Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توصيف أحادي الخلية لتدفق الكالسيوم والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 باستخدام منصة متعددة المقاييس Optofluidic

Published: May 18, 2021 doi: 10.3791/62632
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 2, 1
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا يتم فيه مراقبة الخلايا المفردة للأحداث الحادة والعدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 على جهاز نانوفلويدي. تحدد بيانات التصوير تفاعلات مستقبلات الفيروس المضيف وديناميكيات مسار الإشارات. هذه هي الطريقة الأولى لثقافة الخلايا الواحدة عالية الإنتاجية النانوية والتصوير لدراسة الحركية الإشارات والتفاعلات الجزيئية.

Abstract

يسبب فيروس نقص المناعة البشرية-1 عدوى مزمنة تصيب أكثر من 37 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. يعاني المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) من الأمراض المرضية المرتبطة بالالتهاب المزمن على الرغم من العلاج المضاد للفيروسات العكوسة. ومع ذلك ، فإن هذه الإشارات الالتهابية لم تكن مميزة تماما. لم يتم التقاط دور أحداث الدخول المبكر على تنشيط أحداث الإشارات الخلوية والتعبير الجيني في المصب على مستوى الخلية الواحدة. هنا يصف المؤلفون طريقة تطبق مبادئ المجهر الفلوري للخلايا الحية على منصة آلية أحادية الخلية تقوم بثقافات وصور الخلايا عبر دورات زمنية مخصصة للمستخدم ، مما يسمح بتحليل عالي الإنتاجية للعمليات الخلوية الديناميكية. ويمكن لهذا المقايسة أن يتتبع المجهر الفلوري الحي أحادي الخلية للأحداث المبكرة التي تعقب مباشرة الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1، ولا سيما تدفق الكالسيوم الذي يصاحب التعرض للفيروس وتطور العدوى المنتجة باستخدام فيروس مراسل فلوري. يتم تحميل خلايا MT-4 بصبغة حساسة للكالسيوم ومثقفة في أقلام معزولة على جهاز نانوفلويديك. الخلايا المثقفة مصابة بفيروس مراسل فيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1 NLCI). يقيس المجهر الفلوري المتمركز فوق الجهاز النانوي تدفق الكالسيوم على مدى 8 دقائق من الدورة الزمنية بعد التعرض الحاد لفيروس نقص المناعة البشرية-1. يتم قياس العدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في تلك الخلايا نفسها على مدى فترة 4 أيام. يتم تحليل بيانات التصوير من هذه الدورات الزمنية لتحديد تفاعلات مستقبلات الفيروس المضيف وديناميكيات مسار الإشارات. يقدم المؤلفون بديلا متكاملا وقابلا للتطوير لطرق التصوير التقليدية باستخدام منصة جديدة ل optofluidic قادرة على فرز الخلايا الواحدة وزراعة الخلايا والتصوير وأتمتة البرامج. يمكن لهذا المقايسة قياس حركية الأحداث في ظل ظروف مختلفة، بما في ذلك نوع الخلية أو ناهضها أو تأثير الخصم، مع قياس مجموعة من المعلمات. هذه هي الطريقة الأولى الراسخة لثقافة الخلايا الواحدة والتصوير عالية الإنتاجية النانوية: يمكن تكييف هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الحركية الإشارات الخلوية والتفاعلات الجزيئية الديناميكية.

Introduction

الالتهاب المزمن هو السبب الرئيسي للأمراض المبكرة المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية والوفيات1و2و3. هناك آليات متعددة حيث فيروس نقص المناعة البشرية يمكن تنشيط الإشارات الالتهابية، وتشير الأدلة الأخيرة دورا لمستقبلات P2X في دخول فيروس نقص المناعة البشرية التي هي الكالسيوم غاتينج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) مستقبلات3،4،5،6،7،8،9،10. قد يكون النوع الفرعي P2X من مستقبلات الpurinergic (P2XR) ميسرين مهمين لهذا الالتهاب. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية لتفاعلات فيروس نقص المناعة البشرية-P2XR غير معروفة إلى حد كبير وقد تؤثر على خطوات دورة الحياة الفيروسية المبكرة والمتأخرة لفيروس نقص المناعة البشرية-1. إن تحديد المسارات والحركة التي تقود الالتهاب المزمن المرتبط بفيروس نقص المناعة البشرية أمر بالغ الأهمية لتعزيز خيارات العلاج للأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.

