opstå mange vanskeligheder med proceduren, hvis man ikke tager sig af myghold. Myg, der opdrættes under overfyldte forhold eller med mangel på næringsstoffer, vil lægge mindre æg af dårligere kvalitet14, hvilket skaber flaskehalse i mikroinjektionsarbejdsgangen og vil øge den tid, der er nødvendig for at nå det ønskede antal injicerede embryoner.
I modsætning til metoder, der er beskrevet for mikroinjektion af Anopheles stephensi12, kræver denne metode ikke olie nedsænkning af embryonerne og flere embryoner kan injiceres på kortere tid uden de yderligere trin, der kræves af den oliebaserede metode. En begrænsning af denne metode i forhold til den oliebaserede metode er dårligere visualisering i hele mikroinjektionsprocessen. For at sikre, at injektionsmateriale eller embryocytoplasma ikke strømmer tilbage i nålen, skal der altid holdes opmærksom på nålens modtryk under hele injektionsprocessen.
Den afrikanske malaria vektor har været historisk vanskeligt at genetisk manipulere i forhold til andre Anopheles spp., men det er den største bidragyder til malaria tilfælde på verdensplan. Nye værktøjer er nødvendige for at aide malaria elimination indsats og transgene myg designet til enten at ændre eller undertrykke myg befolkninger kan spille en vigtig rolle i at opnå eliminering. For at vælge de bedste transgene kandidater til feltbaserede malaria elimination undersøgelser, en række linjer bør evalueres, så de kan sammenlignes og vælges for optimal effekt og sikkerhed15. De genetiske og molekylære byggesten, der er nødvendige for at skabe transgene linjer med forbedret ildfasthed eller undertrykkelse, er karakteriseret og tilgængelig. Denne protokol vil aide i at øge den hastighed, hvormed disse ildfaste eller undertrykkende linjer kan oprettes, således at validering indsats kan begynde at vælge en kandidat til feltforsøg i den nærmeste fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell og Madeline Nottoli for myg opdræt. Finansieringen blev ydet af University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ er donald Bren professor ved University of California, Irvine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