لتقييم ما إذا كان فيروس نقص المناعة البشرية-1 يعذب مستقبلات P2X بشكل مباشر، يجب قياس تنشيط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 بالتوازي. تم تحديد مقايسات نشاط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 بشكل مستقل: تدفق الكالسيوم الخلوي هو مؤشر على تنشيط P2XR ، ويمكن قياس العدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 حسب وفرة الحمض النووي الريبي. الكشف عن الفلورية لتدفق الكالسيوم ممكن مع صبغ فلو-4 الحساسة للكالسيوم، ويمكن تصور عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 مع mCherry الفلورسنت مراسل فيروس HIV-NLCI11،12،13،14،15.

لأن هذه المؤشرات لتنشيط P2X (تدفق الكالسيوم الخلوي الحاد) والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1 RNA synthesis) تحدث على جداول زمنية مختلفة (دقائق مقابل أيام) ، هناك نقص في طريقة عالية الإنتاجية تسمح بالتحليل المقترن لتنشيط P2XR والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1. تسمح التقنيات التجريبية القياسية عالية الإنتاجية، مثل قياس التدفق الخلوي، بتحليل السكان ولكنها لا تستطيع تقييم العلاقة بين الأحداث الحادة والطولية في الخلايا المفردة. بدلا من ذلك، التصوير أحادي الخلية مع المجهر الفلوري القياسي منخفض الإنتاجية. هذه القيود التجريبية تمثل حاجة إلى تقنيات جديدة وعالية الإنتاجية لقياس الارتباطات بين الأحداث الخلوية الحادة والطولية مباشرة.

نظام optofluidic الموصوف هو منصة جديدة قادرة على فرز الخلية الواحدة والعزلة ، والاستزراع ، والتصوير ، وأتمتة البرامج16،17،18،19. يقدم هذا النظام بديلا متكاملا عالي الإنتاجية لقيود طرق التصوير التقليدية. تتكون منصة Beacon من حاضنة ثاني أكسيد الكربون (CO2)والحاضنة التي يتم التحكم في درجة حرارتها والتي تدعم الخلايا الموجودة على رقاقة. تمتلك الشريحة ترانزستورات حساسة للضوء تولد تدرجا كهربائيا استجابة للضوء المستهدف. يتم استخدام هذه القوة العازلة الناتجة لنقل الخلايا الفردية عبر رقاقة النانوفلويديك إلى المناطق المرغوبة. يتم فرز الخلايا إلى أقلام على الشريحة ، والتي توفر حاجزا لعزل الخلايا الفردية جسديا. التدفق المستمر للرقم من وسائل الإعلام النمو في جميع أنحاء رقاقة يمنع هجرة الخلايا من الأقلام مع السماح لنشر الجسيمات الصغيرة من المواد الغذائية والكواشف الخاصة بالتجربة. المجهر الفلوري يجلس فوق الشريحة. يتم استخدام أتمتة البرامج لالتقاط صور الشريحة عند النقطة الزمنية المحددة من قبل المستخدم.

تم إجراء جميع توصيف الخلايا باستخدام نظام optofluidic لاختيار الخلية الواحدة والتلاعب بها. يتكون هذا النظام من مكونات ميكانيكية وميكروبية وبصرية متكاملة تمكن من التلاعب بالخلايا الواحدة، والقياس، والثقافة، والتصوير. يتم تحميل الخلايا وتثقف على جهاز nanofluidic المتاح الذي يتكون من 3500 غرفة فردية (أقلام) ، كل منها قادر على عقد حجم نانولتر الفرعية. يمكن وضع الخلايا داخل الأقلام باستخدام "أقفاص" عازلة ناتجة عن الضوء ومثقفة تحت ظروف التحكم في درجة الحرارة و CO2. تسمح المركبات الدقيقة بتشويش الوسائط أو المخازن المؤقتة على الشريحة لثقافة الخلايا أو العلاج من المخدرات. إبرة المحرك يسمح لاستيراد وتصدير الخلايا من لوحات الآبار المحتضنة والمغلقة. يمكن تصوير منطقة الشريحة عند تكبير 4x أو 10x في قنوات brightfield والفلورسنت (بما في ذلك DAPI أو FITC أو TRed أو Cy5) لتوصيف الأنماط الظاهرية الخلوية أو التحليل الوظيفي. النظام بأكمله مؤتمت باستخدام البرامج التي يمكن استخدامها لسير العمل المصمم مسبقا أو التجارب المخصصة.

وقد درست العلاقات بين عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 وفيروس نقص المناعة البشرية 2XR، ولكن لم يتم الإبلاغ عن إجراء عالي الإنتاجية لتوصيف هذه التفاعلات بشكل مباشر بالتوازي. هنا، يصف المؤلفون منهجية لدراسة التفاعلات بين فيروس نقص المناعة البشرية وP2XR من خلال تتبع التدفق الحاد للكالسيوم والعدوى المنتجة اللاحقة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 على مستوى الخلية الواحدة. وتجدر الإشارة إلى أن هذا يؤسس أداة جديدة تسمح بقياس مباشر وعالي الإنتاجية وطولي لأهداف متعددة في خلايا واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلايا للتصوير

  1. إعداد محلول تحميل Fluo-4 AM الطازج: أضف 25 ميكرولتر من مذيب المنظفات المركزة 100x ، ثم أضف 2.5 ميكرولتر من Fluo-4 AM 1000x إلى أنبوب 1.5 مل. دوامة لخلط.
  2. Pipette 2.5 مل من وسائل الإعلام الثقافة في حل التحميل وعكس لخلط. حماية من الضوء.
  3. جهاز طرد مركزي 2 × 106 خلايا MT-4 في 500 × ز لمدة 3 دقائق.
  4. إزالة الوسائط وإعادة إنفاق بيليه في 2 مل من محلول التحميل فلوو-4 AM المعدة. حماية من الضوء.
  5. ماصة الخلايا resuspended في طبق بيتري 35 ملم. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة، ثم احتضان لمدة إضافية 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي. خلايا الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant تتكون من محلول التحميل.
  7. Resuspend بيليه الخلية عن طريق pipetting في 1 مل من الثقافة المتوسطة والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 3 دقائق لغسل.
  8. إعادة زراعة بيليه الخلية عن طريق الأنابيب في وسط الثقافة بتركيز 2 × 106 خلايا / مل (الحد الأدنى 50 ميكرولتر). حماية من الضوء.

2. إعداد النظام Optofluidic، تحميل الخلية، وتدوين الخلية

  1. إعداد رقاقة مع حل التبول، مما يسهل خلية penning.
    1. للقيام بذلك، قم بتحميل أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على 2 مل من محلول الترطيب و50 مل من مياه DI على الجهاز مع رقاقة جديدة optofluidic وتشغيل وظيفة Wet Chip. هذه الوظيفة سوف الفيضانات تلقائيا رقاقة مع حل التبول من خلال fluidics النظام، واحتضان رقاقة في 50، °C وتدفق رقاقة مع الماء 3 مرات.
    2. بمجرد الانتهاء من تدفق المياه، قم بتدفق الشريحة مع 3 دورات من 250 ميكرولتر من الوسائط الثقافية.
  2. تكملة تعليق الخلية من الخطوة 1.8 مع 1:100 F-127 المنظفات solute قبل التحميل للحد من احتمال الخلايا الشائكة إلى قنوات رقاقة.
  3. استخدم إبرة تصدير الأداة لاستيراد خلايا من أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل باستخدام عملية التحميل واستيراد الحجم الصغير لحجم حزمة خلية سعة 5 ميكرولتر.
  4. خلايا القلم باستخدام الأمثل لتحديد المواقع البصرية (OEP) الجهد من 4.3 V و 5 ميكرومتر / ثانية سرعة القفص. يحدث Penning باستخدام OEP. إنجاز penning باستخدام وظيفة Autopen، والتي سوف autodetect خلايا واحدة، وتحيط بها مع قفص OEP، ونقلها إلى قلم قريب. إذا ظلت الخلايا ذات الاهتمام تتبع الكتابة التلقائية، فاستخدم الدالة القلم اليدوي لتحديد الخلايا المستهدفة (بنقرة ماوس) وقلم وجهة (بنقرة ماوس لاحقة).
  5. مرة واحدة penning كاملة (إما عندما اكتمال وظيفة Autopen أو عندما تم تحقيق العدد المطلوب من الخلايا المكتوبة) ، دافق رقاقة مع 3 دورات من 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة لمسح أي خلية غير مبنة المتبقية من رقاقة.

3. عدوى وحيدة الخلية والتصوير الوظيفي

  1. بعد تأليف الخلايا، احصل على صور فلورية للخلايا في قنوات FITC و Texas Red و DAPI لقياس خط الأساس Fluo-4 و mCherry و autofluorescence.
  2. غرس فيروس نقص المناعة البشرية-1 في رقاقة في تركيز 13 نانوغرام من فيروس نقص المناعة البشرية-1 NL-CI لكل 2 × 106 خلايا عن طريق أنبوب ببطء تعليق في رقاقة من خلال إبرة التصدير.
  3. مباشرة بعد إضافة فيروس نقص المناعة البشرية-1، والحصول على صور مرارا وتكرارا في قنوات FITC وDAPI على مدى دورة زمنية لمدة 10 دقائق.
  4. الحصول على صور في قنوات تكساس الأحمر وDAPI في 1-, 2-, 3-, و 4 أيام بعد العدوى (DPI).

4. تحليل بيانات التصوير الوظيفي وحيد الخلية مع برنامج فيجي

  1. في كل نقطة زمنية في كل قناة تصوير ذات أهمية، استخدم أداة اختيار نقطة فيجي ووظيفة القياس لقياس إشارات فلوو-4 و mCherry و autofluorescence لكل خلية. في نفس الوقت قياس مضان الخلفية عن طريق حساب متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) من القلم والرقائق التي تحتوي على كل خلية.
  2. التحكم في الفلورسينس الخلفية والسيارات باستخدام الدالة قياس للعثور على MFI في تحديد المنطقة وطرح هذه القيمة من قيمة مضان الخلية.
  3. تطبيع مضان الخلفية لكل صورة رقاقة: قياس MFI من رقاقة في كل مجال. ثم طرح MFI من رقاقة مع أقل مضان الخلفية من جميع القياسات MFI رقاقة أخرى.
  4. تطبيع مضان الخلفية لكل قلم يحتوي على الخلية: قم بقياس MFI لقلم كل خلية في كل مجال من مجالات الرؤية. ثم طرح هذه القيمة من MFI الخام الخلية لكل حقل.
  5. التحكم في الفلورة التلقائية للخلية: طرح اليوم 0 واليوم 4 DAPI MFI لكل خلية من اليوم 0 واليوم 4 mCherry MFIs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 شكل الشريحة وبيانات التصوير الخام التي تم الحصول عليها من خلال المجهر الفلوري. يتم عرض تحديد وتتجمع الخلايا غير المصابة والمصابة عن طريق قياس mCherry في الشكل 2. يتم تحليل هذه المجموعات حركية تدفق الكالسيوم في الشكل 3، مما يدل على التدفق المبكر للكالسيوم في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. ويبين الشكل 4 وجود ارتباط إيجابي كبير بين تدفق الكالسيوم وفلورسينس mCherry 20.

Figure 1
الشكل 1: تحميل رقاقة وبيانات التصوير الخام. تخطيطات تحميل الخلايا في الأقلام على رقاقة باستخدام البصريات الكهربائية (A). يتم قياس تدفق الكالسيوم عن طريق الكشف عن صبغة فلو-4 الحساسة للكالسيوم في قناة FITC على مدى دورة زمنية 8.5 دقيقة(B). يتم قياس العدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 على مدى دورة زمنية 4 أيام عن طريق الكشف عن فيروس مراسل mCherry فيروس نقص المناعة البشرية NL-CI في قناة تكساس الأحمر(C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ممثل إيجابية لإشارات mCherry في اليوم 4 بعد العدوى. أصيبت خلايا MT-4 بفيروس مراسل mCherry HIV-1 NL-CI على منصة optofluidic ، وتم قياس إشارة mCherry بعد 4 أيام من العدوى (نقطة في البوصة). تم تجميع الخلايا التي تغير في إشارة mCherry >40,000 MFI (حيث لوحظ نقطة توقف واضحة) عند 4 نقطة في البوصة في السكان "عالية mCherry"; تم تجميع الخلايا مع تغيير في مشيري مضان <40،000 MFI في السكان "mCherry منخفضة". تم استخدام البرامج الإحصائية لرسم متوسط قيم مشرى الفلورسينس عند 0 و 4 نقطة في البوصة. تم قياس الأهمية الإحصائية عند 4 نقطة في البوصة باستخدام اختبار t غير مدفوع الأجر للوسائل (mCherry-high= 50235 MFI؛ mCherry-low=25017 MFI؛ p<0.000001). *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001 الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:الخلايا الممثلة المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية التي لديها معدلات عالية من تدفق الكالسيوم المبكر. أصيبت خلايا MT-4 بفيروس مراسل mCherry HIV-1 NL-CI على منصة optofluidic. تم قياس الكالسيوم داخل الخلايا من قبل فلوو-4 مضان مرارا وتكرارا على مدى 9 دقائق دورة زمنية. تم استخدام البرامج الإحصائية لرسم متوسط قيم Fluo-4 لمجموعات الخلايا عالية mCherry و mCherry-low. وقد قيست الأهمية الإحصائية باستخدام اختبارات t غير المدفوعة الأجر في كل نقطة زمنية. *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:تدفق الكالسيوم التمثيلي داخل الخلايا أعلى في الخلايا الإيجابية mCherry. أصيبت خلايا MT-4 بفيروس مراسل mCherry HIV-1 NL-CI. تم قياس الكالسيوم داخل الخلايا من قبل فلوو-4 مضان 9 دقائق بعد العدوى، و mCherry تم قياس 4 أيام بعد العدوى. تم إجراء انحدار خطي بسيط باستخدام البرامج الإحصائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن تكييف المنهجية الموصوفة لدراسة العلاقة بين تدفق الكالسيوم والعدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في الخلايا المفردة لدراسة الحركية الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لناهضات أخرى أو الخصوم من الفائدة. إعداد الخلايا للتصوير بسيط، والحد الأدنى من الوقت المكثف، والكواشف متوفرة في مجموعات مريحة من الشركات المصنعة المستخدمة على نطاق واسع. قياس الكالسيوم القائم على فلو-4 موصوف جيدا في الأدبيات، ويمكن بسهولة استبدال فيروس نقص المناعة البشرية-1 بفيروسات أو مركبات أخرى ذات أهمية للدراسة على هذه المنصة. يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا ووسيطات الثقافة. يتم دعم قنوات مضان بديلة أو إضافية، ويمكن تصوير العديد من الفلوروفورات في وقت واحد أو بالتسلسل.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف الإجراء على نطاق واسع لدراسة الأحداث التي تحمل علامة الفلوروفوري في الدورات الزمنية الطولية. لا تسمح الطرق القياسية عالية الإنتاجية، مثل قياس التدفق الخلوي، بالدراسة المقترنة للأحداث المنفصلة عبر دورات زمنية. التصوير التقليدي أحادي الخلية من خلال المجهر الفلوري محدود بالنسب، وترحيل الخلايا عبر مجالات الرؤية، ومتطلبات الوقت المكثف. من خلال الجمع بين التصوير الفلوري مع ثقافة الخلية الواحدة عالية الإنتاجية والآلية ، تسمح هذه الطريقة بتأييد الحركيات الجزيئية ذات الصلة ، والتتمة ، والتفاعلات على فترات زمنية قصيرة وطويلة الأجل. من المهم ملاحظة أن تحسين البرامج وتحليل الصور أمر بالغ الأهمية لكل تطبيق.

وقد تم تجهيز المجهر مع برايتفيلد وCy5، تكساس الأحمر، FITC، وقنوات مضان DAPI16. التكبيرات المتوفرة هي 4x و 10x. هذه الطريقة ليست مناسبة حاليا للتحقيقات التي تتطلب معلمات فلورية أكثر عددا أو تكبير أكبر. يجب أن تظهر مركبات الاهتمام التي سيتم غرسها في الشريحة للتعرض للخلية الانتشار لدخول الأقلام والوصول إلى الخلايا. وقد يشكل الوصول إلى أداة بيكون حاجزا من حيث التكلفة أمام المحققين.

نظام optofluidic لديه قدرة واسعة المسح الضوئي وخياطة. الفرز البصري على رقاقة لديه متغير عالية الكفاءة اعتمادا على نوع الخلية، ولكن كفاءة الفرز التلقائي هو بين 80-90٪، والفرز اليدوي يمكن أن تزيد من تلك الكفاءة إلى 100٪. يمكن أن تستوعب كل رقاقة 3500 خلية ، ويمكن تشغيل أربع رقائق في وقت واحد ، مع سير عمل مواز ، مما يؤدي إلى قابلية عالية للتوسع. بينما يتم الإبلاغ عن سير عمل التصوير عن طريق تحليل الصور اليدوية ، تسمح التحديثات الأكثر حداثة في النظام بأتمتة هذا. من المهم ملاحظة أن البيانات المعروضة هنا ممثلة ضمن حدود تحليل عتبة الصورة ، ومن المرجح أن يؤدي تحسين وأتمتة تحليل الصور إلى مقاييس أكثر حساسية لكل من تدفق الكالسيوم وإشارة mCherry كدليل على العدوى المنتجة بفيروس نقص المناعة البشرية-1.

تم إنشاء البروتوكول الموصوف باستخدام خلايا MT-4 وفيروس نقص المناعة البشرية-1 كما هو موضح سابقا7،21،22. عند تكييف البروتوكول مع خطوط الخلايا الأخرى أو أهداف الفلورسنت ذات الاهتمام ، مطلوب التحسين والتحقق من الصحة. تعتمد حركية فلوو-4 إفلوكس على خط الخلية، لذلك يجب التأكد من أن احتباس الصبغة الخاص بنوع الخلية يدوم على الأقل إذا كان مسار تصوير الكالسيوم المقصود. يمكن الانتهاء من التحقق من صحة احتباس الصبغة والاستجابة الناهضة على هذا الجهاز optofluidic عن طريق علاج الخلايا على الشريحة مع وسيط النمو الذي يحتوي على 10 ميكرومتر أيونوميسين ، والذي يجب أن يحفز تدفق الكالسيوم الخلوي القوي وإشارة Fluo-4 في قناة FITC. وينبغي إجراء ضوابط مماثلة والتحقق من صحة أي ناهضات / الخصوم أن غرست في رقاقة لضمان التركيز السليم ونشرها في الخلايا. لتحليل الخلية الواحدة، يجب إعداد الخلايا بصورة تعليق أحادي الخلية لتسهيل فرز الخلايا الفردية إلى أقلام. وعلى غرار المجهر الفلوري التقليدي، ينبغي تحسين أوقات التعرض للفلور ونقاط الوقت المقاسة إلى أقصى حد لكل هدف من أهداف الاهتمام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ر.ب.س. موظف في سيما4. ولا يوجد لدى المؤلفين الآخرين تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

ونحن ممتنون للمناقشات العلمية مع الدكتور بنجامين تشين. تم تمويل هذا العمل من قبل K08AI120806 (THS) وR01DA052255 (THS و KB) وR21AI152833 (THS و KB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Beacon Optofluidic System Berkeley Lights
 Fetal Bovine Serum Gibco
 FIJI Open-source software PMID: 22743772, 22930834
 Fluo-4 Calcium Imaging Kit Thermo Fisher  F10489
 HIV-1 NLCINL4-3 Laboratory of Benjamin Chen PMID: 28148796
 Hyclone Pennecillin Streptomycin solution GE Healthcare Life sciences  SV30010
 MT-4 cells NIH AIDS Reagent  ARP-120
 OptoSelect 3500 chip Berkeley Lights
 Pipettor Tips Denville Scientific  P3020-CPS
 Prism 9.0.0 GraphPad
 RPMI-1640 Medium Sigma-Aldrich  R8758
Serological Pipettes Fisher Brand  13-678-11E
Tissue Culture Hood Various models
T75 flasks Corning 3073

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
  2. Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
  3. Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
  4. Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
  5. Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
  6. Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
  7. Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
  8. Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
  9. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
  10. Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
  11. Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
  12. Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
  13. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  14. He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
  15. Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
  16. Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
  17. Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
  18. Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
  19. Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
  20. Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
  21. Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
  22. Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 171، عالية في جميع أنحاء، optofluidic، التصوير بالخلايا الحية، عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، تدفق الكالسيوم، مستقبلات البورينيرجي
توصيف أحادي الخلية لتدفق الكالسيوم والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 باستخدام منصة متعددة المقاييس Optofluidic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Freeman, T., Andreou, C., Sebra, R.… More

Freeman, T., Andreou, C., Sebra, R. P., Beaumont, K. G., Swartz, T. H. Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform. J. Vis. Exp. (171), e62632, doi:10.3791/62632 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter